使用包含有三株乳酸菌菌株的混合物来改善水产养殖池的溶氧量.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710639568.1 (22)申请日 2017.07.31 (30)优先权数据 106118528 2017.06.05 TW (83)生物保藏信息 CGMCC NO.14166 2017.05.15 (71)申请人 生合生物科技股份有限公司 地址 中国台湾高雄市路竹区北岭六路66号 (72)发明人 张孝东 李蒉名 林金生 (74)专利代理机构 北京林达刘知识产权代理事 务所(普通合伙) 11277 代理人 刘新宇 李茂家 (51)Int.Cl. A01K 61/00(2。

2、017.01) (54)发明名称 使用包含有三株乳酸菌菌株的混合物来改 善水产养殖池的溶氧量 (57)摘要 本发明涉及使用包含有三株乳酸菌菌株的 混合物来改善水产养殖池的溶氧量。 本发明揭示 包含有胚芽乳杆菌BCRC 910435(对应于CGMCC No .3346)、 戊糖片球菌BCRC 910480(对应于 CGMCC No.5235)以及发酵乳杆菌LF26的混合物 可被用来提升水产养殖池的溶氧量， 其中， 发酵 乳杆菌LF26以寄存编号BCRC 910752被寄存于食 品工业发展研究所(FIRDI)的生物资源保存及研 究中心(BCRC)， 以及以寄存编号CGMCC No.14166 被寄。

3、存于中国普通微生物菌种保藏管理中心 (CGMCC)。 权利要求书1页 说明书10页 序列表3页 CN 108967269 A 2018.12.11 CN 108967269 A 1.一种用于提升水产养殖池的溶氧量的方法， 其特征在于， 所述方法包括： 对所述水产 养殖池投予包含有寄存编号是CGMCC No.3346的胚芽乳杆菌BCRC 910435、 寄存编号是 CGMCC No.5235的戊糖片球菌BCRC 910480以及发酵乳杆菌LF26的混合物， 其中， 发酵乳杆 菌LF26以寄存编号BCRC 910752被寄存于食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中 心， 以及以寄存编号CGMCC。

4、 No.14166被寄存于中国普通微生物菌种保藏管理中心。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述水产养殖池是虾类的养殖池。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述虾类选自于由下列所构成的群组： 南 美白对虾、 淡水长臂大虾、 草虾， 以及它们的组合。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述虾类是南美白对虾。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述水产养殖池是鱼类的养殖池。 6.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于， 所述鱼类选自于由下列所构成的群组： 褐 点石斑鱼、 鞍带石斑鱼、 点带石斑鱼， 以及它们的组合。 7.根据权利要求6所述的方法，。

5、 其特征在于， 所述鱼类是褐点石斑鱼。 8.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 在所述混合物当中， 寄存编号是CGMCC No.3346的胚芽乳杆菌BCRC 910435、 寄存编号是CGMCC No.5235的戊糖片球菌BCRC 910480 以及发酵乳杆菌LF26呈范围落在1： 1： 1(w/w/w)至1： 2： 1(w/w/w)内的比例。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 在所述混合物当中， 寄存编号是CGMCC No.3346的胚芽乳杆菌BCRC 910435、 寄存编号是CGMCC No.5235的戊糖片球菌BCRC 910480 以及发酵乳杆菌LF26呈1： 2：。

6、 1(w/w/w)的比例。 10.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述混合物在混合以水产养殖饲料后而 被投予至所述水产养殖池。 11.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述混合物进一步包含有药学上可接受 的载剂。 12.根据权利要求11所述的方法， 其特征在于， 所述药学上可接受的载剂包含一或多种 选自于由下列所构成的群组中的试剂： 溶剂、 缓冲液、 乳化剂、 悬浮剂、 分解剂、 分散剂、 黏结 剂、 赋形剂、 稳定剂、 螯合剂、 稀释剂、 胶凝剂、 润湿剂、 吸收延迟剂、 脂质体以及类似物。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108967269 A 2 使用包含有三。

7、株乳酸菌菌株的混合物来改善水产养殖池的溶 氧量 【技术领域】 0001 本发明有关于一种用于提升水产养殖池的溶氧量的方法， 其包括： 对所述水产养 殖池投予包含有胚芽乳杆菌BCRC 910435(对应于CGMCC No.3346)、 戊糖片球菌BCRC 910480(对应于CGMCC No.5235)以及发酵乳杆菌LF26的混合物， 其中， 发酵乳杆菌LF26 以 寄存编号BCRC 910752被寄存于食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心， 以及以 寄存编号CGMCC No.14166被寄存于中国普通微生物菌种保藏管理中心(保藏编号： 14166； 分类命名： 发酵乳杆菌Lactobac。

8、illus fermentum； 保藏日期： 2017年5月15日； 保藏单位： 中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)； 保藏单位地址： 北京市朝阳区北 辰西路1号院3号)。 【背景技术】 0002 在水产养殖池中， 水产养殖动物的残骸与排泄物以及剩余饲料的持续累积会导致 溶氧量下降， 而此不只会促进厌氧分解作用而产生有毒物质， 还会促进病原菌的生长。 而水 产养殖动物的摄食、 消化、 代谢以及生长的速度以及活动力与抵抗力也皆可能受低溶氧量 影响， 严重者甚至死亡。 例如， 就鱼虾养殖而言， 溶氧量必须分别在4-8mg/L以及6-8mg/L以 上才能满足鱼类与虾类的生长。

9、。 0003 目前用来改善水产养殖池的溶氧量的方法主要包括下面2种： (1)机械增氧： 利用 增氧机的机械作用来促进水体与空气接触， 并且促进水体的对流； 以及(2)化学增氧： 将化 学增氧剂(例如， 过氧化钠、 过氧化钙等)添加至水体中并通过化学反应来释放氧气。 然而， 机械增氧需要大量的增氧机以及能源而大幅提升所需的成本， 至于化学增氧会造成水体中 的金属离子与pH值增加而对水产养殖动物的健康产生不利的影响， 甚至可能会造成有毒物 质残留于其体内进而被摄入人体中。 因此， 发展出低成本且没有安全疑虑的增氧技术， 已成 为一个重要的研发课题。 0004 乳酸菌(lactic acid bac。

10、teria,LAB)是一群能够发酵糖类并以乳酸为主要代谢 产物的革兰氏阳性菌， 它们普遍存在于乳制品、 腌渍品以及人类或动物的肠道黏膜中。 乳酸 菌已广为被接受的形态与生理特征包括： (1)外形为球状(cocci)或杆状(rod)； (2)缺乏细 胞色素及过氧化氢酶(catalase)； (3)不形成内生性孢子； 以及(4)不具运动性。 0005 乳酸菌属于一般被公认为安全的(generally recognized as safe, GRAS)并且 为人所熟悉与广泛使用的益生菌(probiotics)。 乳酸菌已被发现具有抑制肠胃道病原菌生 长、 缓和乳糖不耐症(lactose intole。

11、rance)、 免疫调节(immunoregulation)、 抗癌(anti- cancer)以及降血压等功效。 可作为益生菌使用的乳酸菌有许多种类， 例如乳杆菌属 (Lactobacillus)、 乳球菌属(Lactococcus)、 片球菌属 (Pediococcus)、 链球菌属 (Streptococcus)以及肠球菌属(Enterococcus) 等。 0006 已有研究显示， 一些乳酸菌菌株具有减低水产养殖池的硝酸盐浓度的效用。 例如， 在宋蓉等人(2013)， 淡水渔业， 43:1-8中， 宋蓉等人发现干酪乳杆菌(Lactobacillus 说 明 书 1/10 页 3 CN 。

12、108967269 A 3 casei)L821a能够通过胞内酶解作用(intracellular enzymolysis)以及代谢产物乳酸的 直接与间接作用来去除养殖水体中的硝酸盐。 但就申请人所知， 迄今尚无任何文献或专利 前案曾经揭示乳酸菌菌株具有改善水产养殖池的溶氧量的效用。 0007 在先前研究中， 申请人发现包含有胚芽乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BCRC 910435(对应于CGMCC No.3346)(又被称为胚芽乳杆菌LP28或植物乳杆菌LP28)、 戊糖片球 菌(Pediococcus pentosaceus)BCRC 910480(对应于CGMC。

13、C No.5235)(又被称为戊糖片球 菌PP4012或戊糖片球菌PP49)、 发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、 鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus)、 副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)以及枯草杆菌 (Bacillus subtilis)的混合物(商品名为水益旺)能够改善鱼只的肠胃道功能、 增进鱼虾 的免疫力、 饲料换肉率以及生长速度。 经进一步研究， 申请人意外地发现， 包含有胚芽乳杆 菌BCRC 910435(对应于CGMCC No.3346)、 戊糖片球菌BCRC 910480(对应于CGMCC No。

14、.5235) 以及发酵乳杆菌 LF26的混合物能够改善水产养殖池的溶氧量。 【发明内容】 0008 于是， 本发明提供一种用于提升水产养殖池的溶氧量的方法， 其包括： 对所述水产 养殖池投予包含有胚芽乳杆菌BCRC 910435 (对应于CGMCC No.3346)、 戊糖片球菌BCRC 910480(对应于 CGMCC No.5235)以及发酵乳杆菌LF26的混合物， 其中， 发酵乳杆菌LF26以 寄存编号BCRC 910752被寄存于食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心， 以及以 寄存编号CGMCC No.14166被寄存于中国普通微生物菌种保藏管理中心。 0009 本发明所述用于提。

15、升水产养殖池的溶氧量的方法， 所述水产养殖池是虾类的养殖 池。 0010 本发明所述用于提升水产养殖池的溶氧量的方法， 所述虾类选自于由下列所构成 的群组： 南美白对虾、 淡水长臂大虾、 草虾， 以及它们的组合。 0011 本发明所述用于提升水产养殖池的溶氧量的方法， 所述虾类是南美白对虾。 0012 本发明所述用于提升水产养殖池的溶氧量的方法， 所述水产养殖池是鱼类的养殖 池。 0013 本发明所述用于提升水产养殖池的溶氧量的方法， 所述鱼类选自于由下列所构成 的群组： 褐点石斑鱼、 鞍带石斑鱼、 点带石斑鱼， 以及它们的组合。 0014 本发明所述用于提升水产养殖池的溶氧量的方法， 所述鱼。

16、类是褐点石斑鱼。 0015 本发明所述用于提升水产养殖池的溶氧量的方法， 在所述混合物当中， 胚芽乳杆 菌BCRC 910435(对应于CGMCC No.3346)、 戊糖片球菌BCRC 910480(对应于CGMCC No.5235) 以及发酵乳杆菌 LF26呈范围落在1： 1： 1(w/w/w)至1： 2： 1(w/w/w)内的比例。 0016 本发明所述用于提升水产养殖池的溶氧量的方法， 在所述混合物当中， 胚芽乳杆 菌BCRC 910435(对应于CGMCC No.3346)、 戊糖片球菌BCRC 910480(对应于CGMCC No.5235) 以及发酵乳杆菌 LF26呈1： 2： 。

17、1(w/w/w)的比例。 0017 本发明所述用于提升水产养殖池的溶氧量的方法， 所述混合物在混合以水产养殖 饲料后而被投予至所述水产养殖池。 0018 本发明所述用于提升水产养殖池的溶氧量的方法， 所述混合物进一步包含有药学 上可接受的载剂。 说 明 书 2/10 页 4 CN 108967269 A 4 0019 本发明所述用于提升水产养殖池的溶氧量的方法， 所述药学上可接受的载剂包含 一或多种选自于由下列所构成的群组中的试剂： 溶剂、 缓冲液、 乳化剂、 悬浮剂、 分解剂、 分 散剂、 黏结剂、 赋形剂、 稳定剂、 螯合剂、 稀释剂、 胶凝剂、 润湿剂、 吸收延迟剂、 脂质体以及类 似物。

18、。 【具体实施方式】 0020 本发明的上述以及其它目的、 特征与优点， 在参照以下的详细说明与较佳实施例 后， 将变得明显。 0021 除非另外有所定义， 在本文中所使用的所有技术性与科学术语具有本领域技术人 员所共同了解的意义。 熟悉本技艺者会认知到许多与那些被描述于本文中者相似或等效的 方法和材料， 它们可被用于实施本发明。 当然， 本发明决不受到所描述的方法和材料的限 制。 0022 为了开发低成本且没有安全疑虑的水产养殖池增氧技术， 申请人经戮力研究结果 发现， 包含有胚芽乳杆菌BCRC 910435(对应于 CGMCC No.3346)、 戊糖片球菌BCRC 910480 (对应于。

19、CGMCC No. 5235)以及发酵乳杆菌LF26的混合物具有这方面的产业应用潜力。 于 是， 本发明提供一种用于提升水产养殖池的溶氧量的方法， 其包括： 对所述水产养殖池投予 包含有胚芽乳杆菌BCRC 910435(对应于CGMCC No.3346)、 戊糖片球菌BCRC 910480(对应于 CGMCC No.5235)以及发酵乳杆菌LF26的混合物， 其中， 发酵乳杆菌LF26 以寄存编号BCRC 910752被寄存于食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心， 以及以寄存编号CGMCC No.14166被寄存于中国普通微生物菌种保藏管理中心。 0023 依据本发明， 所述水产养殖池可。

20、以是虾类的养殖池。 较佳地， 所述虾类选自于由下 列所构成的群组： 南美白对虾(Litopenaeus vannamei)(又被称为太平洋白虾)、 淡水长臂 大虾(Macrobrachium rosenbergii)(又被称为罗氏沼虾)、 草虾(Penaeus monodon)(又被 称为斑节对虾)， 以及它们的组合。 在本发明的一个较佳具体例中， 所述虾类是南美白对虾。 0024 依据本发明， 所述虾类的养殖池可具有范围落在50只/平方米至250只/平方米内 的养殖密度(stocking density)。 在本发明的一个较佳具体例中， 所述虾类的养殖池具有 约为91只/平方米的养殖密度。 。

21、0025 依据本发明， 所述水产养殖池可以是鱼类的养殖池。 较佳地， 所述鱼类选自于由下 列所构成的群组： 褐点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)(又被称为龙虎石斑鱼)、 鞍带 石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)(又被称为龙胆石斑鱼)、 点带石斑鱼(Epinephelus coioides)(又被称为青斑)， 以及它们的组合。 在本发明的一个较佳具体例中， 所述鱼类是 褐点石斑鱼。 0026 依据本发明， 所述鱼类的养殖池可具有范围落在5只/平方米至 12只/平方米内的 养殖密度。 在本发明的一个较佳具体例中， 所述鱼类的养殖池具有约为6只/平方。

22、米的养殖 密度。 0027 依据本发明， 在所述混合物当中， 胚芽乳杆菌BCRC 910435(对应于CGMCC No.3346)、 戊糖片球菌BCRC 910480(对应于CGMCC No.5235)以及发酵乳杆菌LF26可以呈范 围落在1： 1： 1(w/w/w)至 1： 2： 1(w/w/w)内的比例。 在本发明的一个较佳具体例中， 胚芽乳杆 菌BCRC 910435(对应于CGMCC No.3346)、 戊糖片球菌BCRC 910480(对应于CGMCC No.5235) 说 明 书 3/10 页 5 CN 108967269 A 5 以及发酵乳杆菌LF26呈1： 2： 1(w/w/w。

23、)的比例。 0028 依据本发明， 所述混合物可具有范围落在105CFU/g至109CFU/g 内的细菌浓度。 在 本发明的一个较佳具体例中， 所述混合物具有范围落在106CFU/g至109CFU/g内的细菌浓度。 0029 依据本发明， 所述混合物可进一步包含有被广泛地使用于药物制造技术的药学上 可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。 例如， 所述药学上可接受的载剂 可包含一或多种选自于由下列所构成的群组中的试剂： 溶剂(solvent)、 缓冲液(buffer)、 乳化剂(emulsifier)、 悬浮剂(suspending agent)。

24、、 分解剂(decomposer)、 分散剂 (dispersing agent)、 黏结剂(binding agent)、 赋形剂(excipient)、 稳定剂(stabilizing agent)、 螯合剂(chelating agent)、 稀释剂(diluent)、 胶凝剂(gelling agent)、 润湿剂 (wetting agent)、 吸收延迟剂 (absorption delaying agent)、 脂质体(liposome)以及类 似物。 有关这些试剂的选用与数量落在本领域技术人员的专业素养与例行技术范畴内。 0030 依据本发明， 所述混合物可使用具有本领域普通技。

25、术人员所熟知的标准技术而被 添加至水产养殖饲料中， 例如， 它可直接地被添加至水产养殖饲料内， 或者它可被用于生成 一或多种中间组合物 (intermediate compositions)诸如， 饲料添加剂(feed additives)或预混料(premixes)， 所述中间组合物随后被添加至水产养殖饲料内。 在本发 明的一个较佳具体例中， 所述混合物在混合以水产养殖饲料后而被投予至所述水产养殖 池。 0031 依据本发明， 所述混合物与水产养殖饲料可以范围落在1： 100(w/w)至1： 999(w/ w)内的比例而被混合。 在本发明的一个较佳具体例中， 所述混合物与水产养殖饲料以1： 。

26、999 (w/w)的比例而被混合。 0032 本发明将就下面的实施例来做进一步说明， 但应了解的是， 所述实施例只是供例 示说明用， 而不应被解释为本发明的实施上的限制。 0033 0034 一般实验材料： 0035 1 .胚芽乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BCRC 910435(对应于 CGMCC No.3346)以及戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus) BCRC 910480(对应于CGMCC No.5235)： 0036 在下面实施例中所使用的胚芽乳杆菌BCRC 910435(又被称为胚芽乳杆菌LP28或 植物乳杆菌LP28)以及戊糖片球。

27、菌BCRC 910480 (又被称为戊糖片球菌PP4012或戊糖片球 菌PP49)已分别于公元 2009年7月14日以及公元2010年7月22日被寄存于台湾的食品工业 发展研究所(Food Industry Research and Development Institute, FIRDI)的生物资源 保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center,BCRC)(300新竹市食品路 331号， 台湾)， 并且已公众可获得。 0037 另外， 这2个菌株也有依据布达佩斯条约(the Budapest Treaty) 的规定， 分别于 公元2009年。

28、10月19日以及公元2011年9月9日以寄存编号CGMCC No.3346以及CGMCC No.5235被寄存于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)， 并且已公众可获得。 0038 2.发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF26： 0039 申请人先前使用乳制品作为样品来源并且利用Difco Lactobacilli MRS琼脂 说 明 书 4/10 页 6 CN 108967269 A 6 (Difco Lactobacilli MRS Agar)。

29、来进行乳杆菌的分离与筛选， 而得到1株乳杆菌分离株 LF26。 所述乳杆菌分离株 LF26经由初步试验而发现， 其为革兰氏阳性杆菌、 不具过氧化氢 酶， 以及在厌氧条件下可生长。 此外， 所述乳杆菌分离株LF26分别经由耐酸性、 耐盐性以及 胆盐耐受性试验而发现， 其可在pH2.0、 5NaCl以及0.3牛胆汁的环境下生存。 0040 所述乳杆菌分离株LF26使用一组具有下面所示核苷酸序列的通用引物对 (universal primer pair)F1与R1而被进行16S rDNA序列分析(委托明欣生物科技有限公 司来进行)， 并且利用NCBI网站所提供的Gene Blast软件来进行比较： 。

30、0041 F1引物 0042 5 -agagtttgatcmtggctcag-3 (序列辨识编号： 1) 0043 R1引物 0044 5 -cggttaccttgttacgactt-3 (序列辨识编号： 2) 0045 而比较结果发现， 所述乳杆菌分离株LF26的部分的16S rDNA 序列(序列辨识编 号： 3)与发酵乳杆菌的16S rDNA序列间具有最高的序列相似性(sequence similarity)。 0046 所述乳杆菌分离株LF26使用一组具有下面所示核苷酸序列的通用引物对F2与R2 而被进行pheS基因序列分析(委托明欣生物科技有限公司来进行)， 并且利用NCBI网站所提 。

31、供的Gene Blast软件来进行比较： 0047 F2引物 0048 5 -cayccngchcgygayatgc-3 (序列辨识编号： 4) 0049 R2引物 0050 5 -ccwarvccraargcaaarcc-3 (序列辨识编号： 5) 0051 而比较结果发现， 所述乳杆菌分离株LF26的部分的pheS基因(序列辨识编号： 6)与 发酵乳杆菌的pheS基因序列间具有最高的序列相似性。 0052 所述乳杆菌分离株LF26进一步利用API 50CHL鉴定系统 (API 50CHL identification system)(bioMrieux)而被进行糖类发酵型态的分析。 所得到。

32、的鉴定结果 被显示于下面的表1中。 0053 表1.乳杆菌分离株LF26的糖类发酵型态分析结果 说 明 书 5/10 页 7 CN 108967269 A 7 0054 说 明 书 6/10 页 8 CN 108967269 A 8 0055 0056 综合上面的各项实验结果， 所述乳杆菌分离株LF26被鉴定是发酵乳杆菌。 所述发 酵乳杆菌LF26已于公元2016年11月3日以寄存编号BCRC 910752被寄存于台湾的食品工业 发展研究所的生物资源保存及研究中心， 以及已于公元2017年5月15日以寄存编号CGMCC No.14166被寄存于中国普通微生物菌种保藏管理中心。 3.实验动物： 。

33、0057 在下面实施例中所使用的南美白对虾(Litopenaeus vannamei)(7 天大， 体重约 为0.0034g)以及褐点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)(244天大， 体重约为324g)分别 购自于高雄市林园区的虾苗养殖场(被称为林园黑壳园区)以及高雄市永安区的石斑鱼苗 养殖场。 所有的实验动物皆被饲养于露天的水产养殖池(aquaculture pond)中， 而且饲料 被充分地供给。 0058 实施例1.制备本发明的含有3株乳酸菌菌株的混合物(a mixture of three lactic acid bacteria strains) 0059 。

34、首先， 将胚芽乳杆菌BCRC 910435(对应于CGMCC No.3346)、 戊糖片球菌BCRC 910480(对应于CGMCC No.5235)以及发酵乳杆菌LF26分别以3(v/v)的接种量接种至4.5L 的下面表2所示的种菌培养基中， 并于37下进行培养历时18小时。 接着， 收取所有的培养 物并分别将之接种至150L的种菌培养基中， 继而于37下进行培养历时16小时。 之后， 将培 养物分别在4下以12 ,000rpm 进行离心历时30分钟， 接着倒除上清液， 而沉淀物 (pellets)以适量的生理食盐水予以洗涤。 在以平板计数培养基来进行菌数计数后， 进行冷 冻干燥处理， 借此。

35、得到各个菌株的冷冻干燥菌粉(各自具有 1011CFU/g的细菌浓度)。 0060 表2.种菌培养基的配方 说 明 书 7/10 页 9 CN 108967269 A 9 0061 0062 之后， 将各个菌株的冷冻干燥菌粉与作为载剂的麦芽糊精 (maltodextrin)以如 下面表3所示的配方进行混合， 借此而得到本发明的含有3株乳酸菌菌株的混合物(具有 109CFU/g的细菌浓度)。 0063 表3.本发明的含有3株乳酸菌菌株的混合物的配方 0064 0065 实施例2.本发明的含有3株乳酸菌菌株的混合物在改善虾类的水产养殖池的溶氧 量上的效用评估 0066 实验方法： 0067 首先， 。

36、将含有约70,400只南美白对虾的水产养殖池作为实验组， 而含有约88,000 只南美白对虾的水产养殖池作为对照组， 各组的养殖密度(stocking density)皆约为91 只/平方米， 而水深皆约为 100厘米。 接着， 依照下面表4所示的时间、 饲料种类以及剂量来 对对照组的水产养殖池投予饲料。 0068 表4.不同时间所投予的饲料种类及其剂量 0069 0070 实验组的水产养殖池的饲料投予大体上参照对照组的投予方式来进行， 不同处在 于： 在被投予前， 饲料先以0.1(w/w)的添加量而被添加以本发明的含有3株乳酸菌菌株的 混合物并予以混合。 各组每天被投予饲料3次， 直到在开始。

37、投予乳酸菌饲料后的第112天结 束。 0071 开始投予乳酸菌饲料后的第49与112天， 使用测氧计(oxygen meter)(厂牌为 Lutron， 型号为DO-5510)来分别测量各组水面下5 厘米以及100厘米处的溶氧量(mg/L)， 以 分别作为上层溶氧量以及底层溶氧量。 0072 所得到的实验数据以 “平均值(mean)平均值的标准误差 (standard error of the mean,SEM)” 来表示。 所有数据通过史徒登氏 t-试验(Student s t-test)来作分析， 以 说 明 书 8/10 页 10 CN 108967269 A 10 评估各组间的差异性。。

38、 若所得到的统计比较结果是p0 .05， 代表有统计学显著性 (statistical significance)。 0073 结果： 0074 各组的溶氧量被显示于下面的表5中。 由表5可见， 实验组的上层溶氧量与底层溶 氧量皆会随着时间而呈现出上升的情形， 而对照组的上层溶氧量与底层溶氧量皆会随着时 间而呈现出下降的情形。 特别地， 在第112天时， 实验组的上层溶氧量与底层溶氧量皆显著 地大于对照组所具者。 这个实验结果显示： 本发明的含有3株乳酸菌菌株的混合物能够有效 地提升虾类的水产养殖池的溶氧量， 而可利于虾类的生长。 0075 表5.各组所测得的溶氧量(mg/L) 0076 00。

39、77 *： 当与对照组作比较， p0.01。 0078 *： 当与对照组作比较， p0.001。 0079 实施例3.本发明的含有3株乳酸菌菌株的混合物在改善鱼类的水产养殖池的溶氧 量上的效用评估 0080 实验方法： 0081 首先， 将两个各别含有约12,000只褐点石斑鱼的水产养殖池分别作为实验组与对 照组， 各组的养殖密度皆约为6只/平方米， 而水深皆约为240厘米。 接着， 依照下面表6所示 的时间、 饲料种类以及剂量来对对照组的水产养殖池投予饲料。 0082 表6.不同时间所投予的饲料种类及其剂量 0083 0084 实验组的水产养殖池的饲料投予大体上参照对照组的投予方式来进行， 。

40、不同处在 于： 在被投予前， 饲料先以0.1(w/w)的添加量而被添加以本发明的含有3株乳酸菌菌株的 混合物并予以混合。 各组每天被投予饲料2次， 直到在开始投予乳酸菌饲料后的第110天结 束。 0085 开始投予乳酸菌饲料后的第82与110天， 使用测氧计来分别测量各组水面下5厘 米、 84厘米以及240厘米处的溶氧量(mg/L)， 以分别作为上层溶氧量、 中层溶氧量以及底层 溶氧量。 0086 结果： 0087 各组的溶氧量被显示于下面的表7中。 由表7可见， 在整个实验期间， 实验组的上层 溶氧量、 中层溶氧量与底层溶氧量皆明显地大于对照组所具者。 这个实验结果显示： 本发明 的含有3株。

41、乳酸菌菌株的混合物能够有效地提升鱼类的水产养殖池的溶氧量， 而可利于鱼 类的生长。 说 明 书 9/10 页 11 CN 108967269 A 11 0088 表7.各组所测得的溶氧量(mg/L) 0089 0090 于本说明书中被引述的所有专利和文献以其整体被并入本申请作为参考数据。 若 有所冲突时， 本申请详细说明(包含界定在内)将占上风。 0091 虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述， 明显地在不背离本发明的范围和精 神下可作出很多的修改和变化。 因此意欲的是， 本发明只受如权利要求书所示者的限制。 说 明 书 10/10 页 12 CN 108967269 A 12 序列表 ? 。

42、? ? 生合生物科技股份有限公司 ? 使用包含有三株乳酸菌菌株的混合物来改善水产养殖池的溶氧量 包含有三株乳酸菌菌株的混合物 ? ? 6 PatentIn version 3.5 1 20 DNA 人工序列 ? ? ? ? ? 用于扩增16S rDNA的F1引物 ? 1 agagtttgat cmtggctcag 20 2 20 DNA 人工序列 ? ? ? ? ? 用于扩增16S rDNA的R1引物 ? 2 cggttacctt gttacgactt 20 3 1538 DNA 发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum) misc_特征 (276)(276) n代表a、 c。

43、、 g或t 3 gctcaggatg aacgccggcg gtgtgcctaa tacatgcaag tcgaacgcgt tggcccaatt 60 gattgatggt gcttgcacct gattgatttt ggtcgccaac gagtggcgga cgggtgagta 120 acacgtaggt aacctgccca gaagcggggg acaacatttg gaaacagatg ctaataccgc 180 ataacaacgt tgttcgcatg aacaacgctt aaaagatggc ttctcgctat cacttctgga 240 tggacctgcg gt。

44、gcattagc ttgttggtgg ggtaanggcc taccaaggcg atgatgcata 300 gccgagttga gagactgatc ggccacaatg ggactgagac acggcccata ctcctacggg 360 aggcagcagt agggaatctt ccacaatggg cgcaagcctg atggagcaac accgcgtgag 420 序 列 表 1/3 页 13 CN 108967269 A 13 tgaagaaggg tttcggctcg taaagctctg ttgttaaaga agaacacgta tgagagtaac 480 。

45、tgttcatacg ttgacggtat ttaaccagaa agtcacggct aactacgtgc cagcagccgc 540 ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg atttattggg cgtaaagaga gtgcaggcgg 600 ttttctaagt ctgatgtgaa agccttcggc ttaaccggag aagtgcatcg gaaactggat 660 aacttgagtg cagaagaggg tagtggaact ccatgtgtag cggtggaatg cgtagatata 720 tggaagaaca ccagtggcg。

46、a aggcggctac ctggtctgca actgacgctg agactcgaaa 780 gcatgggtag cgaacaggat tagataccct ggtagtccat gccgtaaacg atgagtgcta 840 ggtgttggag ggtttccgcc cttcagtgcc ggagctaacg cattaagcac tccgcctggg 900 gagtacgacc gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 960 catgtggttt aattcgaagc tacgcgaaga accttac。

47、cag gtcttgacat cttgcgccaa 1020 ccctagagat agggcgtttc cttcgggaac gcaatgacag gtggtgcatg gtcgtcgtca 1080 gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg ttactagttg 1140 ccagcattaa gttgggcact ctagtgagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1200 cgacgtcaga tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca a。

48、tggacggta 1260 caacgagtcg cgaactcgcg agggcaagca aatctcttaa aaccgttctc agttcggact 1320 gcaggctgca actcgcctgc acgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1380 cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatgaga gtttgtaaca 1440 cccaaagtcg gtggggtaac cttttaggag ccagccgcct aaggtgggac agatgattag 1500 ggtgaagtcg taacaaggta gccgtaggag aacctgcg 。