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1、10申请公布号CN104212912A43申请公布日20141217CN104212912A21申请号201410142794522申请日20140410C12Q1/70200601C12Q1/68200601C12N15/11200601C12R1/9320060171申请人中国农业科学院上海兽医研究所地址200241上海市闵行区紫月路518号72发明人李泽君李国新74专利代理机构上海序伦律师事务所31276代理人周东萍54发明名称鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒及其应用57摘要本发明公开一种鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒，该试剂盒包含针对鸭坦布苏病毒强毒株SEQIDN。
2、O1序列设计的上游引物P1，该P1的3末端倒数第一个碱基与SEQIDNO1第1454位碱基相同，其3末端倒数第二个碱基与SEQIDNO1第1453位碱基相同；针对鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株SEQIDNO2序列设计的上游引物P2，该P2的3末端倒数第二个碱基与SEQIDNO2第1891位碱基相同；针对SEQIDNO1或SEQIDNO2序列第197110991位核苷酸序列设计的通用下游引物P3。本发明的试剂盒，可快速、简便、准确地区分鸭坦布苏病毒自然感染强毒和弱毒疫苗免疫毒株，其特异性强、灵敏度高、重复性好，对于鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株的临床广泛应用具有重要意义。51INTCL权利要求书2页说明书7页序。
3、列表12页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书7页序列表12页附图2页10申请公布号CN104212912ACN104212912A1/2页21一种鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含针对鸭坦布苏病毒强毒株SEQIDNO1所示基因序列设计的特异性上游引物P1，该上游引物P1的3末端倒数第一个碱基与SEQIDNO1第1454位碱基相同，该P1的3末端倒数第二个碱基与SEQIDNO1第1453位碱基相同；针对鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株SEQIDNO2所示基因序列设计的特异性上游引物P2，该上游引物P2的3末端倒数第二个碱基与SE。
4、QIDNO2第1891位碱基相同；针对所述SEQIDNO1或SEQIDNO2序列第197110991位核苷酸序列设计的通用下游引物P3。2一种鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含针对鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株SEQIDNO2所示基因序列设计的特异性上游引物P1，该上游引物P1的3末端倒数第一个碱基与SEQIDNO2第1454位碱基相同，该P1的3末端倒数第二个碱基与SEQIDNO2第1453位碱基相同；针对鸭坦布苏病毒强毒株SEQIDNO1所示基因序列设计的特异性上游引物P2，该上游引物P2的3末端倒数第二个碱基与SEQIDNO1第1891位碱基相同；针对所述SE。
5、QIDNO1或SEQIDNO2序列第197110991位核苷酸序列设计的通用下游引物P3。3根据权利要求1或2所述的鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒，其特征在于，所述上游引物P2的3末端倒数第一个碱基为人工引入的错配碱基，该错配碱基与鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的基因序列均不互补。4根据权利要求3所述的鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒，其特征在于，所述上游引物P1的序列如SEQIDNO3所示，上游引物P2的序列如SEQIDNO4所示，下游引物P3的序列如SEQIDNO5所示。5根据权利要求3所述的鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒，其特征在于，所述上游引物P1的序。
6、列如SEQIDNO6所示，上游引物P2的序列如SEQIDNO7所示，下游引物P3的序列如SEQIDNO5所示。6根据权利要求4或5所述的鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测样品时的PCR退火温度为5459。7一种检测鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的引物，其特征在于，包括以下引物针对鸭坦布苏病毒强毒株SEQIDNO1所示基因序列设计的特异性上游引物P1，该上游引物P1的3末端倒数第一个碱基与SEQIDNO1第1454位碱基相同，该P1的3末端倒数第二个碱基与SEQIDNO1第1453位碱基相同；针对鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株SEQIDNO2所示基因序列设计的特异。
7、性上游引物P2，该上游引物P2的3末端倒数第二个碱基与SEQIDNO2第1891位碱基相同；针对所述SEQIDNO1或SEQIDNO2序列第197110991位核苷酸序列设计的通用下游引物P3。8一种检测鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的引物，其特征在于，包括以下引物针对鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株SEQIDNO2所示基因序列设计的特异性上游引物P1，权利要求书CN104212912A2/2页3该上游引物P1的3末端倒数第一个碱基与SEQIDNO2第1454位碱基相同，该P1的3末端倒数第二个碱基与SEQIDNO2第1453位碱基相同；针对鸭坦布苏病毒强毒株SEQIDNO1所示基因序列设计的特异性上游。
8、引物P2，该上游引物P2的3末端倒数第二个碱基与SEQIDNO1第1891位碱基相同；针对所述SEQIDNO1或SEQIDNO2序列第197110991位核苷酸序列设计的通用下游引物P3。9权利要求1或2所述的鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒在制备区分鸭坦布苏病毒自然感染强毒株和弱毒疫苗株的产品中的应用。10权利要求1或2所述的鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒在制备快速鉴定鸭坦布苏病毒的产品中的应用。权利要求书CN104212912A1/7页4鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒及其应用技术领域0001本发明涉及鸭坦布苏病毒检测技术领域，具体涉及一种鉴别鸭坦布苏病毒强。
9、毒株和弱毒疫苗株的试剂盒及其应用。背景技术00022010年4月以来，我国上海、浙江、江苏等地发生了以肉鸭生长迟缓和蛋鸭产蛋急剧下降为特征的一种传染病，短短几个月时间里，南方各省几乎所有的蛋鸭场都受到了该病的侵袭，给养鸭业造成了巨大的经济损失。国内的研究者通过病毒分离鉴定，病毒基因组序列分析，动物回归试验等实验证明该传染病是由一种新的黄病毒鸭坦布苏病毒DUCKTEMBUSUVIRUS，DTMUV所引起，该病毒属于黄病毒属NTAYA病毒群。鸭感染该病毒后，主要的临床症状表现为高热、沉郁、厌食等；蛋鸭出现产蛋量急剧下降甚至停止，肉鸭出现生长迟缓，其主要病变为，脾脏肿大明显，产蛋鸭卵泡出血、变性、破。
10、裂。鸭坦布苏病毒病自2010年在华东部分地区首次发生后，迅速传播到浙江、安徽、福建、江苏等省份的主要水禽养殖场，之后传播到广东、山东、河南、河北等省市，到目前为止全国大部分主要水禽养殖地区均已受到该病的威胁。0003鸭坦布苏病毒病在中国大陆首次发生，该病具有高度传染性，并且一年四季都可流行，给鸭坦布苏病毒病的防控带来了极大的困难。鸭坦布苏病毒是新发病毒，对于该病毒的流行性病学、致病机理、传播媒介等方面的相关研究较少，对该病的防控难度较大，目前预防该病最有效的方法是疫苗免疫。在之前的研究中，本实验室将一株鸭坦布苏病毒分离株在鸡胚成纤维细胞上连续传代培养并克隆纯化，获得了致病力减弱的毒株，雏鸭感染。
11、试验表明，随着传代次数的增加，病毒的致病力逐渐降低，其中，传代培养的第180代病毒FX2010180P株对鸭不致病，并且具有很好的免疫原性，可以作为鸭坦布苏病毒病活疫苗的候选毒株，与强毒株FX2010相比，鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株FX2010180P株有34个核苷酸发生突变，上述内容已在中国专利申请CN2012102792326中公开。鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株FX2010180P株作为鸭坦布苏病毒活疫苗，已经申请临床试验。在该鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株FX2010180P株生产和临床应用时，建立一种能够区分鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株FX2010180P株与临床上流行强毒株的方法是急需的。目前，区分鸭坦布苏。
12、病毒强、弱毒株的方法只能通过序列分析来实现。序列分析首先要分别扩增出强、弱毒株特征性的基因片段，然后通过克隆技术把目的片段连接到载体上，获得含有目的片段的质粒，然后进行测序分析；或者回收纯化扩增产物，然后再进行测序分析。但是，序列分析方法繁琐、费时，不利于实现对鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的及时、快速鉴别诊断。发明内容0004本发明要解决目前还不能快速、高效地鉴别诊断鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的技术问题，提供一种鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒，该试剂盒可快速、简便、准确地区分鸭坦布苏病毒自然感染强毒和弱毒疫苗免疫毒株，其特异性强、灵敏说明书CN104212912A2/7页5度。
13、高、重复性好。0005为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现0006在本发明的一个方面，提供了一种鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒，所述试剂盒包含0007针对鸭坦布苏病毒强毒株SEQIDNO1所示基因序列设计的特异性上游引物P1，该上游引物P1的3末端倒数第一个碱基与SEQIDNO1第1454位碱基相同，该P1的3末端倒数第二个碱基与SEQIDNO1第1453位碱基相同；0008针对鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株SEQIDNO2所示基因序列设计的特异性上游引物P2，该上游引物P2的3末端倒数第二个碱基与SEQIDNO2第1891位碱基相同；0009针对所述SEQIDNO1或SEQI。
14、DNO2序列第197110991位核苷酸序列设计的通用下游引物P3。0010在本发明的另一方面，还提供了一种鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒，所述试剂盒包含0011针对鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株SEQIDNO2所示基因序列设计的特异性上游引物P1，该上游引物P1的3末端倒数第一个碱基与SEQIDNO2第1454位碱基相同，该P1的3末端倒数第二个碱基与SEQIDNO2第1453位碱基相同；0012针对鸭坦布苏病毒强毒株SEQIDNO1所示基因序列设计的特异性上游引物P2，该上游引物P2的3末端倒数第二个碱基与SEQIDNO1第1891位碱基相同；0013针对所述SEQIDNO1或SEQI。
15、DNO2序列第197110991位核苷酸序列设计的通用下游引物P3。0014优选的，所述上游引物P2的3末端倒数第一个碱基为人工引入的错配碱基，该错配碱基与鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的基因序列均不互补。在引物P2的3末端人工引入错配碱基，可提高鉴别检验方法的特异性。0015更优选的，所述上游引物P1的序列如SEQIDNO3所示，上游引物P2的序列如SEQIDNO4所示，下游引物P3的序列如SEQIDNO5所示。0016更优选的，所述上游引物P1的序列如SEQIDNO6所示，上游引物P2的序列如SEQIDNO7所示，下游引物P3的序列如SEQIDNO5所示。0017所述试剂盒还包含RTPCR。
16、反应缓冲液、反转录酶、聚合酶。0018优选的，所述试剂盒用于检测样品时的PCR退火温度为5459。0019在本发明的另一方面，还提供了一种检测鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的引物，该引物包括0020针对鸭坦布苏病毒强毒株SEQIDNO1所示基因序列设计的特异性上游引物P1，该上游引物P1的3末端倒数第一个碱基与SEQIDNO1第1454位碱基相同，该P1的3末端倒数第二个碱基与SEQIDNO1第1453位碱基相同；0021针对鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株SEQIDNO2所示基因序列设计的特异性上游引物P2，该上游引物P2的3末端倒数第二个碱基与SEQIDNO2第1891位碱基相同；0022针对所述S。
17、EQIDNO1或SEQIDNO2序列第197110991位核苷酸序列设计的通用下游引物P3。0023在本发明的另一方面，还提供了一种检测鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的引说明书CN104212912A3/7页6物，该引物包括0024针对鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株SEQIDNO2所示基因序列设计的特异性上游引物P1，该上游引物P1的3末端倒数第一个碱基与SEQIDNO2第1454位碱基相同，该P1的3末端倒数第二个碱基与SEQIDNO2第1453位碱基相同；0025针对鸭坦布苏病毒强毒株SEQIDNO1所示基因序列设计的特异性上游引物P2，该上游引物P2的3末端倒数第二个碱基与SEQIDNO1第18。
18、91位碱基相同；0026针对所述SEQIDNO1或SEQIDNO2序列第197110991位核苷酸序列设计的通用下游引物P3。0027在本发明的另一方面，还提供了上述鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒在制备区分鸭坦布苏病毒自然感染强毒株和弱毒疫苗株的产品中的应用。0028在本发明的另一方面，还提供了上述鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒在制备快速鉴定鸭坦布苏病毒的产品中的应用。0029本发明鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒，具有特异性强、灵敏度高的特点，不仅能快速鉴定出鸭坦布苏病毒，而且还能快速、准确地区分鸭坦布苏病毒自然感染野毒株和弱毒疫苗免疫毒株，对于鸭坦布苏病毒。
19、弱毒疫苗株FX2010180P株的临床广泛应用具有重要意义。附图说明0030下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。0031图1是本发明实施例1引物及限制酶酶切位点在鸭坦布苏病毒基因组中的位置及各毒株在此区域的比较图；0032图2是本发明实施例1用引物对SEQIDNO3SEQIDNO4SEQIDNO5在不同退火温度下对鸭坦布苏病毒强毒、弱毒株基因组进行扩增的结果图；0033图3是本发明实施例1用引物对SEQIDNO6SEQIDNO7SEQIDNO5在不同退火温度下对鸭坦布苏病毒强毒、弱毒株基因组进行扩增的结果图；0034图4是本发明实施例2鸭坦布苏病毒强、弱毒株在不同含量病毒液条。
20、件下进行扩增的结果图；0035图5是本发明实施例3的RTPCR检测不同鸭源病毒基因组的结果图；0036图6是本发明实施例4的鸭坦布苏病毒强、弱毒株RTPCR产物的酶切分析结果图；0037图7是本发明实施例5的RTPCR检测弱毒疫苗株病毒液和强毒感染鸭卵巢组织的结果图。具体实施方式0038下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如分子克隆实验指南萨姆布鲁克J，拉塞尔DW，著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译分子克隆实验指南，第3版，北京科学出版社，2002中所述的方法进行。0039下面通过具体实施例阐述本发明。0040材料说明书CN104212912A4/7页700411试剂0042。
21、RNAISOPLUS、MMLV反转录酶、DL2000DNA分子量标准购自宝生物工程大连有限公司；PCRMIX购自广州东盛生物科技有限公司；氯仿、异丙醇、75乙醇用DEPC处理过的水配制、无RNASE的水。00432病毒和细胞0044鸭坦布苏病毒强毒株FX2010株和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株FX2010180P株，病毒滴度为1055TCID5001ML。DF1细胞由中国农科院上海兽医研究所保存，用含有10犊牛血清和适量抗生素的DMEM培养基GIBCOBRL公司在37、5CO2的培养箱中培养。0045实施例1鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的引物设计和PCR条件的确定00461引物设计及合成004。
22、7把GENBANK中公布的鸭坦布苏病毒BYD1株、FS株、ALD株、JM株、JS804株、ZJ6株和SD株等8株鸭坦布苏病毒强毒株和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株FX2010180P株的基因组序列进行比较分析，设计3条引物。其中，P15CTGAAACATGCCGCYAGA3,YCTSEQIDNO3为鸭坦布苏病毒强毒株FX2010特异性上游引物，P25GTGTAGTAATACATTTTCCCTAGCA3,SEQIDNO4为鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株FX2010180P株特异性上游引物，P2引物3末端的碱基“A”既不是强毒序列也不是弱毒序列，加“A”是为了提高鉴别检验方法的特异性，P35CCGAAAACCTG。
23、ATGAATGC3，SEQIDNO5是强、弱毒株通用的下游引物图1。P1P3和P2P3预期能分别特异性地扩增鸭坦布苏病毒强毒株FX2010和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株FX2010180P株，扩增产物分别为860BP和429BP。在扩增片段的序列中，SALI限制酶酶切位点是强、弱毒株都有的，而BGLII限制酶酶切位点是强毒株特异的图1。引物由上海英俊生物有限公司合成。0048上述P1、P2引物的设计原理是利用鸭坦布苏病毒强毒株FX2010SEQIDNO1基因序列和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株FX2010180P株SEQIDNO2基因序列在第1453、1454、1891位碱基存在差别，设计包含SEQIDNO。
24、1序列第1453、1454位碱基的上游引物P1和包含SEQIDNO2序列第1891位碱基的上游引物P2，然后在SEQIDNO1或SEQIDNO2序列第197110991位核苷酸序列中设计通用的下游引物P3，这样P1P3和P2P3能分别扩增出鸭坦布苏病毒强毒株FX2010和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株FX2010180P株的特异性片段；同样，也可以设计包含SEQIDNO2序列第1453、1454位碱基的上游引物P1例如SEQIDNO6和包含SEQIDNO1序列第1891位碱基的上游引物P2例如SEQIDNO7，再在SEQIDNO1或SEQIDNO2序列第197110991位核苷酸序列中设计通用的下游引。
25、物P3，该P1P3和P2P3能分别扩增出鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株FX2010180P株和鸭坦布苏病毒强毒株FX2010的特异性片段，同样能将鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株区分开。00492样品的处理0050对于组织样品，每克组织加1ML10X双抗无菌PBS，进行研磨，然后12000RPM，4离心10MIN，取上清备用。对于细胞培养的病毒液样品可直接用于RNA的提取。00513病毒RNA的提取0052按照RNAISOPLUS说明书提取病毒RNA。说明书CN104212912A5/7页800531取样品01ML，移入一个盛有03MLRNAISOPLUS的EPPENDORF离心管中，用移液枪反复吹打至。
26、组织完全裂解，液体基本澄清。室温静置5MIN，每管加入008ML氯仿，剧烈摇动15SEC，静置3MIN。12000G4离心10MIN。00542小心吸取上清夜置于另一无菌的新EPPENDORF离心管中，加入04ML异丙醇，室温静止10MIN，12000G4离心10MIN。00553弃上清，用1ML现配的75乙醇清洗沉淀，7500G4离心5MIN。弃上清，让沉淀在室温自然干燥510MIN。00564每管用20L无RNASE的DEPC水重悬溶解。00574反转录合成CDNA0058用MMLV反转录酶反转录合成CDNA取总RNA5L，加入引物P34L40PMOL，置6510MIN后，迅速冰浴2MIN。
27、，然后依次加入MLV缓冲液4L、DEPC水3L、DNTPMIX10MMOL2L、RRI1L40U、MLV1L200U。置3010MIN、421H，然后7015MIN。00595PCR0060使用PCRMIX试剂，在25L反应体系中，分别加入PCRMIX125L、上游引物P1SEQIDNO3和P2SEQIDNO4各1L10PMOL，下游引物P3SEQIDNO51L10PMOL、反转录产物2L，超纯水75L。PCR程序为95预变性3MIN；95变性30S、5459退火30S、72延伸1MIN，35个循环；72延伸10MIN。PCR产物用1的琼脂糖凝胶电泳检测。00616RTPCR退火温度的确定00。
28、62取鸭坦布苏病毒强毒株FX2010株和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株FX2010180P株，分别稀释为1050TCID5001ML，然后按照上述24的方法进行试验，确定RTPCR方法的退火温度。0063结果00641以引物对P1P2P3SEQIDNO3SEQIDNO4SEQIDNO5在不同退火温度分别扩增鸭坦布苏病毒强毒株FX2010和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株FX2010180P。结果显示，对于弱毒疫苗株FX2010180P，退火温度在5459扩增时，都只出现1条特异的目的条带。对于强毒株FX2010，退火温度在5459扩增时，也只出现1条特异的目的条带。考虑到PCR的特异性以及扩增效率，选用56作为。
29、鉴别诊断RTPCR的退火条件图2。图2中，16鸭坦布苏病毒弱毒株FX2010180P，退火温度5459；7DL2000DNAMARKER；813鸭坦布苏病毒强毒株FX2010，退火温度5954。00652以引物对P1P2P3SEQIDNO6SEQIDNO7SEQIDNO5在不同退火温度分别扩增鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株FX2010180P和鸭坦布苏病毒强毒株FX2010。结果显示，对于弱毒疫苗株FX2010180P，退火温度在5457扩增时，都只出现1条特异的目的条带；对于强毒株FX2010，退火温度在5556扩增时，也只出现1条特异的目的条带图3。图3中，1DL2000DNAMARKER；23鸭。
30、坦布苏病毒强毒株FX2010，退火温度分别为5556；47鸭坦布苏病毒弱毒株FX2010180P，退火温度分别为5457；8阴性对照。说明书CN104212912A6/7页90066实施例2RTPCR敏感性试验0067根据实施例1引物对SEQIDNO3SEQIDNO4SEQIDNO5所确定的退火温度，将鸭坦布苏病毒强毒株FX2010和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株FX2010180P分别作系列稀释，取01ML含10TCID50、102TCID50、103TCID50和104TCID50的病毒液，用该引物对进行RTPCR方法检验。0068以不同病毒含量的病毒液作为检测材料，用RTPCR方法检测。结果显示。
31、，对于鸭坦布苏病毒强毒株FX2010，10TCID50的病毒液可以检测到特异性条带图4，对于鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株FX2010180P，1030TCID50病毒液可以检测到特异性条带图4。图4中，14鸭坦布苏病毒弱毒株FX2010180P，毒价分别为101040TCID50；5DL2000DNAMARKER；69鸭坦布苏病毒强毒株FX2010，毒价分别为104010TCID50。0069实施例3RTPCR特异性试验0070根据实施例1引物对SEQIDNO3SEQIDNO4SEQIDNO5所确定的退火温度，用该引物对扩增鸭坦布苏病毒强毒株FX2010、鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株FX2010180P、。
32、鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、H9亚型流感病毒、I型鸭肝炎病毒、鸭呼肠孤病毒和正常细胞阴性对照的基因组，检验RTPCR方法的特异性。0071结果应用RTPCR扩增鸭坦布苏病毒强毒株FX2010和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株FX2010180P基因组，分别能够扩增出大小为860BP和429BP的一条片段，而鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、H9亚型流感病毒、I型鸭肝炎病毒、鸭呼肠孤病毒和正常细胞阴性对照的基因组没有扩增出任何片断，表明该方法对鸭坦布苏病毒的检测特异性强图5。图5中，1DL2000DNAMARKER；2鸭坦布苏病毒强毒株FX2010；3鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株FX2010180P；4鸭瘟病毒；5番鸭细小病。
33、毒；6H9亚型流感病毒；7I型鸭肝炎病毒；8鸭呼肠孤病毒；9阴性对照。0072实施例4限制性片段长度多态性RFLP分析0073在实施例1用引物SEQIDNO3SEQIDNO4SEQIDNO5对鸭坦布苏病毒强毒株FX2010株和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株FX2010180P株扩增片断中，SALI限制酶酶切位点GTCGAC是鸭坦布苏病毒强、弱毒株共有的，而BGLII限制酶酶切位点AGATCT是强毒株特有的。因此，将鸭坦布苏病毒强毒株FX2010株和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株FX2010180P株RTPCR扩增产物分别用BGLII和SALI进行酶切分析，根据酶切产物大小可以进一步验证鸭坦布苏病毒强毒株FX2。
34、010株和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株FX2010180P株。0074结果鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株RTPCR扩增产物用SALI限制酶酶切后的电泳图可以看到约250BP和180BP的片断；鸭坦布苏病毒强毒RTPCR扩增产物用BGLII限制酶酶切后的电泳图可以看到约550BP和300BP的片断，用SALI限制酶酶切后的电泳图可以看到约600BP和250BP的片断图6。图6中，1DL2000DNAMARKER；2鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株SALI酶切；3鸭坦布苏病毒强毒株BGLII酶切；4鸭坦布苏病毒强毒株SALI酶切。0075实施例5鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的RTPCR检测试剂盒的组成及应用该试剂盒。
35、对临床样品进行RTPCR检测和重复性试验00761、试剂盒的组成说明书CN104212912A7/7页100077将SEQIDNO3、SEQIDNO4和SEQIDNO5所示的P1P3、P2P3引物对、RTPCR反应缓冲液、反转录酶、聚合酶，装配成试剂盒，组装后置于合适条件保存。0078或将SEQIDNO6、SEQIDNO7和SEQIDNO5所示的P1P3、P2P3引物对、RTPCR反应缓冲液、反转录酶、聚合酶，装配成试剂盒，组装后置于合适条件保存。00792、本发明试剂盒的应用0080取不同批次的鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株FX2010180P株病毒液和鸭坦布苏病毒强毒株FX2010感染鸭后第4天的。
36、卵巢组织按照上述方法进行检验。0081用鸭坦布苏病毒强毒株FX2010和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株FX2010180P病毒液重复多次，结果都一致，重复性良好。用上述含有SEQIDNO3SEQIDNO4SEQIDNO5引物对的试剂盒检验实验室生产的4批次的鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株FX2010180P的病毒液，均扩增出特异性条带图7。用该试剂盒再检验鸭坦布苏病毒强毒感染鸭的卵巢组织，均扩增出特异性条带图7。图7中，1DL2000DNAMARKER；2514批次鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株病毒液；6阴性对照；710鸭坦布苏病毒强毒株感染鸭14号鸭卵巢组织；11正常鸭卵巢组织对照。0082以上所述实施例仅表达了本。
37、发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。说明书CN104212912A101/12页1100010002序列表CN104212912A112/12页120003序列表CN104212912A123/12页130004序列表CN104212912A134/12页140005序列表CN104212912A145/12页150006序列表CN104212912A156/12页160007序列表CN104212912A167/12页170008序列表CN104212912A178/12页180009序列表CN104212912A189/12页190010序列表CN104212912A1910/12页200011序列表CN104212912A2011/12页210012序列表CN104212912A2112/12页22序列表CN104212912A221/2页23图1图2图3图4图5说明书附图CN104212912A232/2页24图6图7说明书附图CN104212912A24。