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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710323288.X (22)申请日 2017.05.10 (71)申请人 文山学院 地址 663099 云南省文山壮族苗族自治州 文山市学府路文山学院 (72)发明人 张铁 杨本恒 高明海 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (54)发明名称 一种白芨种子培养成苗的培养方法 (57)摘要 一种白芨种子培养成苗的培养方法， 涉及一 种植物植物种子成苗的培养方法， 具体为白芨种 子培育成苗培养方法； 包括种子采集、 贮藏； 消毒 灭菌、 诱导成苗、。
2、 壮苗生根、 炼苗与移栽5个步骤； 能够通过白芨种子无菌诱导成苗的组培方法， 为 白芨组织培养提供了一种效率高、 成活率高的方 法， 在短期内迅速获得大量健壮、 安全、 生活力强 的白芨种苗。 权利要求书1页 说明书5页 CN 107047310 A 2017.08.18 CN 107047310 A 1.一种白芨种子培养成苗的培养方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： （1） 种子采集、 贮藏： 采集成熟的白芨蒴果并密封保存于4的冰箱贮藏备用； 所述白芨 蒴果的实际贮藏数量为计划播种量的120130%； （2） 消毒灭菌： 从中选取未开裂的白芨蒴果， 用流水冲洗3040min后在超净工作台上。
3、 用75%酒精处理2040s， 再用0.1的升汞浸泡1015min， 再用无菌水漂洗45次， 每次1 2min， 然后用无菌干燥滤纸吸干蒴果表面水分备用； （3） 诱导成苗： 在超净工作台上， 以接种针从上一步处理过的白芨蒴果中挑取种子接种 到诱导培养基上， 暗培养到1317d后， 接着光培养6070d， 直至分化形成具有2片以上真 叶、 带有根的种子芽； 所述培养基pH值为 5.80.2， 培养温度为 242， 光照强度为 1200lx， 光照时间 12h d； 根据生产需要， 从每年的9月开始至次年6月， 每月诱导萌发一批 种子， 为壮苗生根提供足够的种苗； (4) 壮苗生根： 将上一步所。
4、得无菌苗转移到壮苗生根培养基中进行生根培养， 直至形 成带有圆球形假鳞茎的完整植株； 所述培养基pH 值为5.80.2， 培养温度为242， 光照 强度为1200lx， 光照时间12h d； (5) 炼苗与移栽： 将上一步所得完整植株的无菌瓶置于荫棚中炼苗1520d， 然后在荫 棚中打开瓶盖放置35d后将苗取出， 洗净根部培养基， 即刻移栽到经消毒的基质中， 待组 培移栽苗新叶展开和新根长出后， 即可按常规管理。 2.根据权利要求1所述的一种白芨种子培养成苗的培养方法， 其特征在于， 所述第 （3） 步中诱导培养基成分为： MS+ 苄基腺嘌呤 6-BA0.5mg L+ - 萘乙酸 NAA0.1。
5、mg L +2.5蔗 糖。 3.根据权利要求1或者2任意一项所述的一种白芨种子培养成苗的培养方法， 其特征在 于， 所述第 （4） 步中诱导培养基成分为： MS+ 苄基腺嘌呤6-BA0.5mg L+ -萘乙酸NAA1.5mg L +0.5mg L矮壮素+2.5蔗糖。 4.根据权利要求3所述的一种白芨种子培养成苗的培养方法， 其特征在于， 所述第 （1） 步中白芨蒴果的采集时间是910月， 当白芨蒴果由淡黄转褐色成熟之际。 5.根据权利要求4所述的一种白芨种子培养成苗的培养方法， 其特征在于， 所述第 （5） 步中荫棚遮荫度为6080%。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 1070473。
6、10 A 2 一种白芨种子培养成苗的培养方法 技术领域 0001 本发明涉及一种植物植物种子成苗的培养方法， 具体为白芨种子培育成苗培养方 法。 背景技术 0002 白芨( Bletilla striata ( Thunb ) Reichb f ) 为兰科白芨属多年生草本 植物， 初生假鳞茎是圆球形， 生长到一定程度才形成V字形块状假鳞茎； 叶46枚， 狭长圆形 或披针形， 长829厘米， 宽1.54厘米， 先端渐尖， 基部收狭成鞘并抱茎； 花序具310朵 花， 常不分枝或极罕分枝； 花序轴或多或少呈 “之” 字状曲折； 花苞片长圆状披针形， 长2 2.5厘米； 花大， 紫红色或粉红色； 花期。
7、45月； 果期811月； 白芨的种子极细小， 似粉末， 状 没有胚乳， 只有几个细胞构成的发育不完全的胚； 在自然条件下， 种子萌发率低。 白芨的块 茎为我国传统中药， 具有补肺、 消肿、 生肌、 止血、 敛疮等功效， 用于治疗肺伤咳血、 金疮出 血、 溃疡疼痛、 汤火灼伤、 手足皲裂等症。 0003 利用白芨种子无菌诱导萌发产生实生苗， 然后通过壮苗生根后移栽可获得白芨种 苗。 此育种方法能快速获得白芨种苗， 能明显缩短繁种周期， 并且培育的种苗健壮、 根系发 达， 移栽成活率高。 0004 目前已报道的白芨组培快繁育苗技术中， 需要经过外植体选择、 原球茎诱导培养、 丛生芽增殖培养、 生根。
8、诱导及炼苗移栽等生产环节才能批量生产出种苗。 这种组培繁育体 系， 中间生产环节多， 生产周期长， 用工成本高； 通过原球茎分化及丛生芽增殖培养， 虽可增 加繁种系数， 但组培苗与本技术培育的苗相比苗较弱、 根系不发达， 移栽成活率低。 发明内容 0005 本发明的目的在于克服现有白芨组培育苗技术存在的缺陷， 得到一种能够通过白 芨种子无菌诱导成苗的组培方法， 为白芨组织培养提供了一种效率高、 成活率高的方法， 在 短期内迅速获得大量健壮、 安全、 生活力强的白芨种苗。 0006 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的： 1、 一种白芨种子培养成苗的培养方法， 包括以下步骤 ： （1） 种子采。
9、集、 贮藏： 采集成熟的白芨蒴果并密封保存于4的冰箱贮藏备用； 所述白芨 蒴果的实际贮藏数量为计划播种量的120130%；（由于随贮种时间的延长， 种子萌发率会 有所下降， 所以在贮种时， 可增加2030%贮种量， 解决贮种过程中种子萌发率下降的所造 成的消耗量;） （2） 消毒灭菌： 从中选取未开裂的白芨蒴果， 用流水冲洗3040min后在超净工作台上 用75%酒精处理2040s， 再用0.1的升汞浸泡1015min， 再用无菌水漂洗45次， 每次1 2min， 然后用无菌干燥滤纸吸干蒴果表面水分备用； （3） 诱导成苗： 在超净工作台上， 以接种针从上一步处理过的白芨蒴果中挑取种子接种 到。
10、诱导培养基上， 暗培养到1317d后， 接着光培养6070d， 直至分化形成具有2片以上真 说 明 书 1/5 页 3 CN 107047310 A 3 叶、 带有根的种子芽； 所述培养基pH值为 5.80.2， 培养温度为 242， 光照强度为 1200lx， 光照时间 12h d； 根据生产需要， 从每年的9月开始至次年6月， 每月诱导萌发一批 种子， 为壮苗生根提供足够的种苗； (4) 壮苗生根： 将上一步所得无菌苗转移到壮苗生根培养基中进行生根培养， 直至形 成带有圆球形假鳞茎的完整植株； 所述培养基pH 值为5.80.2， 培养温度为242， 光照 强度为1200lx， 光照时间12。
11、h d； (5) 炼苗与移栽： 将上一步所得完整植株的无菌瓶置于荫棚中炼苗1520d， 然后在荫 棚中打开瓶盖放置35d后将苗取出， 洗净根部培养基， 即刻移栽到经消毒的基质中， 待组 培移栽苗新叶展开和新根长出后， 即可按常规管理。 0007 进一步： 所述第 （3） 步中诱导培养基成分为： MS+ 苄基腺嘌呤 6-BA0.5mg L+ - 萘 乙酸 NAA0.1mg L +2.5蔗糖。 0008 进一步： 所述第 （4） 步中诱导培养基成分为： MS+ 苄基腺嘌呤6-BA0.5mg L+ -萘乙 酸NAA1.5mg L+0.5mg L矮壮素+2.5蔗糖。 0009 进一步： 所述第 （1）。
12、 步中白芨蒴果的采集时间是910月， 当白芨蒴果由淡黄转褐 色成熟之际。 0010 进一步： 所述第 （5） 步中荫棚遮荫度为6080%。 0011 有益技术效果 本发明是充分利用丰富的白芨种子资源， 通过组培无菌培养技术， 在解决白芨种子在 自然条件下萌发率低的技术问题的同时、 将其直接诱导萌发生长成苗； 本发明与现有组培 技术相比， 主要有以下三方面不同： 一是通过种子的诱导萌发、 直接长大成苗， 减少了组培 生产过程中的原球茎诱导培养、 丛生芽增殖培养等环节， 缩短了育苗生产周期， 节约用工成 本； 二是利用丰富的白芨种子资源， 根据生产需要分批次进行种子无菌播种， 为下一个生产 环节提。
13、供充足种源； 三是通过本发明生产的种苗， 与传统组培生产的组培苗不同， 属种子诱 导萌发的实生苗， 植株健壮、 根系发达， 移栽成活高。 具体实施方式 0012 下面结合实例对本发明操作技术作出进一步说明。 0013 实施例1： 一种白芨种子培养成苗的培养方法， 包括以下步骤 ： (1) 种子采集、 贮藏： 9-10月， 当白芨蒴果由淡黄转褐色成熟之际， 采集成熟的白芨蒴 果并密封保存于4的冰箱贮藏备用； 所述白芨蒴果的实际贮藏数量为计划播种量的120%； (2) 消毒灭菌： 取具有4月胚龄、 在4冰箱中贮藏1个月的种子， 作为备用材料， 从备 用材料中选取未开裂的白芨蒴果， 用流水冲洗 30。
14、min， 在超净工作台上用 75酒精处理 30s后再用0.1升汞浸泡10min， 倒掉升汞溶液， 用无菌水漂洗4次， 每次1min， 用无菌干燥 滤纸吸干蒴果表面水分备用； (3)诱导成苗： 在超净工作台上， 以接种针从上一步处理过的白芨蒴果中挑取种子接种 到诱导培养基上， 暗培养到13d， 接着光培养60d， 直至分化形成具有2片以上真叶、 带有根的 种子芽， 诱导培养基成分优选为： MS+苄基腺嘌呤6-BA0.5mg L+ -萘乙酸 NAA0.1mg L + 2.5蔗糖 ； 培养基 pH值为5.6， 培养温度为22， 光照强度为 1200lx， 光照时间 12h d； 根据生产需要， 从每。
15、年的9月开始至次年6月， 每月诱导萌发一批种子， 为壮苗生根提供足 说 明 书 2/5 页 4 CN 107047310 A 4 够的种苗； (4) 壮苗生根： 将上一步所得无菌苗转移到壮苗生根培养基中进行壮苗生根培养， 直 至形成带有圆球形假鳞茎的完整植株； 壮苗生根培养基成分优选为： MS+苄基腺嘌呤 6- BA0.5mg L+ - 萘乙酸 NAA1.5mg L+0.5mg L 矮壮素 +2.5蔗糖； 培养基pH值为5.6， 培养 温度为22， 光照强度为1200lx， 光照时间12h d。 0014 (5) 炼苗与移栽： 将上一步所得完整植株的无菌瓶置于遮荫度为60%的荫棚中炼 苗15d。
16、， 然后在荫棚中打开瓶盖放置3d， 将苗取出， 洗净根部培养基即刻移栽到经消毒的基 质中， 适度遮荫， 保持一定的湿度， 待组培移栽苗新叶展开和新根长出后， 即可按常规管理。 0015 实施例2： 一种白芨种子培养成苗的培养方法， 包括以下步骤 ： (1) 种子采集、 贮藏： 9-10月， 当白芨蒴果由淡黄转褐色成熟之际， 采集成熟的白芨蒴 果并密封保存于4的冰箱贮藏备用； 所述白芨蒴果的实际贮藏数量为计划播种量的130%； (2) 消毒灭菌： 取具有4月胚龄、 在4冰箱中贮藏1个月的种子， 作为备用材料， 从备 用材料中选取未开裂的白芨蒴果， 用流水冲洗 40min， 在超净工作台上用 75。
17、酒精处理 30s后再用0.1升汞浸泡15min， 倒掉升汞溶液， 用无菌水漂洗5次， 每次2min， 用无菌干燥 滤纸吸干蒴果表面水分备用； (3)诱导成苗： 在超净工作台上， 以接种针从上一步处理过的白芨蒴果中挑取种子接种 到诱导培养基上， 暗培养到17d， 接着光培养70d， 直至分化形成具有2片以上真叶、 带有根的 种子芽， 诱导培养基成分优选为： MS+苄基腺嘌呤6-BA0.5mg L+ -萘乙酸NAA0.1mg L + 2.5蔗糖； 培养基 pH值为6， 培养温度为26， 光照强度为 1200lx， 光照时间 12h d； 根据 生产需要， 从每年的9月开始至次年6月， 每月诱导萌发。
18、一批种子， 为壮苗生根提供足够的种 苗； (4) 壮苗生根： 将上一步所得无菌苗转移到壮苗生根培养基中进行壮苗生根培养， 直 至形成带有圆球形假鳞茎的完整植株； 壮苗生根培养基成分优选为： MS+苄基腺嘌呤 6- BA0.5mg L+ - 萘乙酸 NAA1.5mg L+0.5mg L 矮壮素 +2.5蔗糖； 培养基pH值为6， 培养温 度为26， 光照强度为1200lx， 光照时间12h d。 0016 (5) 炼苗与移栽： 将上一步所得完整植株的无菌瓶置于遮荫度为80%的荫棚中炼 苗20d， 然后在荫棚中打开瓶盖放置5d， 将苗取出， 洗净根部培养基即刻移栽到经消毒的基 质中， 适度遮荫， 。
19、保持一定的湿度， 待组培移栽苗新叶展开和新根长出后， 即可按常规管理。 0017 实施例3： 一种白芨种子培养成苗的培养方法， 包括以下步骤 ： (1) 种子采集、 贮藏： 9-10月， 当白芨蒴果由淡黄转褐色成熟之际， 采集成熟的白芨蒴 果并密封保存于4的冰箱贮藏备用； 所述白芨蒴果的实际贮藏数量为计划播种量的125%； (2) 消毒灭菌： 取具有4月胚龄、 在4冰箱中贮藏1个月的种子， 作为备用材料， 从备 用材料中选取未开裂的白芨蒴果， 用流水冲洗 35min， 在超净工作台上用 75酒精处理 30s后再用0.1升汞浸泡13min， 倒掉升汞溶液， 用无菌水漂洗4次， 每次1min， 用。
20、无菌干燥 滤纸吸干蒴果表面水分备用； (3)诱导成苗： 在超净工作台上， 以接种针从上一步处理过的白芨蒴果中挑取种子接种 到诱导培养基上， 暗培养到15d， 接着光培养65d， 直至分化形成具有2片以上真叶、 带有根的 种子芽， 诱导培养基成分优选为： MS+苄基腺嘌呤6-BA0.5mg L+ -萘乙酸 NAA0.1mg L + 2.5蔗糖 ； 培养基 pH值为5.8， 培养温度为24， 光照强度为1200lx， 光照时间 12h d； 根 说 明 书 3/5 页 5 CN 107047310 A 5 据生产需要， 从每年的9月开始至次年6月， 每月诱导萌发一批种子， 为壮苗生根提供足够的 种。
21、苗； (4) 壮苗生根： 将上一步所得无菌苗转移到壮苗生根培养基中进行壮苗生根培养， 直 至形成带有圆球形假鳞茎的完整植株； 壮苗生根培养基成分优选为： MS+苄基腺嘌呤 6- BA0.5mg L+ - 萘乙酸 NAA1.5mg L+0.5mg L 矮壮素 +2.5蔗糖； 培养基pH值为5.8， 培养 温度为24， 光照强度为1200lx， 光照时间12h d。 0018 (5) 炼苗与移栽： 将上一步所得完整植株的无菌瓶置于遮荫度为70%的荫棚中炼 苗18d， 然后在荫棚中打开瓶盖放置4d， 将苗取出， 洗净根部培养基即刻移栽到经消毒的基 质中， 适度遮荫， 保持一定的湿度， 待组培移栽苗新。
22、叶展开和新根长出后， 即可按常规管理。 0019 为了进一步反映本发明的技术效果， 提供以下试验数据： （1） 种子成熟度及最佳采集期确定 种子萌发率、 萌发时间等与胚龄的大小关系密切， 种子的成熟度用胚龄来表示， 胚龄为 从授粉开始到子房膨大成果实所需时间。 本技术为了采集到最佳成熟度的种子， 选取白芨 胚龄为3、 4、 5、 6个月的胚， 无菌播种在种子诱导培养基中： MS+ 6-BA0.5mg L+ NAA0.1mg L +2.5蔗糖 ； pH 值为 5.80.2， 25暗培养 15d后， 可见种子膨大萌发， 接着以 1200lx 光照强度、 12h/d 的光照时间培养 30-60d， 。
23、调查种子的萌发率和萌发时间， 研究种子成熟 度对种子萌发的影响； 其萌发时间随着胚龄的增加而减小， 3个月的白芨种子萌发时间最长为60天， 45个月 的白芨萌发时间为30天左右， 6个月胚龄种子的萌发时间与3个月种子大致相当； 白芨种子 的萌发率和成苗率在胚龄为3个月时萌发率和成苗率均较低， 都在30%以下， 胚龄在45个 月的白芨种子发芽率和成苗率基本保持不变， 胚龄在6个月的白芨种子发芽率和成苗率有 所下降， 在75%， 但6个月以上胚龄灭菌时蒴果易开裂， 污染严重， 且生长缓慢； 因此， 综合考虑， 白芨无菌萌发最合适的胚龄为45个月， 萌发时间为28天， 萌发率和 成苗率最高， 分别为。
24、93%和92%， 幼苗生长最好。 说明45个月的胚龄 （也就是910月， 当白 芨蒴果由淡黄转褐色成熟之际） ， 胚发育成熟， 比较适合于白芨种子的无菌萌发和成苗； （2） 种子贮备 种子生活力是指种子发芽的潜在能力或种胚具有的生命力， 它是本技术发明的一个重 要技术参数。 采集具有34个月的胚龄的蒴果， 将表面的灰尘清洗掉， 室温下放置2天， 然后 把部分蒴果放于牛皮纸袋内， 置于3种温度条件下作贮存处理： 20冰箱； 4冰箱； 室温条 件； 贮藏时间为1、 3、 6个月， 贮藏期间1、 3和6个月后随机取样作种子发芽测定和活力测定； 通过实验， 就贮存时间来看， 白芨种子贮存一个月时， 较。
25、新采集时的种子活力高， 可能 原因是白芨种子存在后熟现象， 贮存3个月时， 种子活力有所下降， 贮存6个月时， 种子萌发 率下降幅度较大。 三种贮存方式， 4冰箱贮存效果较好， 贮存一个月后， 种子萌发率为99%， 种子染色率为99%， 贮存6个月时， 萌发率在70%以上； 其它两种贮存方式， 种子萌发率和活力 下降幅度较大， 贮存效果较差； 由此可知， 4冰箱贮存是白芨石斛种子短时间保存的最佳方式； （3） 消毒灭菌 从密封于4冰箱中保存备用材料中选取未开裂的白芨蒴果， 用流水冲洗 3040min， 在超净工作台上用 75酒精处理30s后再用0.1升汞浸泡1015min， 倒掉升汞溶液， 用。
26、 说 明 书 4/5 页 6 CN 107047310 A 6 无菌水漂洗45次， 每次12min， 用无菌干燥滤纸吸干蒴果表面水分备用； （4） 种子无菌诱导成苗 在超净工作台上， 以接种针从灭过菌的白芨蒴果中挑取种子接种到诱导培养基上， 暗 培养到1317 d， 接着光培养60 70d， 直至分化形成具有2片以上真叶、 带有根的种子苗； 诱导培养基成分优选为 ： MS+ 苄基腺嘌呤 6-BA0.5mg L+ - 萘乙酸 NAA0.1mg L +2.5蔗糖 ； 培养基 pH 值为 5.80.2， 培养温度为 24+2， 光照强度为 1200lx， 光照 时间 12h d； 根据生产需要， 从。
27、9月开始至次年6月， 每月无菌诱导萌发一批种子， 为壮苗生根提供足 够的种苗； （5） 壮苗生根 将上一步所得无菌苗转移到壮苗生根培养基中进行壮苗生根培养， 直至形成带有圆球 形假鳞茎的完整植株； 壮苗生根培养基成分优选为 ： MS+ 苄基腺嘌呤 6-BA0.5mg L+ - 萘乙酸 NAA15mg L+0.5mg L 矮壮素 +2.5蔗糖 ； 培养基 pH 值为 5.80.2， 培养温度为 24+2， 光 照强度为 1200lx， 光照时间 12h d； （6） 炼苗与移栽 将上述获得完整植株的无菌瓶， 置于遮荫度达6080%荫棚中炼苗1520d， 然后在荫 棚中打开瓶盖放置35d， 将苗取出， 洗净根部培养基即刻移栽到经消毒的基质中， 适度遮 荫， 保持一定的湿度， 待组培移栽苗新叶展开和新根长出后， 即可按常规管理。 0020 在不脱离本发明范围的情况下， 还可以对发明进行各种变换及等同代替， 因此， 本 发明专利不局限于所公开的具体实施过程， 而应当包括落入本发明权利要求范围内的全部 实施方案。 说 明 书 5/5 页 7 CN 107047310 A 7 。