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一种消除组培苗黄化的核桃组培快繁方法.pdf

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摘要
申请专利号：

CN201710311958.6

 申请日：

20170505
公开号：

CN107006371A

 公开日：

20170804
当前法律状态：

有效性：

审查中
法律详情：

IPC分类号：

A01H4/00

 主分类号：

A01H4/00
申请人：

广西壮族自治区林业科学研究院
发明人：

陈晓明,韦璐阳,李魁鹏,蔡玲,陈代喜,梁文汇,何振革,程琳,董利军,贺佳君,钟耀才
地址：

530002 广西壮族自治区南宁市西乡塘区邕武路23号
优先权：

CN201710311958A
专利代理机构：

广西南宁汇博专利代理有限公司

 代理人：

卢颖
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内容摘要

本发明公开了一种消除组培苗黄化的核桃组培快繁方法，包括繁殖材料选择、外植体处理、初始芽诱导和增殖培养工序；采集当年生长健壮且无病虫害的核桃嫩枝梢作为繁殖材料，对枝条进行修剪成茎段作为外植体，对外植体灭菌消毒处理后接种于初始芽诱导培养基中诱导初始芽发生，再将初始芽接种于增殖培养基中后得到无黄化现象的组培继代芽。本发明在获得无菌苗的基础上探索核桃组培快繁育苗过程中继代培养时出现失绿黄化，严重影响了核桃组培苗的正常分化和生长，从而导致增殖系数降低的问题提出解决方法，消除核桃组培苗黄化现象，能正常分化和生长，提高繁殖系数，稳定遗传性状，从而使核桃组培苗能达到工厂化育苗的标准。

权利要求书

1.一种消除组培苗黄化的核桃组培快繁方法，其特征在于：包括繁殖材料选择、外植体处理、初始芽诱导和增殖培养工序；采集当年生长健壮且无病虫害的核桃嫩枝梢作为繁殖材料，对枝条进行修剪成茎段作为外植体，对外植体灭菌消毒处理后接种于初始芽诱导培养基中诱导初始芽发生，再将初始芽接种于增殖培养基中后得到无黄化现象的组培继代芽；主要操作步骤如下：（1）繁殖材料选择：选择通过国家级或省级良种审定的核桃良种无性系、树龄5～8年生的为采穗母树；在采穗母树树冠外围的上方采集当年生长健壮且无病虫害的核桃嫩枝梢，作为核桃组培的优良繁殖材料；（2）外植体处理：将采集到的核桃嫩枝梢剪成只保留顶芽或2～3cm长带腋芽的茎段作为外植体，用体积浓度75％乙醇溶液对外植体浸泡灭菌30s，蒸馏水冲洗2次后将外植体置于超净台，再用体积浓度0.1％HgCl溶液以振荡的方式对外植体进行灭菌处理8～10min，最后用无菌水冲洗5次；（3）初始芽诱导：将步骤（2）处理得到的外植体接种于诱导培养基中，并置于温度25±2℃，光照强度2000～3500LX，光照10～14h/d的环境中诱导初始芽发生；（4）增殖培养：将步骤（3）获得的初始芽接种于增殖培养基,并置于温度25±2℃，光照强度2000～3500LX，光照10～14h/d的环境中进行增殖培养，得到无黄化现象的组培继代芽。 2.根据权利要求1所述的一种消除组培苗黄化的核桃组培快繁方法，其特征在于：步骤（2）所述的诱导培养基的原料组分和质量含量为：改良MS+6-BA0.5mg·L+蔗糖30000mg•L+水解乳蛋白300mg•L+表油菜素内酯0.2mg•L+琼脂3000mg•L。 3.根据权利要求1所述的一种消除组培苗黄化的核桃组培快繁方法，其特征在于：步骤（3）所述的增殖培养基的原料组分和质量含量为：改良MS+6-BA1.0～2.0mg·L+蔗糖30000mg•L+水解乳蛋白300～500mg•L+表油菜素内酯0.3～0.5mg•L+琼脂3000mg•L。 4.根据权利要求2或3任一所述的一种消除组培苗黄化的核桃组培快繁方法，其特征在于：所述的改良MS培养基的组成为：KNO1600mg·L；NHNO1200mg·L；CaCl350mg·L；MgSO.7HO370mg·L；Ca(NO).4HO100mg•L；KHPO270mg•L；MnSO.4HO22.3mg•L；ZnSO.7HO10.6mg•L；CuSO.5HO0.025mg•L；HBO8.2mg•L；NaMoO.2HO0.25mg•L；KI0.83mg•L；CoCl.6HO0.025mg•L；Na•EDTA37.3mg•L；FeSO.7HO27.8mg•L；维生素B10.4mg•L；维生素B60.5mg•L；烟酸2.0mg•L；甘氨酸1.0mg•L；肌醇120mg•L。

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，涉及一种消除组培苗黄化的核桃组培快繁方法。

背景技术

核桃(Juglans regia L.)古称胡桃，属胡桃科，胡桃属，原产于欧洲东南部及亚洲西部，我国是核桃原产地之一。由于核桃是重要的坚果和木本油料树种，具有很高的经济价值，位居世界四大干果（核桃、扁桃、腰果、榛子）之首，以其很高的经济、生态及社会效益在世界各地广泛栽培。核桃在长期栽培和人为选择过程中，形成了很多的高产、优质及抗病性良好的优良核桃品种，为了能保持这些品种的优良性状，核桃的后代繁殖主要是采用嫁接和扦插的无性繁殖手段，但采用嫁接繁殖，存在繁殖系数低，速度慢，成活率不稳定，受穗条数量限制等不利因素；采用扦插繁殖方法，由于核桃体内存在有大量单宁抑制物质，扦插不易生根，这样就导致核桃新的优良品种的迅速扩大受到限制。植物组培快繁方法也是当前苗木无性繁殖的主要方法之一，其特点是可使再生植株保持母体遗传稳定性的同时，加快繁殖速度，一年内几颗无菌小芽可以繁育百万株以上的苗木，生产周期大大缩短，可以在较短时间内培育大量优质种苗，并且能建立规模化生产。由于植物组培技术的优越性，中外学者从20世纪60年代末开始对核桃进行组织快繁技术方面的研究并取得了一定的进展，但核桃组培继代培养中的一些关键技术多年都未能得到很好解决，如核桃在继代培养时极易出现失绿黄化，黄化率高达95%以上，严重影响了核桃组培苗的正常分化和生长，从而导致增殖系数大大降低，使得核桃组培苗工厂化育苗一直难以实现。

发明内容

本发明提出了一种克服现有技术中核桃组培快繁育苗过程中继代培养时出现失绿黄化，严重影响了核桃组培苗的正常分化和生长，从而导致增殖系数降低的不足，提出了一种能够消除核桃组培苗黄化现象，能正常分化和生长，提高繁殖系数，稳定遗传性状的消除组培苗黄化的核桃组培快繁方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种消除组培苗黄化的核桃组培快繁方法，包括繁殖材料选择、外植体处理、初始芽诱导和增殖培养工序；采集当年生长健壮且无病虫害的核桃嫩枝梢作为繁殖材料，对枝条进行修剪成茎段作为外植体，对外植体灭菌消毒处理后接种于初始芽诱导培养基中诱导初始芽发生，再将初始芽接种于增殖培养基中后得到无黄化现象的组培继代芽；主要操作步骤如下：

（1）繁殖材料选择：选择通过国家级或省级良种审定的核桃良种无性系、树龄5～8年生的为采穗母树；在采穗母树树冠外围的上方采集当年生长健壮且无病虫害的核桃嫩枝梢，作为核桃组培的优良繁殖材料；

（2）外植体处理：将采集到的核桃嫩枝梢剪成只保留顶芽或2～3cm长带腋芽的茎段作为外植体，用体积浓度75％乙醇溶液对外植体浸泡灭菌30 s，蒸馏水冲洗2次后将外植体置于超净台，再用体积浓度0.1％HgCl2溶液以振荡的方式对外植体进行灭菌处理 8～10 min，最后用无菌水冲洗5次；

（3）初始芽诱导：将步骤（2）处理得到的外植体接种于诱导培养基中，并置于温度25±2℃，光照强度2000～3500LX，光照10～14 h/d的环境中诱导初始芽发生；

（4）增殖培养：将步骤（3）获得的初始芽接种于增殖培养基, 并置于温度25±2℃，光照强度2000～3500LX，光照10～14 h/d的环境中进行增殖培养，得到无黄化现象的组培继代芽。

以上步骤（2）所述的诱导培养基的原料组分和质量含量为：改良MS+6-BA 0.5 mg·L-1+蔗糖30000 mg•L-1+ 水解乳蛋白300 mg•L-1+ 表油菜素内酯0.2 mg•L-1+琼脂3000 mg•L-1。

以上步骤（3）所述的增殖培养基的原料组分和质量含量为：改良MS+6-BA 1.0～2.0 mg·L-1+蔗糖30000 mg•L-1+ 水解乳蛋白300～500 mg•L-1+ 表油菜素内酯0.3～0.5 mg•L-1+琼脂3000 mg•L-1。

以上所述的改良MS培养基的组成为：KNO3 1600 mg·L-1；NH4NO3 1200 mg·L-1；CaCl2 350 mg·L-1；MgSO4.7H2O 370 mg·L-1；Ca(NO3)2. 4 H2O 100 mg•L-1；KH2PO3 270 mg•L-1；MnSO4.4 H2O 22.3 mg•L-1；ZnSO4.7 H2O 10.6 mg•L-1；CuSO4.5 H2O 0.025 mg•L-1；H3BO3 8.2 mg•L-1；Na2MoO4.2 H2O 0.25 mg•L-1；KI 0.83 mg•L-1；CoCl2.6 H2O 0.025 mg•L-1；Na2•EDTA 37.3 mg•L-1；FeSO4.7 H2O 27.8 mg•L-1；维生素B1 0.4 mg•L-1；维生素B6 0.5 mg•L-1；烟酸 2.0 mg•L-1；甘氨酸 1.0 mg•L-1；肌醇 120 mg•L-1。

相对于现有技术，本发明具有的优点及有益效果：

1、本发明改良了传统的MS基本培养基的营养物质的含量和比例，添加了水解乳蛋白和表油菜素内酯两种化学添加物，彻底消除了核桃组培苗在组培过程中出现的黄化现象，使组培苗能正常分化和生长，增殖倍数增加了3～4.5倍，短期内培育大量优质健康的良种苗木，具有良好的经济效益、社会效益和生态效益。

2、本发明在获得无菌苗的的基础上探索核桃组培快繁育苗过程中继代培养时出现失绿黄化，严重影响了核桃组培苗的正常分化和生长，从而导致增殖系数降低的问题提出解决方法，消除核桃组培苗黄化现象，能正常分化和生长，提高繁殖系数，稳定遗传性状，从而使核桃组培苗能达到工厂化育苗的标准。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1：

在连续放晴2天以上的天气，选择树龄5～8年生、通过国家级或省级良种审定的核桃良种无性系作为采穗母树；在采穗母树树冠外围的上方采集当年生长健壮且无病虫害的核桃嫩枝梢，作为核桃组培的优良繁殖材料。

将采集到的核桃嫩枝梢剪成只保留顶芽或2～3cm长带腋芽的茎段作为外植体，用体积浓度75％乙醇溶液对外植体浸泡灭菌30 s，蒸馏水冲洗2次后将外植体置于超净台，再用体积浓度0.1％HgCl2溶液以振荡的方式对外植体进行灭菌处理 8～10 min，最后用无菌水冲洗5次。

将消毒灭菌处理得到的外植体接种于诱导培养基中，并置于温度25±2℃，光照强度2000～2500LX，光照14 h/d的环境中诱导初始芽发生。所述的诱导培养基的原料组分和质量含量为：改良MS+6-BA 0.5 mg·L-1+蔗糖30000 mg•L-1+ 水解乳蛋白300 mg•L-1+ 表油菜素内酯0.2 mg•L-1+琼脂3000 mg•L-1。

培养8 d后腋芽开始萌动，培养35 d芽长高3～5 cm时，将芽从原茎段上切下，接种于增殖培养基, 增殖培养基的原料组分和质量含量为：改良MS+6-BA 1.0～2.0 mg·L-1+蔗糖30000 mg•L-1+ 水解乳蛋白300 mg•L-1+ 表油菜素内酯0.3 mg•L-1+琼脂3000 mg•L-1，并置于温度25±2℃，光照强度2000～2500LX，光照14 h/d的环境中进行增殖培养，促进培养物的腋芽和侧芽萌发。约35d转接一次，培养35 d，平均芽高达4.2 cm，苗木叶色浓绿无黄化，增殖系数3.8。

以上所述的改良MS培养基的组成为：KNO3 1600 mg·L-1；NH4NO3 1200 mg·L-1；CaCl2 350 mg·L-1；MgSO4.7H2O 370 mg·L-1；Ca(NO3)2. 4 H2O 100 mg•L-1；KH2PO3 270 mg•L-1；MnSO4.4 H2O 22.3 mg•L-1；ZnSO4.7 H2O 10.6 mg•L-1；CuSO4.5 H2O 0.025 mg•L-1；H3BO3 8.2 mg•L-1；Na2MoO4.2 H2O 0.25 mg•L-1；KI 0.83 mg•L-1；CoCl2.6 H2O 0.025 mg•L-1；Na2•EDTA 37.3 mg•L-1；FeSO4.7 H2O 27.8 mg•L-1；维生素B1 0.4 mg•L-1；维生素B6 0.5 mg•L-1；烟酸 2.0 mg•L-1；甘氨酸 1.0 mg•L-1；肌醇 120 mg•L-1。

实施例2：

在连续放晴2天以上的天气，选择树龄5～8年生、通过国家级或省级良种审定的核桃良种无性系作为采穗母树；在采穗母树树冠外围的上方采集当年生长健壮且无病虫害的核桃嫩枝梢，作为核桃组培的优良繁殖材料。

将采集到的核桃嫩枝梢剪成2～3cm长带腋芽的茎段作为外植体，用体积浓度75％乙醇溶液对外植体浸泡灭菌30 s，蒸馏水冲洗2次后将外植体置于超净台，再用体积浓度0.1％HgCl2溶液以振荡的方式对外植体进行灭菌处理 8～10 min，最后用无菌水冲洗5次。

将消毒灭菌处理得到的外植体接种于诱导培养基中，并置于温度25±2℃，光照强度2500～3000LX，光照12 h/d的环境中诱导初始芽发生。所述的诱导培养基的原料组分和质量含量为：改良MS+6-BA 0.5 mg·L-1+蔗糖30000 mg•L-1+ 水解乳蛋白300 mg•L-1+ 表油菜素内酯0.2 mg•L-1+琼脂3000 mg•L-1。

培养8 d后腋芽开始萌动，培养35 d芽长高3～5 cm时，将芽从原茎段上切下，接种于增殖培养基, 增殖培养基的原料组分和质量含量为：改良MS+6-BA 1.5 mg·L-1+蔗糖30000 mg•L-1+ 水解乳蛋白400 mg•L-1+ 表油菜素内酯0.4 mg•L-1+琼脂3000 mg•L-1，并置于温度25±2℃，光照强度2500～3000LX，光照12 h/d的环境中进行增殖培养，促进培养物的腋芽和侧芽萌发。约35d转接一次，培养35 d，平均芽高达3.8 cm，苗木叶色浓绿无黄化，增殖系数4.5。

以上所述的改良MS培养基的组成为：KNO3 1600 mg·L-1；NH4NO3 1200 mg·L-1；CaCl2 350 mg·L-1；MgSO4.7H2O 370 mg·L-1；Ca(NO3)2. 4 H2O 100 mg•L-1；KH2PO3 270 mg•L-1；MnSO4.4 H2O 22.3 mg•L-1；ZnSO4.7 H2O 10.6 mg•L-1；CuSO4.5 H2O 0.025 mg•L-1；H3BO3 8.2 mg•L-1；Na2MoO4.2 H2O 0.25 mg•L-1；KI 0.83 mg•L-1；CoCl2.6 H2O 0.025 mg•L-1；Na2•EDTA 37.3 mg•L-1；FeSO4.7 H2O 27.8 mg•L-1；维生素B1 0.4 mg•L-1；维生素B6 0.5 mg•L-1；烟酸 2.0 mg•L-1；甘氨酸 1.0 mg•L-1；肌醇 120 mg•L-1。

实施例3：

在连续放晴2天以上的天气，选择树龄5～8年生、通过国家级或省级良种审定的核桃良种无性系作为采穗母树；在采穗母树树冠外围的上方采集当年生长健壮且无病虫害的核桃嫩枝梢，作为核桃组培的优良繁殖材料。

将采集到的核桃嫩枝梢剪成2～3cm长带腋芽的茎段作为外植体，用体积浓度75％乙醇溶液对外植体浸泡灭菌30 s，蒸馏水冲洗2次后将外植体置于超净台，再用体积浓度0.1％HgCl2溶液以振荡的方式对外植体进行灭菌处理 8～10 min，最后用无菌水冲洗5次。

将消毒灭菌处理得到的外植体接种于诱导培养基中，并置于温度25±2℃，光照强度3000～3500LX，光照10 h/d的环境中诱导初始芽发生。所述的诱导培养基的原料组分和质量含量为：改良MS+6-BA 0.5 mg·L-1+蔗糖30000 mg•L-1+ 水解乳蛋白300 mg•L-1+ 表油菜素内酯0.2 mg•L-1+琼脂3000 mg•L-1。

培养8 d后腋芽开始萌动，培养35 d芽长高3～5 cm时，将芽从原茎段上切下，接种于增殖培养基, 增殖培养基的原料组分和质量含量为：改良MS+6-BA 2.0 mg·L-1+蔗糖30000 mg•L-1+ 水解乳蛋白500 mg•L-1+ 表油菜素内酯0.5 mg•L-1+琼脂3000 mg•L-1，并置于温度25±2℃，光照强度3000～3500LX，光照10 h/d的环境中进行增殖培养，促进培养物的腋芽和侧芽萌发。约35d转接一次，培养35 d，平均芽高达4.1 cm，苗木叶色浓绿无黄化，增殖系数4.3。

以上所述的改良MS培养基的组成为：KNO3 1600 mg·L-1；NH4NO3 1200 mg·L-1；CaCl2 350 mg·L-1；MgSO4.7H2O 370 mg·L-1；Ca(NO3)2. 4 H2O 100 mg•L-1；KH2PO3 270 mg•L-1；MnSO4.4 H2O 22.3 mg•L-1；ZnSO4.7 H2O 10.6 mg•L-1；CuSO4.5 H2O 0.025 mg•L-1；H3BO3 8.2 mg•L-1；Na2MoO4.2 H2O 0.25 mg•L-1；KI 0.83 mg•L-1；CoCl2.6 H2O 0.025 mg•L-1；Na2•EDTA 37.3 mg•L-1；FeSO4.7 H2O 27.8 mg•L-1；维生素B1 0.4 mg•L-1；维生素B6 0.5 mg•L-1；烟酸 2.0 mg•L-1；甘氨酸 1.0 mg•L-1；肌醇 120 mg•L-1。

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710311958.6 (22)申请日 2017.05.05 (71)申请人 广西壮族自治区林业科学研究院 地址 530002 广西壮族自治区南宁市西乡 塘区邕武路23号 (72)发明人 陈晓明 韦璐阳 李魁鹏 蔡玲 陈代喜 梁文汇 何振革 程琳 董利军 贺佳君 钟耀才 (74)专利代理机构 广西南宁汇博专利代理有限 公司 45114 代理人 卢颖 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (54)发明名称 一种消除组培苗黄化的核桃组培快繁方法 (57)。

2、摘要 本发明公开了一种消除组培苗黄化的核桃 组培快繁方法， 包括繁殖材料选择、 外植体处理、 初始芽诱导和增殖培养工序； 采集当年生长健壮 且无病虫害的核桃嫩枝梢作为繁殖材料， 对枝条 进行修剪成茎段作为外植体， 对外植体灭菌消毒 处理后接种于初始芽诱导培养基中诱导初始芽 发生， 再将初始芽接种于增殖培养基中后得到无 黄化现象的组培继代芽。 本发明在获得无菌苗的 基础上探索核桃组培快繁育苗过程中继代培养 时出现失绿黄化， 严重影响了核桃组培苗的正常 分化和生长， 从而导致增殖系数降低的问题提出 解决方法， 消除核桃组培苗黄化现象， 能正常分 化和生长， 提高繁殖系数， 稳定遗传性状， 从而使 。

3、核桃组培苗能达到工厂化育苗的标准。 权利要求书1页 说明书4页 CN 107006371 A 2017.08.04 CN 107006371 A 1.一种消除组培苗黄化的核桃组培快繁方法， 其特征在于： 包括繁殖材料选择、 外植体 处理、 初始芽诱导和增殖培养工序； 采集当年生长健壮且无病虫害的核桃嫩枝梢作为繁殖 材料， 对枝条进行修剪成茎段作为外植体， 对外植体灭菌消毒处理后接种于初始芽诱导培 养基中诱导初始芽发生， 再将初始芽接种于增殖培养基中后得到无黄化现象的组培继代 芽； 主要操作步骤如下： （1） 繁殖材料选择： 选择通过国家级或省级良种审定的核桃良种无性系、 树龄58年生 的为采穗。

4、母树； 在采穗母树树冠外围的上方采集当年生长健壮且无病虫害的核桃嫩枝梢， 作为核桃组培的优良繁殖材料； （2） 外植体处理： 将采集到的核桃嫩枝梢剪成只保留顶芽或23cm长带腋芽的茎段作 为外植体， 用体积浓度75乙醇溶液对外植体浸泡灭菌30 s， 蒸馏水冲洗2次后将外植体置 于超净台， 再用体积浓度0.1HgCl2溶液以振荡的方式对外植体进行灭菌处理 810 min， 最后用无菌水冲洗5次； （3） 初始芽诱导： 将步骤 （2） 处理得到的外植体接种于诱导培养基中， 并置于温度252 ， 光照强度20003500LX， 光照1014 h/d的环境中诱导初始芽发生； （4） 增殖培养： 将步骤。

5、 （3） 获得的初始芽接种于增殖培养基, 并置于温度252， 光照 强度20003500LX， 光照1014 h/d的环境中进行增殖培养， 得到无黄化现象的组培继代 芽。 2.根据权利要求1所述的一种消除组培苗黄化的核桃组培快繁方法， 其特征在于： 步骤 （2） 所述的诱导培养基的原料组分和质量含量为： 改良MS+6-BA 0.5 mgL-1+蔗糖30000 mgL-1+ 水解乳蛋白300 mgL-1+ 表油菜素内酯0.2 mgL-1+琼脂3000 mgL-1。 3.根据权利要求1所述的一种消除组培苗黄化的核桃组培快繁方法， 其特征在于： 步骤 （3） 所述的增殖培养基的原料组分和质量含量为：。

6、 改良MS+6-BA 1.02.0 mgL-1+蔗糖 30000 mgL-1+ 水解乳蛋白300500 mgL-1+ 表油菜素内酯0.30.5 mgL-1+琼脂3000 mgL-1。 4.根据权利要求2或3任一所述的一种消除组培苗黄化的核桃组培快繁方法， 其特征在 于： 所述的改良MS培养基的组成为： KNO3 1600 mgL-1； NH4NO3 1200 mgL-1； CaCl2 350 mgL-1； MgSO4.7H2O 370 mgL-1； Ca(NO3)2. 4 H2O 100 mgL-1； KH2PO3 270 mgL-1； MnSO4.4 H2O 22.3 mgL-1； ZnSO。

7、4.7 H2O 10.6 mgL-1； CuSO4.5 H2O 0.025 mgL-1； H3BO3 8.2 mgL-1； Na2MoO4.2 H2O 0.25 mgL-1； KI 0.83 mgL-1； CoCl2.6 H2O 0.025 mgL-1； Na2EDTA 37.3 mgL-1； FeSO4.7 H2O 27.8 mgL-1； 维生素B1 0.4 mgL-1； 维生素B6 0.5 mgL-1； 烟酸 2.0 mgL-1； 甘氨酸1.0 mgL-1； 肌醇 120 mgL-1。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107006371 A 2 一种消除组培苗黄化的核桃组培快繁方。

8、法 技术领域 0001 本发明属于植物组织培养技术领域， 涉及一种消除组培苗黄化的核桃组培快繁方 法。 背景技术 0002 核桃(Juglans regia L.)古称胡桃， 属胡桃科， 胡桃属， 原产于欧洲东南部及亚洲 西部， 我国是核桃原产地之一。 由于核桃是重要的坚果和木本油料树种， 具有很高的经济价 值， 位居世界四大干果 （核桃、 扁桃、 腰果、 榛子） 之首， 以其很高的经济、 生态及社会效益在 世界各地广泛栽培。 核桃在长期栽培和人为选择过程中， 形成了很多的高产、 优质及抗病性 良好的优良核桃品种， 为了能保持这些品种的优良性状， 核桃的后代繁殖主要是采用嫁接 和扦插的无性繁殖。

9、手段， 但采用嫁接繁殖， 存在繁殖系数低， 速度慢， 成活率不稳定， 受穗条 数量限制等不利因素； 采用扦插繁殖方法， 由于核桃体内存在有大量单宁抑制物质， 扦插不 易生根， 这样就导致核桃新的优良品种的迅速扩大受到限制。 植物组培快繁方法也是当前 苗木无性繁殖的主要方法之一， 其特点是可使再生植株保持母体遗传稳定性的同时， 加快 繁殖速度， 一年内几颗无菌小芽可以繁育百万株以上的苗木， 生产周期大大缩短， 可以在较 短时间内培育大量优质种苗， 并且能建立规模化生产。 由于植物组培技术的优越性， 中外学 者从20世纪60年代末开始对核桃进行组织快繁技术方面的研究并取得了一定的进展， 但核 桃组。

10、培继代培养中的一些关键技术多年都未能得到很好解决， 如核桃在继代培养时极易出 现失绿黄化， 黄化率高达95%以上， 严重影响了核桃组培苗的正常分化和生长， 从而导致增 殖系数大大降低， 使得核桃组培苗工厂化育苗一直难以实现。 发明内容 0003 本发明提出了一种克服现有技术中核桃组培快繁育苗过程中继代培养时出现失 绿黄化， 严重影响了核桃组培苗的正常分化和生长， 从而导致增殖系数降低的不足， 提出了 一种能够消除核桃组培苗黄化现象， 能正常分化和生长， 提高繁殖系数， 稳定遗传性状的消 除组培苗黄化的核桃组培快繁方法。 0004 为了实现上述目的， 本发明的技术方案如下： 一种消除组培苗黄化的。

11、核桃组培快繁方法， 包括繁殖材料选择、 外植体处理、 初始芽诱 导和增殖培养工序； 采集当年生长健壮且无病虫害的核桃嫩枝梢作为繁殖材料， 对枝条进 行修剪成茎段作为外植体， 对外植体灭菌消毒处理后接种于初始芽诱导培养基中诱导初始 芽发生， 再将初始芽接种于增殖培养基中后得到无黄化现象的组培继代芽； 主要操作步骤 如下： （1） 繁殖材料选择： 选择通过国家级或省级良种审定的核桃良种无性系、 树龄58年生 的为采穗母树； 在采穗母树树冠外围的上方采集当年生长健壮且无病虫害的核桃嫩枝梢， 作为核桃组培的优良繁殖材料； （2） 外植体处理： 将采集到的核桃嫩枝梢剪成只保留顶芽或23cm长带腋芽的茎段。

12、作 说 明 书 1/4 页 3 CN 107006371 A 3 为外植体， 用体积浓度75乙醇溶液对外植体浸泡灭菌30 s， 蒸馏水冲洗2次后将外植体置 于超净台， 再用体积浓度0.1HgCl2溶液以振荡的方式对外植体进行灭菌处理 810 min， 最后用无菌水冲洗5次； （3） 初始芽诱导： 将步骤 （2） 处理得到的外植体接种于诱导培养基中， 并置于温度252 ， 光照强度20003500LX， 光照1014 h/d的环境中诱导初始芽发生； （4） 增殖培养： 将步骤 （3） 获得的初始芽接种于增殖培养基, 并置于温度252， 光照 强度20003500LX， 光照1014 h/d的环境。

13、中进行增殖培养， 得到无黄化现象的组培继代 芽。 0005 以上步骤 （2） 所述的诱导培养基的原料组分和质量含量为： 改良MS+6-BA 0.5 mgL-1+蔗糖30000 mgL-1+ 水解乳蛋白300 mgL-1+ 表油菜素内酯0.2 mgL-1+琼脂3000 mgL-1。 0006 以上步骤 （3） 所述的增殖培养基的原料组分和质量含量为： 改良MS+6-BA 1.0 2.0 mgL-1+蔗糖30000 mgL-1+ 水解乳蛋白300500 mgL-1+ 表油菜素内酯0.30.5 mgL-1+琼脂3000 mgL-1。 0007 以上所述的改良MS培养基的组成为： KNO3 1600 。

14、mgL-1； NH4NO3 1200 mgL-1； CaCl2 350 mgL-1； MgSO4.7H2O 370 mgL-1； Ca(NO3)2. 4 H2O 100 mgL-1； KH2PO3 270 mg L-1； MnSO4.4 H2O 22.3 mgL-1； ZnSO4.7 H2O 10.6 mgL-1； CuSO4.5 H2O 0.025 mgL-1； H3BO3 8.2 mgL-1； Na2MoO4.2 H2O 0.25 mgL-1； KI 0.83 mgL-1； CoCl2.6 H2O 0.025 mgL-1； Na2 EDTA 37.3 mgL-1； FeSO4.7 H2O 。

15、27.8 mgL-1； 维生素B1 0.4 mgL-1； 维生素B6 0.5 mgL -1； 烟酸 2.0 mgL-1； 甘氨酸 1.0 mgL-1； 肌醇 120 mgL-1。 0008 相对于现有技术， 本发明具有的优点及有益效果： 1、 本发明改良了传统的MS基本培养基的营养物质的含量和比例， 添加了水解乳蛋白和 表油菜素内酯两种化学添加物， 彻底消除了核桃组培苗在组培过程中出现的黄化现象， 使 组培苗能正常分化和生长， 增殖倍数增加了34.5倍， 短期内培育大量优质健康的良种苗 木， 具有良好的经济效益、 社会效益和生态效益。 0009 2、 本发明在获得无菌苗的的基础上探索核桃组培快。

16、繁育苗过程中继代培养时出 现失绿黄化， 严重影响了核桃组培苗的正常分化和生长， 从而导致增殖系数降低的问题提 出解决方法， 消除核桃组培苗黄化现象， 能正常分化和生长， 提高繁殖系数， 稳定遗传性状， 从而使核桃组培苗能达到工厂化育苗的标准。 具体实施方式 0010 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。 0011 实施例1： 在连续放晴2天以上的天气， 选择树龄58年生、 通过国家级或省级良种审定的核桃良 种无性系作为采穗母树； 在采穗母树树冠外围的上方采集当年生长健壮且无病虫害的核桃 嫩枝梢， 作为核桃组培的优良繁殖材料。 0012 将采集到的核桃嫩枝梢剪成只保留顶芽或23cm长带腋芽的。

17、茎段作为外植体， 用 体积浓度75乙醇溶液对外植体浸泡灭菌30 s， 蒸馏水冲洗2次后将外植体置于超净台， 再 用体积浓度0.1HgCl2溶液以振荡的方式对外植体进行灭菌处理 810 min， 最后用无菌 说 明 书 2/4 页 4 CN 107006371 A 4 水冲洗5次。 0013 将消毒灭菌处理得到的外植体接种于诱导培养基中， 并置于温度252， 光照强 度20002500LX， 光照14 h/d的环境中诱导初始芽发生。 所述的诱导培养基的原料组分和 质量含量为： 改良MS+6-BA 0.5 mgL-1+蔗糖30000 mgL-1+ 水解乳蛋白300 mgL-1+ 表油 菜素内酯0.。

18、2 mgL-1+琼脂3000 mgL-1。 0014 培养8 d后腋芽开始萌动， 培养35 d芽长高35 cm时， 将芽从原茎段上切下， 接种 于增殖培养基, 增殖培养基的原料组分和质量含量为： 改良MS+6-BA 1.02.0 mgL-1+蔗 糖30000 mgL-1+ 水解乳蛋白300 mgL-1+ 表油菜素内酯0.3 mgL-1+琼脂3000 mgL-1， 并 置于温度252， 光照强度20002500LX， 光照14 h/d的环境中进行增殖培养， 促进培养 物的腋芽和侧芽萌发。 约35d转接一次， 培养35 d， 平均芽高达4.2 cm， 苗木叶色浓绿无黄 化， 增殖系数3.8。 00。

19、15 以上所述的改良MS培养基的组成为： KNO3 1600 mgL-1； NH4NO3 1200 mgL-1； CaCl2 350 mgL-1； MgSO4.7H2O 370 mgL-1； Ca(NO3)2. 4 H2O 100 mgL-1； KH2PO3 270 mg L-1； MnSO4.4 H2O 22.3 mgL-1； ZnSO4.7 H2O 10.6 mgL-1； CuSO4.5 H2O 0.025 mgL-1； H3BO3 8.2 mgL-1； Na2MoO4.2 H2O 0.25 mgL-1； KI 0.83 mgL-1； CoCl2.6 H2O 0.025 mgL-1； Na。

20、2 EDTA 37.3 mgL-1； FeSO4.7 H2O 27.8 mgL-1； 维生素B1 0.4 mgL-1； 维生素B6 0.5 mgL -1； 烟酸 2.0 mgL-1； 甘氨酸 1.0 mgL-1； 肌醇 120 mgL-1。 0016 实施例2： 在连续放晴2天以上的天气， 选择树龄58年生、 通过国家级或省级良种审定的核桃良 种无性系作为采穗母树； 在采穗母树树冠外围的上方采集当年生长健壮且无病虫害的核桃 嫩枝梢， 作为核桃组培的优良繁殖材料。 0017 将采集到的核桃嫩枝梢剪成23cm长带腋芽的茎段作为外植体， 用体积浓度75 乙醇溶液对外植体浸泡灭菌30 s， 蒸馏水冲洗。

21、2次后将外植体置于超净台， 再用体积浓度 0.1HgCl2溶液以振荡的方式对外植体进行灭菌处理 810 min， 最后用无菌水冲洗5次。 0018 将消毒灭菌处理得到的外植体接种于诱导培养基中， 并置于温度252， 光照强 度25003000LX， 光照12 h/d的环境中诱导初始芽发生。 所述的诱导培养基的原料组分和 质量含量为： 改良MS+6-BA 0.5 mgL-1+蔗糖30000 mgL-1+ 水解乳蛋白300 mgL-1+ 表油 菜素内酯0.2 mgL-1+琼脂3000 mgL-1。 0019 培养8 d后腋芽开始萌动， 培养35 d芽长高35 cm时， 将芽从原茎段上切下， 接种 。

22、于增殖培养基, 增殖培养基的原料组分和质量含量为： 改良MS+6-BA 1.5 mgL-1+蔗糖 30000 mgL-1+ 水解乳蛋白400 mgL-1+ 表油菜素内酯0.4 mgL-1+琼脂3000 mgL-1， 并置 于温度252， 光照强度25003000LX， 光照12 h/d的环境中进行增殖培养， 促进培养物 的腋芽和侧芽萌发。 约35d转接一次， 培养35 d， 平均芽高达3.8 cm， 苗木叶色浓绿无黄化， 增殖系数4.5。 0020 以上所述的改良MS培养基的组成为： KNO3 1600 mgL-1； NH4NO3 1200 mgL-1； CaCl2 350 mgL-1； Mg。

23、SO4.7H2O 370 mgL-1； Ca(NO3)2. 4 H2O 100 mgL-1； KH2PO3 270 mg L-1； MnSO4.4 H2O 22.3 mgL-1； ZnSO4.7 H2O 10.6 mgL-1； CuSO4.5 H2O 0.025 mgL-1； H3BO3 8.2 mgL-1； Na2MoO4.2 H2O 0.25 mgL-1； KI 0.83 mgL-1； CoCl2.6 H2O 0.025 mgL-1； Na2 EDTA 37.3 mgL-1； FeSO4.7 H2O 27.8 mgL-1； 维生素B1 0.4 mgL-1； 维生素B6 0.5 mgL 说 。

24、明 书 3/4 页 5 CN 107006371 A 5 -1； 烟酸 2.0 mgL-1； 甘氨酸 1.0 mgL-1； 肌醇 120 mgL-1。 0021 实施例3： 在连续放晴2天以上的天气， 选择树龄58年生、 通过国家级或省级良种审定的核桃良 种无性系作为采穗母树； 在采穗母树树冠外围的上方采集当年生长健壮且无病虫害的核桃 嫩枝梢， 作为核桃组培的优良繁殖材料。 0022 将采集到的核桃嫩枝梢剪成23cm长带腋芽的茎段作为外植体， 用体积浓度75 乙醇溶液对外植体浸泡灭菌30 s， 蒸馏水冲洗2次后将外植体置于超净台， 再用体积浓度 0.1HgCl2溶液以振荡的方式对外植体进行灭菌。

25、处理 810 min， 最后用无菌水冲洗5次。 0023 将消毒灭菌处理得到的外植体接种于诱导培养基中， 并置于温度252， 光照强 度30003500LX， 光照10 h/d的环境中诱导初始芽发生。 所述的诱导培养基的原料组分和 质量含量为： 改良MS+6-BA 0.5 mgL-1+蔗糖30000 mgL-1+ 水解乳蛋白300 mgL-1+ 表油 菜素内酯0.2 mgL-1+琼脂3000 mgL-1。 0024 培养8 d后腋芽开始萌动， 培养35 d芽长高35 cm时， 将芽从原茎段上切下， 接种 于增殖培养基, 增殖培养基的原料组分和质量含量为： 改良MS+6-BA 2.0 mgL-1。

26、+蔗糖 30000 mgL-1+ 水解乳蛋白500 mgL-1+ 表油菜素内酯0.5 mgL-1+琼脂3000 mgL-1， 并置 于温度252， 光照强度30003500LX， 光照10 h/d的环境中进行增殖培养， 促进培养物 的腋芽和侧芽萌发。 约35d转接一次， 培养35 d， 平均芽高达4.1 cm， 苗木叶色浓绿无黄化， 增殖系数4.3。 0025 以上所述的改良MS培养基的组成为： KNO3 1600 mgL-1； NH4NO3 1200 mgL-1； CaCl2 350 mgL-1； MgSO4.7H2O 370 mgL-1； Ca(NO3)2. 4 H2O 100 mgL-1。

27、； KH2PO3 270 mg L-1； MnSO4.4 H2O 22.3 mgL-1； ZnSO4.7 H2O 10.6 mgL-1； CuSO4.5 H2O 0.025 mgL-1； H3BO3 8.2 mgL-1； Na2MoO4.2 H2O 0.25 mgL-1； KI 0.83 mgL-1； CoCl2.6 H2O 0.025 mgL-1； Na2 EDTA 37.3 mgL-1； FeSO4.7 H2O 27.8 mgL-1； 维生素B1 0.4 mgL-1； 维生素B6 0.5 mgL -1； 烟酸 2.0 mgL-1； 甘氨酸 1.0 mgL-1； 肌醇 120 mgL-1。 说 明 书 4/4 页 6 CN 107006371 A 6 。

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