一种肿瘤细胞广谱高活性启动子及其用途.pdf

本发明属于分子生物学领域，涉及一种肿瘤细胞广谱高活性启动子及其用途。所述启动子能在肿瘤细胞内广谱高效表达外源基因，其在一系列肿瘤细胞中的表达活性高于现有的CAG启动子，且序列稳定(不会在原核细胞及真核细胞转移过程中发生序列丢失)。该启动子可适用于在肿瘤基因治疗过程中，驱动外源基因在肿瘤细胞内的高效表达。

1.  一种分离的多核苷酸，其包含如下元件：
hCMV增强子、β-Actin启动子和mCMV增强子；
具体地，其还包含Ubi增强子；更具体地，Ubi增强子位于上述3种元件的下游；
具体地，上述4种元件各自独立地为1个、2个、3个或3个以上；
具体地，所述多核苷酸具有启动子功能。

2.  根据权利要求1所述的多核苷酸，其依次包含：
hCMV增强子+β-Actin启动子+mCMV增强子，或者
mCMV增强子+hCMV增强子+β-Actin启动子；
优选地，其依次包含：
hCMV增强子+β-Actin启动子+mCMV增强子+Ubi增强子，或者
mCMV增强子+hCMV增强子+β-Actin启动子+Ubi增强子。

3.  根据权利要求1所述的多核苷酸，其中：
hCMV增强子的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示；
β-Actin启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示；
mCMV增强子的核苷酸序列如SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所示；优选为SEQ ID NO：20；
Ubi增强子的核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示。

4.  根据权利要求1至3中任一项所述的多核苷酸，其各个元件之间有或没有连接序列或者剪接位点；具体地，在mCMV增强子和/或hCMV增强子和/或Ubi增强子的上游和下游分别有剪接供体和剪接受体；更具体地，所述剪接供体的核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示；所述剪接受体的核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示。

5.  一种分离的多核苷酸，其包含或者为选自如下的a－e中任意一组的多核苷酸：
a.SEQ ID NO：1－SEQ ID NO：4中任一序列所示的多核苷酸；
b.与SEQ ID NO：1－SEQ ID NO：4中任一序列互补的多核苷酸；
c.在高等严紧条件下能够与上述a或b的多核苷酸杂交并具有启动子功能的多核苷酸；
d.对上述a或b所示多核苷酸进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰并具有启动子功能的多核苷酸；和
e.与上述a或b所示多核苷酸具有至少90％同一性并具有启动子功能的多核苷酸；
具体地，a或b中的多核苷酸具有启动子功能。

6.  一种核酸构建体，包含权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸，以及可操作地连接的外源基因；具体地，所述外源基因选自p53、GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-24、Trail、p16、TK、IFNγ、TNFα、Rb、Sirpα等中的任意一种或多种；具体地，所述外源基因为SEQ ID NO：12所示p53和/或SEQ ID NO：4所示GM-CSF。

7.  一种重组载体，其含有权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸或者权利要求6所述的核酸构建体；具体地，所述重组载体为重组病毒载体；具体地，所述重组载体为权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸或者权利要求6所述的核酸构建体与pDC315质粒或SG655经重组得到的重组载体。

8.  一种药用组合物，其包含权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸或者权利要求6所述的核酸构建体或者权利要求7所述的重组载体，以及可选的药学上可接受的辅料。

9.  选自如下的(1)或(2)的用途：
(1)权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸或者权利要求6所述的核酸构建体或者权利要求7所述的重组载体在制备治疗和/或预防和/或辅助治疗癌症或者抗肿瘤的药物中的用途；具体地，所述癌症或者肿瘤为肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢 癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺癌；
(2)权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸或者权利要求6所述的核酸构建体或者权利要求7所述的重组载体在制备抑制肿瘤细胞的药物或者试剂中的用途；具体地，所述肿瘤细胞为如下肿瘤的细胞：肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺癌；在具体的实施方案中，所述肿瘤细胞为选自Hep3B、Huh7、HepG2、PLC/PRF/5、BEL-7404、H460和H1299细胞中的任意一种。

10.  一种在体内或体外抑制肿瘤细胞的方法，包括使用有效量的权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸或者权利要求6所述的核酸构建体或者权利要求7所述的重组载体的步骤；具体地，所述肿瘤细胞为如下肿瘤的细胞：肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺癌；在具体的实施方案中，所述肿瘤细胞为选自Hep3B、Huh7、HepG2、PLC/PRF/5、BEL-7404、H460和H1299细胞中的任意一种。

11.  权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸在作为启动子中的用途。

12.  一种分离的多核苷酸，其包含或者为SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列或其互补序列。

13.  权利要求12所述的多核苷酸在制备启动子中的用途；具体地，所述启动子为具有启动子功能的权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸。

一种肿瘤细胞广谱高活性启动子及其用途
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种肿瘤细胞广谱高活性启动子及其用途。所述启动子为人工合成的嵌合启动子，该启动子在肿瘤细胞中具有广谱的高活性。本发明还涉及含有该启动子的重组载体、重组病毒、以及所述启动子控制治疗基因用于基因治疗的用途。
背景技术
启动子是基因的一个组成部分，通常位于结构基因5’端上游，是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。启动子能够指导全酶(holoenzyme)同模板正确结合，活化RNA聚合酶，启动基因转录，从而控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。启动子是影响转基因表达效率的重要因素之一，选择高效率的启动子是高效率表达外源基因的关键。
根据启动子的转录模式可将其分为3类：组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。所谓组成型启动子是指在组成型启动子调控下，不同组织器官和发育阶段的基因表达没有明显差异，因而称之组成型启动子。
哺乳动物中常用的组成型启动子包括病毒来源：鼠或人巨细胞病毒(CMV)启动子(分别简称mCMV与hCMV)、猴空泡病毒SV40启动子；人基因组天然来源：EF1α启动子、泛素启动子(Ubiquitin，简称Ubi)、β-actin启动子、PGK-1启动子、Rosa26启动子、HSP70启动子、GAPDH启动子、eIF4A1启动子、Egr1启动子、FerH启动子、SM22α启动子、Endothelin-1启动子等。
哺乳动物常用组织特异性启动子有：B29启动子(B细胞特异性)、CD14启动子(单个核细胞特异性)、CD43启动子(淋巴细胞及血小 板特异性)、CD45及INF-β启动子(造血细胞特异性)、CD68启动子(巨噬细胞特异性)、Desmin及Myoglobin启动子(肌肉细胞特异性)、CD105及CD102启动子(内皮细胞特异性)、GFAP启动子(星形胶质细胞特异性)、GPIIb启动子(巨核细胞特异性)、Surfactant Protein B启动子(肺特异性)、NSE启动子(成熟神经元细胞特异性)、Alb启动子(肝特异性)等。
常用肿瘤特异性启动子有：AFP启动子(肝癌特异性)、CCKAR启动子(胰腺癌特异性)、PSA启动子(前列腺癌特异性)、Tyr启动子(黑色素瘤特异性)、hTERT启动子/CEA启动子/Survivin启动子/CXCR4启动子/COX-2/L-plastin启动子/epididymis protein 4启动子/E2F1启动子(肿瘤广谱特异性)等。
常用诱导型启动子有：基于四环素(Tet)系统的诱导型启动子(包括Tet-On或Tet-off)、脱皮激素类诱导系统的诱导型启动子、FK506调控系统的诱导型启动子、纳巴霉素诱导系统的诱导型启动子、RU486诱导系统的诱导型启动子等。
在肿瘤基因治疗中，维持外源基因的高效稳定表达非常重要。然而，一些病毒来源的组成型启动子尽管瞬时表达活性较高(如CMV启动子)，但容易因表观遗传修饰而被关闭表达；而一些人源天然组成型启动子或肿瘤特异性启动子虽然表达稳定，但表达活性相对较弱，难以满足基因治疗需求。因而，研究人员又设计构建了一系列人工嵌合启动子，它们包含了一些顺式调控元件，主要包括能发挥稳定表达作用的启动子核心序列，以及能增强表达效率的上游增强子或下游内含子，代表者是嵌合启动子CAG(包含人CMV增强子-鸡β-actin启动子-兔β-globin内含子)，广泛应用于外源基因的表达。
尚需要开发适合在肿瘤细胞内广谱高效表达外源基因的启动子，其在一系列肿瘤细胞中的表达活性高于CAG启动子，且序列稳定(不会在原核细胞及真核细胞转移过程中发生序列丢失)，并能够适用于驱动外源基因在肿瘤细胞内的高效表达。
发明内容
本发明人经过大量的试验和创造性的劳动，设计构建了一系列新型嵌合启动子，并从中筛选获得一个能在肿瘤细胞内广谱高效表达外源基因的启动子。本发明人惊奇地发现，该启动子序列稳定，不会随着其在原核细胞或真核细胞内的转移而发生序列丢失现象，并且能够稳定地表达驱动外源基因的表达。由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及一种分离的多核苷酸，其包含如下元件：
hCMV增强子、β-Actin启动子和mCMV增强子；
具体地，其还包含Ubi增强子；更具体地，Ubi增强子位于上述3种元件的下游；
具体地，上述4种元件各自独立地为1个、2个、3个或3个以上；
具体地，所述多核苷酸具有启动子功能。
根据本发明任一项所述的多核苷酸，其依次包含：
hCMV增强子+β-Actin启动子+mCMV增强子，或者
mCMV增强子+hCMV增强子+β-Actin启动子；
优选地，其依次包含：
hCMV增强子+β-Actin启动子+mCMV增强子+Ubi增强子，或者
mCMV增强子+hCMV增强子+β-Actin启动子+Ubi增强子。
根据本发明任一项所述的多核苷酸，其中：
hCMV增强子的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示；
β-Actin启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示；
mCMV增强子的核苷酸序列如SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所示；优选为SEQ ID NO：20；
Ubi增强子的核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示。
根据本发明任一项任一项所述的多核苷酸，其各个元件之间有或没有连接序列或者剪接位点；具体地，在mCMV增强子和/或hCMV增强子和/或Ubi增强子的上游和下游分别有剪接供体和剪接受体；更具体地，所述剪接供体的核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示；所述剪接受 体的核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示。
剪接供体(splice donor，SD)：AAAACAGGTAAGTCC(SEQ ID NO：22)
剪接受体(splice acceptor，SA)：GCCTCTACTAACCATGTTCATGTTTTCTTTTTTTTTCTACAGGTCCTGGGTGACGAACAG(SEQ ID NO：23)
在本发明的一个实施方案中，不拘于理论的限制，启动子后面的增强子序列两端含有剪切位点，保证在转录后，位于启动子下游的增强子序列能被准确剪切掉，不影响目的蛋白的翻译；其余元件直接连接。
本发明的另一方面涉及一种分离的多核苷酸，其包含或者为选自如下的a－e中任意一组的多核苷酸：
a.SEQ ID NO：1－SEQ ID NO：4中任一序列所示的多核苷酸；
b.与SEQ ID NO：1－SEQ ID NO：4中任一序列互补的多核苷酸；
c.在高等严紧条件下能够与上述a或b的多核苷酸杂交并具有启动子功能的多核苷酸；
d.对上述a或b所示多核苷酸进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰并具有启动子功能的多核苷酸；和
e.与上述a或b所示多核苷酸具有至少90％同一性并具有启动子功能的多核苷酸；
具体地，a或b中的多核苷酸具有启动子功能。
本发明的上述多核苷酸为启动子；具体地，是嵌合启动子。
SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4的具体序列如下：
CAC启动子(含hCMV增强子+β-Actin启动子+mCMV增强子)：
GGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGC AGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTAAAACAGGTAAGTCCCTGAGTCATTAGGGACTTTCCAATGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAATCAACAGGAAAGTCCCATTGGAGCCAAGTACACTGAGTCAATAGGGACTTTCCATTGGGTTTTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTCAATGGGTTTTTCCCATTATTGGCACGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTCCAGCCAATTTAATTAAAACGCCATGTACTTTCCCACCATTGACGTCAATGGGCTATTGAAACTAATGCAACGTGACCTTTAAACGGTACTTTCCCATAGCTGATTAATGGGAAAGTACCGTTCGCCTCTACTAACCATGTTCATGTTTTCTTTTTTTTTCTACAGGTCCTGGGTGACGAACAG(SEQ ID NO：1)
CACU启动子(含hCMV增强子+β-Actin启动子+mCMV增强子-Ubi增强子)：
GGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGC AGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTAAAACAGGTAAGTCCCTGAGTCATTAGGGACTTTCCAATGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAATCAACAGGAAAGTCCCATTGGAGCCAAGTACACTGAGTCAATAGGGACTTTCCATTGGGTTTTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTCAATGGGTTTTTCCCATTATTGGCACGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTCCAGCCAATTTAATTAAAACGCCATGTACTTTCCCACCATTGACGTCAATGGGCTATTGAAACTAATGCAACGTGACCTTTAAACGGTACTTTCCCATAGCTGATTAATGGGAAAGTACCGTTCGGCCTCCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGGGCGCCCCCCTCCTCACGGCGAGCGCTGCCACGTCAGACGAAGGGCGCAGCGAGCGTCCTGATCCTTCCGCCCGGACGCTCAGGACAGCGGCCCGCTGCTCATAAGACTCGGCCTTAGAACCCCAGTATCAGCAGAAGGACATTTTAGGACGGGACTTGGGTGACTCTAGGGCACTGGTTTTCTTTCCAGAGAGCGGAACAGGCGAGGAAAAGTAGTCCCTTCTCGGCGATTCTGCGGAGGGATCTCCGTGGGGCGGTGAACGCCGATGATGCCTCTACTAACCATGTTCATGTTTTCTTTTTTTTT CTACAGGTCCTGGGTGACGAACAG(SEQ ID NO：2)
CCAU启动子(含mCMV增强子+hCMV增强子+β-Actin启动子+Ubi增强子)：
ACTGAGTCATTAGGGACTTTCCATTGGGTTTTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTCAATGGGTTTTTCCCATTATTGGCACGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTCCAGCCAATTTAATTAAAACGCCATGTACTTTCCCACCATTGACGTCAATGGGCTATTGAAACTAATGCAACGTGACCTTTAAACGGTACTTTCCCATAGCTGATTAATGGGAAAGTACCGTTCGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTAAAACAGGTAAGTCCGGCCTCCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGGGCGCCCCCCTCCTCACGGCGAGCGCTGCCACGTCAGACGAAGGGCGCAGCGAGCGTCCTGATCCTTCCGCCCGGACGCTCAGGACAGCGGCCCGCTGCTCATAAG ACTCGGCCTTAGAACCCCAGTATCAGCAGAAGGACATTTTAGGACGGGACTTGGGTGACTCTAGGGCACTGGTTTTCTTTCCAGAGAGCGGAACAGGCGAGGAAAAGTAGTCCCTTCTCGGCGATTCTGCGGAGGGATCTCCGTGGGGCGGTGAACGCCGATGATGCCTCTACTAACCATGTTCATGTTTTCTTTTTTTTTCTACAGGTCCTGGGTGACGAACAG(SEQ ID NO：3)
4CAU启动子(含mCMV增强子+hCMV增强子+mCMV增强子+hCMV增强子+β-Actin启动子+Ubi增强子)：
CTGAGTCATTAGGGACTTTCCAATGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAATCAACAGGAAAGTCCCATTGGAGCCAAGTACACTGAGTCAATAGGGACTTTCCATTGGGTTTTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTCAATGGGTTTTTCCCATTATTGGCACGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTCCAGCCAATTTAATTAAAACGCCATGTACTTTCCCACCATTGACGTCAATGGGCTATTGAAACTAATGCAACGTGACCTTTAAACGGTACTTTCCCATAGCTGATTAATGGGAAAGTACCGTTCGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCACTGAGTCATTAGGGACTTTCCAATGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAATCAACAGGAAAGTCCCATTGGAGCCAAGTACACTGAGTCAATAGGGACTTTCCATTGGGTTTTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTCAATGGGTTTTTCCCATTATTGGCACGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTCCAGCCAATTTAATTAAAACGCCAT GTACTTTCCCACCATTGACGTCAATGGGCTATTGAAACTAATGCAACGTGACCTTTAAACGGTACTTTCCCATAGCTGATTAATGGGAAAGTACCGTTCGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTAAAACAGGTAAGTCCGGCCTCCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGGGCGCCCCCCTCCTCACGGCGAGCGCTGCCACGTCAGACGAAGGGCGCAGCGAGCGTCCTGATCCTTCCGCCCGGACGCTCAGGACAGCGGCCCGCTGCTCATAAGACTCGGCCTTAGAACCCCAGTATCAGCAGAAGGACATTTTAGGACGGGACTTGGGTGACTCTAGGGCACTGGTTTTCTTTCCAGAGAGCGGAACAGGCGAGGAAAAGTAGTCCCTTCTCGGCGATTCTGCGGAGGGATCTCCGTGGGGCGGTGAACGCCGATGATGCCTCTACTAACCATGTTCATGTTTTCTTTTTTTTTCTACAGGTCCTGGGTGACGAACAG(SEQ ID NO：4)
典型地，“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如，“最大严紧性”典型地发生在约Tm－5℃(低于探针Tm 5℃)；“高等严紧性”发生在Tm以下约5－10℃；“中等严紧性”发生在探针Tm以下约10－20℃；“低严紧性”发生在Tm以下约20－25℃。作为替代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗涤为依据。例如，6×SSC＝极低严紧性；3×SSC＝低至中等严紧性；1×SSC＝中等严紧性；0.5×SSC＝高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一或近严紧同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80％或更多序列同一性的核酸序列。
对于要求高选择性的应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如，选择相对低的盐和/或高温度条件。Sambrook等(Sambrook,J.等(1989)分子克隆，实验室手册，Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.)提供了包括中等严紧性和高等严紧性在内的杂交条件。
为便于说明，用于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适的中度严紧条件包括：用5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)溶液预洗；在50-65℃下在5×SSC中杂交过夜；随后用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC在65℃下各洗涤两次20分钟。本领域技术人员应当理解，能容易地操作杂交严紧性，如改变杂交溶液的含盐量和/或杂交温度。例如，在另一个实施方案中，合适的高度严紧杂交条件包括上述条件，不同之处在于杂交温度升高到例如60－65℃或65－70℃。
在本发明中，所述在高等严紧条件下与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。
在本发明中，所述对SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列， 是指分别或同时在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和/或序列内部进行例如不超过2－45个，或者不超过2－30个，或者不超过3－20个，或者不超过4－15个，或者不超过5－10个，或者不超过6－8个的分别用逐个连续整数表示的碱基的取代、缺失、添加修饰。
在本发明中，所述对SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列进行如上述一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。
通过一种多核苷酸进行说明，其所具有的核苷酸序列例如与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4的参考核苷酸序列至少具95％的“同一性”是指：在SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4的参考核苷酸序列之每100个核苷酸中，该多核苷酸的核苷酸序列除了含有多达5个核苷酸的不同外，该多核苷酸之核苷酸序列与参考序列相同。换句话说，为了获得核苷酸序列与参考核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸，参考序列中多达5％的核苷酸可被删除或被另一核苷酸替代；或可将一些核苷酸插入参考序列中，其中插入的核苷酸可多达参考序列之总核苷酸的5％；或在一些核苷酸中，存在删除、插入和替换的组合，其中所述核苷酸多达参考序列之总核苷酸的5％。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在这些末端位置之间的任意地方，它们或单独散在于参考序列的核苷酸中，或以一个或多个邻近的组存在于参考序列中。
在本发明中，用于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法是例如BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.25：3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410。采用例如文献中所述或者默认参数，BLAST和BLAST 2.0可以用于确定本发明的核苷酸序列同一性百分数。执行BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心(NCBI)为公众所获得。
在本发明中，所述与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列包括与SEQ ID NO： 1-SEQ ID NO：4所公开序列基本同一的多核苷酸序列，例如当采用本文所述方法(例如采用标准参数的BLAST分析)时，与本发明多核苷酸序列相比含有至少90％序列同一性、优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性的那些序列。
在本发明中，所述与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。
本发明的再一方面涉及一种核酸构建体，包含本发明中任一项所述的多核苷酸，以及可操作地连接的外源基因；具体地，所述外源基因选自p53、GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-24、Trail、p16、TK、IFNγ、TNFα、Rb、Sirpα等中的任意一种或多种；具体地，所述外源基因为SEQ ID NO：12所示p53和/或SEQ ID NO：4所示GM-CSF。
本发明的再一方面涉及一种重组载体，其含有本发明中任一项所述的多核苷酸或者本发明的核酸构建体；具体地，所述重组载体为重组病毒载体；具体地，所述重组载体为本发明中任一项所述的多核苷酸或者本发明的核酸构建体与pDC315质粒或SG655经重组得到的重组载体。
适于构建本发明所述重组载体的克隆载体包括但不限于，例如：pUC18、pUC19、pMD18-T、pMD19-T、pGM-T载体、pDC315系列载体等。
适于构建本发明所述的表达载体包括但不限于，真核表达质粒、重组病毒载体等。
所述真核表达质粒包括但不限于，例如：pCDNA3系列载体、pCDNA4系列载体、pCDNA5系列载体、pCDNA6系列载体、pRL系列载体、pDC315系列载体等。在本发明的一个实施方案中，所述真核表达质粒为pDC315载体。
所述重组病毒载体包括但不限于，例如：重组腺病毒载体、重组 腺相关病毒载体、重组逆转录病毒载体、重组单纯疱疹病毒载体、重组痘苗病毒载体等。在本发明的一个实施方案中，所述重组病毒载体为重组腺病毒载体。
本发明的又一方面还涉及一种含有本发明的启动子或本发明的核酸构建体或本发明的载体的重组细胞。具体地，所述细胞为哺乳动物细胞。在本发明的一个实施方案中，所述哺乳动物细胞为肿瘤细胞。所述肿瘤细胞包括但不限于，例如：原代肝癌细胞、肝癌细胞株(Huh7、Hep3B、HepG2、PLC/PRF/5、SMMC-7721、BEL-7404、BEL7402、BEL-7405、L2.2.15、MHCC97-L、MHCC97-H、QGY-7701、HCCLM3、SK-Hep-1)；原代肺癌细胞、肺癌细胞株(A549、NCI-H460、NCI-H446、NCI-H1299、NCI-H292、NCI-H23)；原代胃癌细胞、胃癌细胞株(SGC-7901、BGC-823、HGC-27)；原代结肠癌细胞、结肠癌细胞株(HT29、colo205、SW620)；原代乳腺癌细胞、乳腺癌细胞株(MCF-7、MDA-MB-453、MDA-MB-468、HTB-122、HTB-133、SK-BR3、T-47D)；原代宫颈癌细胞、宫颈癌细胞株(SK-OV3、HO-8910、Hela)；原代黑色素瘤细胞、黑色素瘤细胞株(A375、A431)；原代胶质瘤细胞、胶质瘤细胞株(A172、U251)；原代骨肉瘤细胞、骨肉瘤细胞株(U2OS)；原代淋巴瘤细胞、淋巴瘤细胞株(Raji、Jurkat、K562)；原代胰腺癌细胞、胰腺癌细胞株(PANC-1、Bxpc-3、Su-86.86)；原代前列腺癌细胞、前列腺癌细胞株(PC-3、DU145)；原代膀胱癌细胞、膀胱癌细胞株(T24)；原代鼻咽癌细胞、鼻咽癌细胞株(CNE-1)等。
本发明的再一方面涉及将本发明的多核苷酸(启动子)或本发明的核酸构建体或本发明的重组载体导入哺乳动物细胞的方法；所述方法包括病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电穿孔等。在本发明的一个实施方案中，所述方法为病毒介导的转化，更具体地为腺病毒介导的转化。
本发明的再一方面涉及一种药用组合物，其包含本发明中任一项所述的多核苷酸或者本发明的核酸构建体或者本发明的重组载体，以及可 选的药学上可接受的辅料。
本发明的再一方面涉及选自如下的(1)或(2)的用途：
(1)本发明中任一项所述的多核苷酸或者本发明的核酸构建体或者本发明的重组载体在制备治疗和/或预防和/或辅助治疗癌症或者抗肿瘤的药物中的用途；具体地，所述癌症或者肿瘤为肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺癌；
(2)本发明中任一项所述的多核苷酸或者本发明的核酸构建体或者本发明的重组载体在制备抑制肿瘤细胞的药物或者试剂中的用途；具体地，所述肿瘤细胞为如下肿瘤的细胞：肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺癌；在具体的实施方案中，所述肿瘤细胞为选自Hep3B、Huh7、HepG2、PLC/PRF/5、BEL-7404、H460和H1299细胞中的任意一种。
本发明的再一方面涉及一种治疗和/或预防和/或辅助治疗癌症或者肿瘤的方法，包括使用有效量的本发明中任一项所述的多核苷酸或者本发明的核酸构建体或者本发明的重组载体或者本发明的药用组合物的步骤；具体地，所述癌症或者肿瘤为肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺癌。
本发明的再一方面涉及一种在体内或体外抑制肿瘤细胞的方法，包括使用有效量的本发明中任一项所述的多核苷酸或者本发明的核酸构建体或者本发明的重组载体或者本发明的药用组合物的步骤；具体地，所述肿瘤细胞为如下肿瘤的细胞：肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺癌；在具体的实施方案中，所述肿瘤细胞为选自Hep3B、Huh7、HepG2、PLC/PRF/5、BEL-7404、H460和H1299细胞中的任意一种。
本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的多核苷酸在作为启动子中的用途。
本发明的再一方面涉及一种分离的多核苷酸，其包含或者为SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列或其互补序列。本发明还涉及该多核苷酸在制备启动子中的用途；具体地，所述启动子为具有启动子功能的前面本发明中任一项所述的多核苷酸。本发明人发现，由该多核苷酸制备的启动子序列稳定，不会随着其在原核细胞或真核细胞内的转移而发生序列丢失现象，并且能够稳定地表达驱动外源基因的表达。
ACTGAGTCATTAGGGACTTTCCATTGGGTTTTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTCAATGGGTTTTTCCCATTATTGGCACGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTCCAGCCAATTTAATTAAAACGCCATGTACTTTCCCACCATTGACGTCAATGGGCTATTGAAACTAATGCAACGTGACCTTTAAACGGTACTTTCCCATAGCTGATTAATGGGAAAGTACCGTTC(SEQ ID NO：20)
在本发明中，术语“可操作地连接”是指两个或多个核苷酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。在本发明的核酸构建体中，例如，启动子被置于所述基因的核酸序列的特定位置，例如启动子位于所述基因核酸序列的上游位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该基因的核酸序列上。所述基因一般是需要提高转录水平的任何核酸序列，或者，可设计本发明所述启动子和基因以便下调特定核酸序列。也就是通过将启动子与反义方向的基因相连来实现。
所述“可操作地连接”可以通过基因重组的手段实现，具体地，所述核酸构建体为重组核酸构建体。在本发明一个具体的实施方式中，所述基因为荧光素酶(luciferase)基因；在本发明另一个具体的实施方式中，所述基因为人类p53基因和GM-CSF基因粒细胞-巨噬细胞 集落刺激因子(GM-CSF)基因。
本发明的启动子(多核苷酸)可以以单拷贝和/或多拷贝的形式应用，也可以与现有技术中已知的启动子联用。
发明的有益效果
本发明提供了一种新的启动子。所述启动子不仅能在肿瘤细胞内广谱高效表达外源基因，而且其在一系列肿瘤细胞中的表达活性高于CAG启动子，且序列稳定(不会在原核细胞及真核细胞转移过程中发生序列丢失)。该启动子可适用于驱动外源基因在肿瘤细胞内的高效表达。
附图说明
图1：pDC315-CCAU-RLuc的载体图谱。
图2：应用腺病毒双荧光素酶报告系统测定各启动子的活性。
图3：11R-p53-2A-GM-CSF表达框的模式图。
图4：病毒SG655-GMP3穿梭载体P74-Tp-GMP3的载体图谱。
图5：病毒SG655-GMP3感染293细胞后表达p53的Western blotting检测图。空白，未感染病毒的293细胞；1，2，3，4，5,6分别代表不同的病毒克隆；Ad-p53，感染Ad-p53病毒。
图6：不同克隆(1#－6#)病毒SG655-GMP3感染293细胞后表达hGM-CSF的定量检测。
图7：SG655-GMP对肝癌细胞Huh7的体外杀伤活性图。
图8：SG655-mGMP抑制Huh7移植瘤体内生长的曲线图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译 的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：携带各启动子核苷酸序列表达载体的构建
1.根据psi-CHECK2质粒(购自Promega公司)中海肾荧光素酶(Renilla luciferase，简称RLuc)基因的编码序列，在首尾设计一对PCR特异性扩增引物(上游引物F1，加EcoRI限制性酶切位点和保护碱基；下游引物R1，加SalI限制性酶切位点和保护碱基)。F1与R1的序列如下：
F1:GCCgaattcGCCACCATGACTTCGAAAGT(SEQ ID NO：5)，其中小写字母代表EcoRI酶切位点
R1：TGTgtcgacTTATTGTTCATTTTTGAGAACTCGCT(SEQ ID NO：6)，其中小写字母代表SalI酶切位点。
以psi-CHECK2质粒为模板，扩增出RLuc基因编码序列，经EcoRI+SalI双酶切，装入同样经EcoRI+SalI双酶切的腺病毒穿梭载体pDC315(购自北京本元正阳公司，含腺病毒左臂、腺病毒包装信号、长末端重复序列)，获得pDC315-CMV-Rluc载体(pDC315含CMV启动子)。
2.按SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4所示核苷酸序列，并在其上游引入XbaI，在其下游引入酶切位点EcoRI，委托上海捷瑞生物公司合成，装入经XbaI+EcoRI双酶切的pDC315-CMV-Rluc载体(替换原pDC315-CMV-Rluc载体中的CMV启动子)，分别命名为pDC315-CAC-RLuc、pDC315-CACU-RLuc、pDC315-CCAU-RLuc(具体载体图谱见图1)、pDC315-4CAU-RLuc。
3.根据pCAGGS载体(购自Addgene质粒库)中CAG启动子的序列，在首尾设计一对PCR特异性扩增引物(上游引物F2，加NheI限制性酶切位点和保护碱基；下游引物R2，加EcoRI限制性酶切位点和保护碱基)。F2与R2的序列如下：
F2:GCCgctagcTCTAGTTATTAATAGTAATCAATT(SEQ ID NO：7)，其中小写字母代表NheI酶切位点
R2：TGTgaattcTTTGCCAAAATGATGAGACAGCAC(SEQ ID NO：8)，其中小写字母代表EcoRI酶切位点。
以pCAGGS质粒为模板，扩增出CAG启动子核苷酸序列，经NheI+EcoRI双酶切，装入经XbaI+EcoRI双酶切的pDC315-Rluc载体(替换原pDC315-CMV-Rluc载体中的CMV启动子)，分别命名为pDC315-CAG-RLuc。
4.将如上各质粒转化DH5α细菌后，委托上海生工对各启动子的DNA序列进行测定，结果发现CAC、CACU、4CAU启动子的DNA序列存在不同程度的丢失现象(不同细菌克隆存在差异)，序列丢失主要发生在mCMV增强子区段中；而CMV、CAG、CCAU启动子的序列保持稳定。
实施例2：携带各启动子核苷酸序列的腺病毒双荧光素酶报告系统的构建
1.根据psi-CHECK2质粒(购自Promega公司)中萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase，简称FLuc)基因的编码序列，在首尾设计一对PCR特异性扩增引物(上游引物F3，加EcoRI限制性酶切位点和保护碱基；下游引物R3，加SalI限制性酶切位点和保护碱基)。F3与R3的序列如下：
F3:GCCgaattcGCCACCATGGAAGACGCC(SEQ ID NO：9)，其中小写字母代表EcoRI酶切位点；
R3：TGTgtcgacTTACACGGCGATCTTTCCGC(SEQ ID NO：10)，其中小写字母代表SalI酶切位点。
以psi-CHECK2质粒为模板，扩增出FLuc基因编码序列，经EcoRI+SalI双酶切，装入同样经EcoRI+SalI双酶切的pENTR12^TM载体(购于Invitrogen公司，由hCMV启动子驱动外源基因表达，含有λ噬菌体位点特异性重组系统的attL1和attL2序列)，获得 pENTR12-Fluc载体。将pENTR12-Fluc质粒和pPE3质粒(购自加拿大MicrobixBiosystems公司，含有λ噬菌体位点特异性重组系统的attR1和attR2序列，ccdB基因，以及5型腺病毒右臂)共同转化BJ5183细菌，通过LR反应重组获得携带Fluc基因及5型腺病毒右臂的骨架质粒pPE3-Fluc。
2.分别将pDC315-CMV-Rluc、pDC315-CAG-Rluc、pDC315-CAC-RLuc、pDC315-CACU-RLuc、pDC315-CCAU-RLuc、pDC315-4CAU-RLuc与pPE3-Fluc通过Lipofectamine共转染至HEK293细胞株(购于美国标准生物品收藏中心，ATCC)，其具体方法参见GIBCOBRL公司的操作说明。共转染后9-14天出现病毒空斑，经过三次病毒空斑纯化，即得携带各启动子核苷酸序列的腺病毒双荧光素酶报告系统，分别命名为Ad-CMV-2Luc、Ad-CAG-2Luc、Ad-CAC-2Luc、Ad-CACU-2Luc、Ad-CCAU-2Luc、Ad-4CAU-2Luc。
以上重组腺病毒在HEK293细胞中大量繁殖，应用氯化铯梯度离心的方法大量纯化腺病毒，然后利用50％组织培养感染剂量(TCID50)法测定病毒滴度(方法参见美国Qbiogene公司的AdEasyTM操作手册)。
3.提取以上腺病毒的基因组，委托上海生工对各启动子的DNA序列进行测定，结果发现CAC、CACU、4CAU启动子的DNA序列同样存在不同程度的丢失现象(不同病毒克隆存在差异)，序列丢失也主要发生在mCMV增强子区段中；而CMV、CAG、CCAU启动子的序列保持稳定。
实施例3：利用携带腺病毒双荧光素酶报告系统测定各启动子的活性
将生长状态良好的低代数HEK293、Hep3B、Huh7、HepG2、PLC/PRF/5、BEL-7404、H460、H1299细胞株(均购自ATCC)分别按1×10⁴cells/孔铺96孔板，置37℃、5％CO₂孵箱培养24小时；按病毒感染复数MOI＝5，分别感染Ad-CMV-2Luc、Ad-CAG-2Luc、 Ad-CAC-2Luc、Ad-CACU-2Luc、Ad-CCAU-2Luc、Ad-4CAU-2Luc等6种重组病毒每组设4个复孔；然后置37℃、5％CO₂孵箱培养；24小时后，裂解细胞，通过双荧光素酶检测试剂盒(购自Promega公司)，置于酶标仪中测定RLuc的酶活性，以FLuc的酶活性为内参，获得RLuc/FLuc的相对比值。具体操作步骤按试剂盒说明书完成。
结果如图2所示。
结果表明，在一系列启动子中，CCAU启动子的活性最稳定，分别在HEK293、Hep3B、Huh7、HepG2、PLC/PRF/5、BEL-7404、H460、H1299中居第2、第2、第1、第1、第1、第1、第2位；其活性分别为CAG启动子在相应细胞中活性的2.8、6.2、2.0、1.8、2.5、4.5、3.5、1.1倍(具体结果见图2)。
结果还表明，本发明的启动子特别是CCAU启动子能够在多种细胞(肿瘤细胞)内发挥启动子功能，具有广谱性，且广谱性高于CAG启动子。
实施例4：重组腺病毒SG655-GMP3的构建
参考公开号为CN103614416A的中国专利申请(申请号为201310460980，公开日为2014年03月05日)。具体步骤如下：
1.合成一段人工第一绝缘子(具体序列如SEQ ID NO：11所示)，并在其上游引入多克隆位点(BglII-XbaI-EcoRI-BamHI-SalI-NheI-HindIII-SpeI)，在其下游引入酶切位点(EcoRV-BglII)，委托上海捷瑞生物公司合成，装入载体片段pCA13载体(BglII)位点之间，构建获得的载体命名为pCA16。pCA13载体购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，是一个腺病毒穿梭载体，含有5型腺病毒左臂序列(bp22-5790)，缺失E1区342至3523bp片段，可用于克隆外源基因并与包含腺病毒右臂的载体包装成腺病毒载体。
2.将CAC启动子序列、SEQ ID NO：3所示CCAU启动子序列分别装入pCA16载体中，构建成功载体分别命名为pCA20、pCA21。
3.根据人11R穿膜肽p53基因(SEQ ID NO：12所示)、人GM-CSF基因(简称hGM-CSF，SEQ ID NO：13)、小鼠GM-CSF基因(简称mGM-CSF，SEQ ID NO：14)、Furin-2A编码序列(SEQ ID NO：15)，分别合成11R-p53-F2A-hGM-CSF(简称hGMP，见图3)与11R-p53-F2A-mGM-CSF，两端引入酶切位点(EcoRI+SalI)，委托上海捷瑞生物公司全基因合成，分别装入pCA20、pCA21载体中，构建成功载体，分别命名为pCA20-hGMP、pCA20-mGMP、pCA21-hGMP、pCA21-mGMP。
4.按SEQ ID NO：16所示序列合成一段DNA长序列，该序列依次包含5型腺病毒原E1A启动子前的一段序列、第二绝缘子、人端粒酶逆转录酶启动子、E1A编码序列、E1A polyA加尾信号序列，两端包含酶切位点EcoRI与BglII，该片段经EcoRI与BglII双酶切后连接到经EcoRI与BglII双酶切后的pXC.1载体(购于加拿大Microbix Biosystem Inc)，构建获得的载体命名为p74-Tp，该载体用人端粒酶逆转录酶启动子替换了腺病毒原来E1A启动子，并删除了E1b 55KDa与19KDa编码区序列。
5.质粒pCA20-hGMP、pCA20-mGMP、pCA21-hGMP、pCA21-mGMP分别经(BglII)酶切后，回收CAG-hGMP-SV40 PolyA-绝缘子、CAG-mGMP-SV40 PolyA-绝缘子、CCAU-hGMP-SV40PolyA-绝缘子、CCAU-mGMP-SV40 PolyA-绝缘子表达框片段，将整个表达框装入经同样酶切后的载体片段p74-Tp(BglII)中，选择反向连接的阳性克隆子，构建成功载体分别命名为p74-Tp-GMP2、p74-Tp-mGMP2、p74-Tp-GMP3(载体图谱如图4所示)、p74-Tp-mGMP3。
6.将纯化获得的p74-Tp-GMP2、p74-Tp-mGMP2、p74-Tp-GMP3、p74-Tp-mGMP3，分别与含有腺病毒基因组右臂的骨架质粒pPE3(购于加拿大Microbix Biosystem Inc)，通过Lipofectamine(购于Invitrogen公司)共转染至HEK293细胞(购于ATCC)内重组，获得重组溶瘤腺病毒SG655-GMP2、SG655-mGMP2、 SG655-GMP3、SG655-mGMP3。
第一绝缘子序列：
AGAGAAATGTTCTGGCACCTGCACTTGCACTGGGGACAGCCTATTTTGCTAGTTTGTTTTGTTTCGTTTTGTTTTGATGGAGAGCGTATGTTAGTACTATCGATTCACACAAAAAACCAACACACAGATGTAATGAAAATAAAGATATTTTATT(SEQ ID NO：11)
人穿膜肽p53基因：
ATGGGCCGCCGCAGGAGACGACGGCGACGGCGAAGAAGGGAGGAGCCGCAGTCAGATCCTAGCGTCGAGCCCCCTCTGAGTCAGGAAACATTTTCAGACCTATGGAAACTACTTCCTGAAAACAACGTTCTGTCCCCCTTGCCGTCCCAAGCAATGGATGATTTGATGCTGTCCCCGGACGATATTGAACAATGGTTCACTGAAGACCCAGGTCCAGATGAAGCTCCCAGAATGCCAGAGGCTGCTCCCCGCGTGGCCCCTGCACCAGCAGCTCCTACACCGGCGGCCCCTGCACCAGCCCCCTCCTGGCCCCTGTCATCTTCTGTCCCTTCCCAGAAAACCTACCAGGGCAGCTACGGTTTCCGTCTGGGCTTCTTGCATTCTGGGACAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTACTCCCCTGCCCTCAACAAGATGTTTTGCCAACTGGCCAAGACCTGCCCTGTGCAGCTGTGGGTTGATTCCACACCCCCGCCCGGCACCCGCGTCCGCGCCATGGCCATCTACAAGCAGTCACAGCACATGACGGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATTTGCGTGTGGAGTATTTGGATGACAGAAACACTTTTCGACATAGTGTGGTGGTGCCCTATGAGCCGCCTGAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCCACTACAACTACATGTGTAACAGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCACCATCATCACACTGGAAGACTCCAGTGGTAATCTAC TGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGTGCCTGTCCTGGGAGAGACCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAGAAAGGGGAGCCTCACCACGAGCTGCCCCCAGGGAGCACTAAGCGAGCACTGCCCAACAACACCAGCTCCTCTCCCCAGCCAAAGAAGAAACCACTGGATGGAGAATATTTCACCCTTCAGATCCGTGGGCGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCGAGAGCTGAATGAGGCCTTGGAACTCAAGGATGCCCAGGCTGGGAAGGAGCCAGGGGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTCCAAAAAGGGTCAGTCTACCTCCCGCCATAAAAAACTCATGTTCAAGACAGAAGGGCCTGACTCAGAC(SEQ ID NO：12)
人GM-CSF基因：
ATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCTGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCAGCACGCAGCCCTGGGAGCATGTGAATGCCATCCAGGAGGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTAGAGACACTGCTGCTGAGATGAATGAAACAGTAGAAGTCATCTCAGAAATGTTTGACCTCCAGGAGCCGACCTGCCTACAGACCCGCCTGGAGCTGTACAAGCAGGGCCTGCGGGGCAGCCTCACCAAGCTCAAGGGCCCCTTGACCATGATGGCCAGCCACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAACCCCGGAAACTTCCTGTGCAACCCAGATTATCACCTTTGAAAGTTTCAAAGAGAACCTGAAGGACTTTCTGCTTGTCATCCCCTTTGACTGCTGGGAGCCAGTCCAGGAGTGA(SEQ ID NO：13)
小鼠GM-CSF基因：
ATGTGGCTGCAGAATTTACTTTTCCTGGGCATTGTGGTCTACAGCCTCTCAGCACCCACCCGCTCACCCATCACTGTCACCCGGCCTTGGAAGCATGTAGAGGCCATCAAAGAAGCCCTGAACCTCCTGGATGACATGCCTGTCACGTTGAATGAAGAGGTAGA AGTCGTCTCTAACGAGTTCTCCTTCAAGAAGCTAACATGTGTGCAGACCCGCCTGAAGATATTCGAGCAGGGTCTACGGGGCAATTTCACCAAACTCAAGGGCGCCTTGAACATGACAGCCAGCTACTACCAGACATACTGCCCCCCAACTCCGGAAACGGACTGTGAAACACAAGTTACCACCTATGCGGATTTCATAGACAGCCTTAAAACCTTTCTGACTGATATCCCCTTTGAATGCAAAAAACCAGGCCAAAAATGA(SEQ ID NO：14)
Furin-2A编码序列：
CGTAAAAGGCGAGCTCCTGTTAAACAGACTTTGAATTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGGCCC(SEQ ID NO：15)
p74-TP载体构建过渡片段序列：
GAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACACCCGTCCTGTGGATCCGGGCCCCCATTTCCCCTCCCTTCCAGCTCTCTGCCCCTTTTGGATTGAAGCCAATATGATAATGAGGGGGTGGAGTTTGTGACGTGGCGCGGGGCGTGGGAACGGGGCGGGTGACGTAGTAGTGTGGCGGAAGTGTGATGTTGCAAGTGTGGCGGAACACATGTAAGCGACGGATGTGGCAAAAGTGACGTTTTTGGTGTGCGCCGGTGTACACAGGAAGTGACAATTTTCGCGCGGTTTTA GGCGGATGTTGTAGTAAATTTGGGCGTAACCGAGTAAGATTTGGCCATTTTCGCGGGAAAACTGAATAAGAGGAAGTGAAATCTGAATAATTTTGTGTTACTCATAGCGCGTAATTTCTAGTAATAAAGGATCCTTTATTTTCATTGGATCCGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGCGGCCGCGTACCGGTCACAGACGCCCAGGACCGCGCTTCCCACGTGGCGGAGGGACTGGGGACCCGGGCACCCGTCCTGCCCCTTCACCTTCCAGCTCCGCCTCCTCCGCGCGGACCCCGCCCCGTCCCGACCCCTCCCGGGTCCCCGGCCCAGCCCCCTCCGGGCCCTCCCAGCCCCTCCCCTTCCTTTCCGCGGCCCCGCCCTCTCCTCGCGGCGCGAGTTTCAGGCAGCGCTGCGTCCTGCTGCGCACGTGGGAAGCCCTGGCCCCGGCCACTCGAGGACGCACGTGGGTTCGAATGAAAATGAGACATATTATCTGCCACGGAGGTGTTATTACCGAAGAAATGGCCGCCAGTCTTTTGGACCAGCTGATCGAAGAGGTACTGGCTGATAATCTTCCACCTCCTAGCCATTTTGAACCACCTACCCTTCACGAACTGTATGATTTAGACGTGACGGCCCCCGAAGATCCCAACGAGGAGGCGGTTTCGCAGATTTTTCCCGACTCTGTAATGTTGGCGGTGCAGGAAGGGATTGACTTACTCACTTTTCCGCCGGCGCCCGGTTCTCCGGAGCCGCCTCACCTTTCCCGGCAGCCCGAGCAGCCGGAGCAGAGAGCCTTGGGTCCGGTTTCTATGCCAAACCTTGTACCGGAGGTGATCGATCTTACCTGCCACGAGGCTGGCTTTCCACCCAGTGACGACGAGGATGAAGAGGGTGAGGAGTTTGTGTTAGATTATGTGGAGCACCCCGGGCACGGTTGCAGGTCTTGTCATTATCACCGGAGGAATACGGGGGACCCAGATATTATGTGTTCGCTTTGCTATATGAGGACCTGTGGCATGTTTGTCTACAGTAAGTGAAAATTATGGGCAGTGGGTGATAGAGTGGTGGGTTTGGTGTGGTAATTTTTTTTTTAATTTTTACAGTTTTGTGGTTTAAAGAATTTTGTATTGTGATTTTTTTAAAAGGTCCTGTGTCTGAACCTGAGCCTGAGCCCGAGCCAGAACCGGAGCCTGCAAGACCTACCCGCCGTC CTAAAATGGCGCCTGCTATCCTGAGACGCCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATGCAATAGTAGTACGGATAGCTGTGACTCCGGTCCTTCTAACACACCTCCTGAGATACACCCGGTGGTCCCGCTGTGCCCCATTAAACCAGTTGCCGTGAGAGTTGGTGGGCGTCGCCAGGCTGTGGAATGTATCGAGGACTTGCTTAACGAGCCTGGGCAACCTTTGGACTTGAGCTGTAAACGCCCCAGGCCATAAGGTGTAAACCTGTGATTGCGTGTGTGGTTAACGCCTTTGTTTGCTGAATGAGTTGATGTAAGTTTAATAAAGGGTGAGATAATGTTTAACTTGCATGGCGTGTTAAATGGGGCGGGGCTTAAAGGGTATATAATGCGCCGTGGGCTAATCTTGGTTACATCTGACCTCATGGAGGCTTGGGAGTGTTAAAGATCT(SEQ ID NO：16)
实施例5：重组腺病毒SG655-GMP3的外源基因表达活性鉴定
HEK293细胞(购于ATCC)按5×10⁵细胞/孔铺在6孔板中，在37℃孵箱5％CO₂培养，第二天换无血清液体1ml，然后按MOI＝5分别加入重组溶瘤腺病毒SG655-GMP3，培养90分钟后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，将病毒洗去，与加入5％胎牛血清的培养液培养，培养48小时后，裂解细胞收集样品，Western Blotting实验检测p53蛋白的表达，以看家基因GAPDH作为内参。
结果如图5所示。
结果表明，相对于对照病毒(Ad-p53，购于深圳市赛百诺基因技术有限公司，表达53KDa的产物)，重组溶瘤腺病毒SG655-GMP3能在HEK293细胞中表达大小约为55KDa的11R-P53融合蛋白，具体如图5所示。
结果还表明，重组溶瘤腺病毒SG655-GMP3表达11R-P53融合蛋白的量高于对照病毒p53蛋白的表达量。
2.分别取重组溶瘤腺病毒SG655-GMP3的各个病毒克隆上清，稀释一定倍数后用人GM-CSF ELISA MAX Deluxe检测试剂盒(购于Biolegend公司)检测该病毒各克隆在HEK293细胞中hGM-CSF 蛋白的表达。结果如图6所示。
结果表明，重组溶瘤腺病毒SG655-GMP3各个克隆均能在HEK293细胞中表达hGM-CSF蛋白，并且表达量较高，各个克隆之间的差异不大。
实施例6：重组溶瘤腺病毒SG655-GMP3和SG655-GMP2在体外对培养的肿瘤细胞的杀伤实验
肝癌细胞株Huh7(购于中国科学院生化与细胞研究所)按1×10⁴细胞/孔铺在96孔板中，在37℃孵箱5％CO₂培养，第二天按不同MOI值梯度加入重组溶瘤腺病毒SG655-GMP2及SG655-GMP3(以5号克隆为例)，每个MOI值设置3个重复，培养7天后，应用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，购于SIGMA公司)法检测细胞生长曲线。
结果如图7所示。
结果表明，SG655-GMP2与SG655-GMP3对肝癌细胞具有良好的杀伤能力，且SG655-GMP3的杀伤效果优于SG655-GMP2，表明CCAU启动子控制治疗基因的体外效果优于CAG启动子。
实施例7：重组溶瘤腺病毒SG655-mGMP3和SG655-mGMP2的动物实验
由于物种差异，人类GM-CSF基因对小鼠DC细胞与巨噬细胞无刺激活性。为研究该病毒的体内功能，本发明同时构建了携带小鼠GM-CSF基因的实验性溶瘤病毒SG655-mGMP。本发明领域的技术人员所知晓，人类GM-CSF基因对人类DC细胞与巨噬细胞的具有良好的刺激活性。因而，对于GM-CSF这个基因而言，SG655-mGMP在小鼠体内的功能，可以直接反映SG655-GMP在人体内的功能。
第一步：4～6周龄BALB/C裸鼠50只，平均重量22～27g，由上海中科院实验动物培育中心提供，清洁级动物实验室饲养。
第二步：体外培育人肝癌细胞Huh7，取对数生长期贴壁生长细 胞，0.25％胰酶消化，离心、收集细胞后用PBS液重悬，3000g室温离心2分钟，弃上清，再用PBS液重悬后离心收集细胞，调整细胞悬液浓度至5×10⁷个/ml。
第三步：于裸鼠右肋背部皮下接种Huh7细胞，0.1ml/只。接种三周左右后，可见接种部位皮下长出米粒大小硬结，移植瘤模型建成。待瘤体直径生长至7-9mm时开始治疗。挑选40只皮下肿瘤生长至7-9mm的Huh7移植瘤进行治疗，将裸鼠随机分分为4组。给药途径为直接瘤内多点注射。
第四步：每日观察小鼠的生活状态并定期测量肿瘤的体积，定期测量一次肿瘤的最长径(A)及其垂直径(B)，按公式(A×B²)/2计算肿瘤的体积，观察不同剂量组的疗效。
结果如图8所示。
结果表明，相对于安慰剂组(注射PBS)，两种基因-溶瘤腺病毒SG655-mGMP均能显著抑制移植瘤的生长(p<0.05)；而由CCAU启动子驱动11R-P53与GM-CSF基因表达的溶瘤腺病毒SG655-mGMP2相对于由CAG启动子驱动的对照溶瘤腺病毒SG655-mGMP2，显示出更强的抑制肿瘤生长作用，肿瘤体积一直明显小于对照病毒组，有显著统计学差异(p<0.05)，具体如图8所示。基因-溶瘤腺病毒SG655-mGMP3对肝癌动物模型的抗肿瘤作用优于SG655-mGMP2，表明CCAU启动子在肿瘤基因治疗中的体内作用优于CAG启动子。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。