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1、10申请公布号CN104212809A43申请公布日20141217CN104212809A21申请号201410472119922申请日20140917C12N15/12200601C07K14/47200601A01K67/02720060171申请人山东农业大学地址271018山东省泰安市岱宗大街61号72发明人王建民张春兰纪志宾王桂芝秦孜娟候磊54发明名称一种调控小尾寒羊骨骼肌生长的MYL2基因及其应用57摘要本发明属于生物技术领域，提供了一种调控小尾寒羊骨骼肌生长的MYL2基因CDNA序列及其克隆方法，该基因的CDNA序列如SEQIDNO1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO2所。
2、示。可以通过对该基因的表达调控进行操作，为培育生长速度快的绵羊品种奠定基础，具有重要的现实意义。51INTCL权利要求书1页说明书7页序列表6页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页序列表6页附图2页10申请公布号CN104212809ACN104212809A1/1页21一种调控小尾寒羊骨骼肌生长的MYL2基因，其特征在于具有如SEQIDNO1所示的CDNA序列，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。2根据权利要求1所述的MYL2基因，其特征在于其来源于小尾寒羊骨骼肌的肌球蛋白轻链2。3权利要求1所述的调控骨骼肌生长的MYL2基因，在绵羊育种中的。
3、应用。4根据权利要求3所述的应用，其特征在于通过对MYL2基因的表达进行调控，为培育生长速度快的绵羊品种奠定基础。权利要求书CN104212809A1/7页3一种调控小尾寒羊骨骼肌生长的MYL2基因及其应用技术领域0001本发明属于分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种可以调控小尾寒羊骨骼肌生长的MYL2基因及其在绵羊育种中的应用。背景技术0002肌球蛋白轻链2MYL2为肌球蛋白轻链家族中的一员，为一种调节性轻链，主要对肌纤维的活性起调控作用。研究报道MYL2的磷酸化可使肌球蛋白重链上ATP酶的活性增加，从而使肌球蛋白的类型发生转变，并且发现该基因在在成熟肌肉中表达而在培养的鼠C2C12成肌。
4、细胞分化过程中不表达。说明MYL2基因可能调控肌细胞的生长和发育，从而影响肌肉的生长速度和肌肉品质。0003目前，还未见到有关于小尾寒羊的MYL2基因的序列报道，并且关于该基因对肌肉生长和发育的调控还不清楚。发明内容0004基于上述的原因，本发明提供了一种可以调控小尾寒羊骨骼肌生长的MYL2基因，其CDNA序列如SEQIDNO1所示，除POLYA外长为776BP；该序列中的开放读码框编码166个氨基酸，氨基酸序列如SEQIDNO2所示。该基因具有调控骨骼肌生长的功能，应用该基因可以通过对该基因的表达调控进行操作，为实现培育生长速度快的绵羊品种奠定基础。0005本发明所提供的调控小尾寒羊骨骼肌生。
5、长的MYL2基因，其CDNA序列如SEQIDNO1所示，除POLYA外长为776BP；该序列中的开放读码框编码166个氨基酸，氨基酸序列如SEQIDNO2所示。0006上述的MYL2基因是通过如下方法获得的00071小尾寒羊肌肉总RNA的提取和反转录0008采用TRIZOL法提取小尾寒羊肌肉组织总RNA，提取的RNA以AGILENT2100BIOANALYZER进行检测，要求总RNA含量在10G以上且RINRNA完整性指标75，并根据现有技术经ROCHE公司的CDNA反转录试剂盒反转录合成CDNA第一链；00092MYL2基因CDNA序列保守区的扩增0010比对已有物种MYL2基因的CDNA序。
6、列，根据保守区设计上下游引物，以步骤1中的CDNA第一链为模板进行PCR扩增克隆测序得到保守区序列；00113应用3降落巢式PCR法对MYL2基因CDNA序列的3端进行扩增0012根据所得保守区序列设计MYL2基因的3特异内侧和外侧引物；0013以3特异外侧引物和3通用外侧引物采用退火温度逐渐降落法对上述CDNA第一链进行第一轮PCR扩增；0014然后以3特异内侧引物和3通用内侧引物采用同样的退火温度逐渐降落法对第一轮PCR扩增产物进行第二轮PCR扩增；说明书CN104212809A2/7页40015对第二轮PCR产物经克隆测序得到MYL2基因CDNA序列的3端序列；00164应用5RACE法。
7、对MYL2基因CDNA序列的5端进行扩增0017对小尾寒羊肌肉组织经TRIZOL法所提总RNA依次进行常规的去磷酸化处理、“去帽子”反应、与接头序列连接并以TAKARA公司的5FULLRACEKITWITHTAP试剂盒反转录合成CDNA的第一链；0018根据所得保守区序列设计MYL2基因的5特异外侧和特异内侧引物；0019以5特异外侧和5通用外侧引物进行第一轮PCR扩增；0020以5特异内侧和5通用内侧引物进行第二轮PCR扩增；0021内侧PCR产物经克隆测序得到MYL2基因CDNA序列的5端序列；00225全长序列拼接及克隆测序验证0023根据重叠区域对上述步骤获得的CDNA的保守区、5和3。
8、所得序列进行拼接，获得MYL2基因的全长CDNA序列；设计两端序列为上下游引物，PCR扩增并克隆测序得到MYL2基因的全长CDNA序列，具有如SEQIDNO1的核苷酸序列。0024对该CDNA序列进行生物信息学分析，得到该基因编码产生含有166个氨基酸的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO2所示。0025之后发明人利用QRTPCR法测定MYL2基因在小尾寒羊心、肝、肌肉等组织中的表达量，发现该基因主要在小尾寒羊的心肌和背最长肌中表达，表明该基因具有调控骨骼肌生长的功能。0026综上所述，本发明提供了一种可以调控小尾寒羊骨骼肌生长的MYL2基因，该基因具有调控骨骼肌生长的功能，应用该基因可以通过。
9、对该基因的表达调控进行操作，为实现培育生长速度快的绵羊品种奠定基础。附图说明0027图1为本发明中小尾寒羊MYL2基因CDNA保守区扩增图，0028图中M为DL2000分子量标准；另一条为MYL2基因CDNA保守区序列；0029图2为本发明中小尾寒羊MYL2基因3端扩增图，0030图中M为DL2000分子量标准；另一条为MYL2基因CDNA的3端序列；0031图3为本发明中小尾寒羊MYL2基因5RACE扩增图，0032图中M为DL2000分子量标准；另一条为MYL2基因CDNA的5端序列；0033图4为本发明中小尾寒羊MYL2基因CDNA全长序列扩增图，0034图中M为DL2000分子量标准；。
10、另一条为MYL2的全长CDNA序列；0035图5为本发明中MYL2在小尾寒羊不同组织中的表达水平柱状图，0036图中A、B、C表示小尾寒羊各组织间的差异显著性P005；MYL2主要在心肌和背最长肌中表达。具体实施方式0037以下结合附图对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。应理解，这些实施例仅为了说明本发明而不是为了限制本发明的保护范围。0038下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照制造厂商所建议的实验条说明书CN104212809A3/7页5件或常规方法，如SAMBROOK等编著的分子克隆实验手册NEWYORKCOLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS,198。
11、9中所述的条件。0039实施例1小尾寒羊背最长肌组织总RNA的提取及反转录0040取小尾寒羊背最长肌约20G，使用康为世纪公司的总RNA提取试剂盒NOCW0580提取肌肉组织的总RNA；将提取的RNA采用ROCHE公司的CDNA反转录试剂盒NO05081955001反转录合成CDNA第一链，20保存备用。0041实施例2CDNA保守区序列的克隆与测序00421引物的设计从NCBI上下载人、猪、牛、鼠等各物种MYL2基因的CDNA序列，以DNAMAN60软件进行比对获得保守区序列，设计该基因CDNA的保守区引物为F1GGACTGTGGGATTCTTCTG，如SEQIDNO3所示，和F2TTTGC。
12、TCGACCTCCTTTT，如SEQIDNO4所示；00432PCR扩增以实施例1获得的CDNA第一链为模板，采用TIANGEN的PCRMASTERMIX试剂盒KT201进行PCR扩增；50L扩增体系中包含PCRMASTERMIX25L；F1102L；F2102L；CDNA第一链2L。扩增条件为94，5MIN；9430S，5230S，721MIN35CYCLES；72，10MIN。扩增结果见附图1；00443扩增条带的回收PCR扩增产物经1琼脂糖的TAE凝胶进行电泳凝，切取相应条带；采用AXYPREPDNA凝胶回收试剂盒0691对PCR产物进行纯化回收；00454回收产物与载体连接载体与片段的。
13、摩尔比控制在1318；根据扩增产物回收后凝胶电泳情况将回收产物稀释至标准浓度，依PMD18T载体试剂盒说明书NO6011进行连接反应。00465连接产物的转化取适量连接产物，依TIANGEN公司的大肠杆菌感受态细胞DH5CB101使用说明进行转化及细菌的培养操作；00476菌液PCR鉴定吸取12L菌液作模板，依据2中PCR扩增体系和条件进行扩增，1琼脂糖凝胶电泳检测目的条带；00487克隆产物的测序分析如果凝胶检测含有目的条带且较纯，则吸取1ML菌液测序分析，得到长为675BP的一条保守区目标序列。0049实施例3CDNA3端序列的克隆与测序0050采用降落巢式PCR法克隆CDNA序列的3端，。
14、具体步骤如下00511引物的设计与合成根据实施例2所得MYL2基因CDNA保守区的测序结果，设计两条上游嵌套式引物，3GSPGGCTGATTATGTCAAGGAGATGC，如SEQIDNO5所示，和3NGSPCTTTGGGTGGGCAGATGGGGGCA，如SEQIDNO6所示；并合成两条下游3通用引物，3UPGACTCGAGTCGATCGA，如SEQIDNO7所示，和OLIGODTAPGACTCGAGTCGATCGAT18，如SEQIDNO8所示。00522反转录合成CDNA第一链取100PG1G实施例1中提取的RNA，加入OLIGODTAP为反转录引物反转录合成CDNA第一链；00533外。
15、侧PCR扩增以3GSP和OLIGODTAP为上下游引物，依实施例2中PCR反应试剂盒体系进行，扩增程序为98，30S；98，10S；70，30S；72，30S3CYCLES；98，10S；68，30S；72，30S4CYCLES；98，10S；66，30S；72，30S5CYCLES；98，10S；64，30S；72，30S6CYCLES；98，10S；62，30S；72，30S8CYCLES；说明书CN104212809A4/7页698，10S；60，30S；72，30S10CYCLES；72，10MIN；4；00544内侧PCR扩增以3NGSP和3UP为上下游引物，步骤3的扩增产物稀释30。
16、倍为模板，依上述步骤3中反应条件和扩增程序进行目的条带的扩增，扩增结果见附图2；00555PCR产物的克隆测序扩增条带的回收、与载体连接、连接产物的转化及测序同实施例2，得到长为212BP的一条序列。0056实施例4CDNA5端序列的克隆与测序0057采用5RACE法克隆5端序列，步骤如下00581引物的设计与合成根据实施例3所得MYL2基因CDNA保守区的测序结果，设计两条下游嵌套式引物，5GSPCCACTCCCTTAGTCCTTCTCTTC，如SEQIDNO9所示，和5NGSPGAATGCGTTGAGAATGGTC，如SEQIDNO10所示；并合成两条上游5通用引物，5OUTERPRIME。
17、RCATGGCTACATGCTGACAGCCTA，如SEQIDNO11所示，和5INNERPRIMERCGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG，如SEQIDNO12所示。00592MRNA的去磷酸化处理0060配制去磷酸反应液00610062混匀，50反应1H；0063加入20LCH3COONA3MOL/L，PH52，然后加入130L的无RNASE水后轻轻混匀。并加入200L苯酚/氯仿/异戊醇25241，混匀后于室温13000G离心5MIN，取上层水相；0064加入02ML氯仿，吹打混匀后于室温13000G离心5MIN；0065取上层水相加入2LNACARRIER后。
18、均匀混匀，再加入02ML异丙醇，混匀后冷却10MIN于冰上，并于4，13000G离心20MIN，弃上清；0066加入500L的预冷的70乙醇进行漂洗，13000G离心5MIN4，弃上清后开盖于室温放置2MIN充分干燥；0067加入7L无RNASE水溶解沉淀，得到CIAPTREATEDRNA。00683“去帽子”反应0069配制“去帽子”反应液0070说明书CN104212809A5/7页70071将上述试剂混匀，37，反应1H，得到CIAP/TAPTREATED的RNA。007245RACE接头的连接0073依下表配制溶液0074007565保温5MIN后，放置2MIN冰上，然后加入下述试剂0。
19、076007716，反应1H；0078加入20L的CH3COONA3MOL/L，PH52于以上反应液中，然后加入140L的无RNASE水，再加200L苯酚/氯仿/异戊醇25241，吹打混匀后于室温、13000G离心5MIN；0079取出上层水相，加入200L氯仿，充分混匀后于13000G离心5MIN，取上层水相加入2LNACARRIER后均匀混匀，再加入200L异丙醇，混匀后于冰上冷却10MIN；00804，13000G离心20MIN，弃上清。加入500L预冷的70乙醇漂洗，13000G于4离心5MIN，弃上清后干燥；0081加入6LFREERNASE水溶解沉淀，得到LIGATEDRNA。00。
20、825反转录合成CDNA第一链0083反转录体系为0084说明书CN104212809A6/7页80085混匀后于30反应10MIN，然后于42反应1H后70反应15MIN生成反转录产物，20保存备用。00866外侧PCR扩增以5OUTERPRIMER和5GSP为上下游引物，以5中反转录合成的CDNA第一链为模板，扩增体系为00870088扩增程序为94，3MIN；94，30S；55，30S；72，30S20CYCLES；72，10MIN；4；00897内侧PCR扩增以外侧PCR产物为模板，扩增体系为00900091扩增程序为94，3MIN；94，30S；55，30S；72，30S30CYCL。
21、ES；72，10MIN；4。反应结束后，取35LPCR反应液进行电泳检测，扩增结果见附图3，产生了大小不同的两条带。00928PCR产物的克隆测序扩增条带的回收、与载体连接、连接产物的转化及测序同实施例2，经测序得到359BP的一条序列。0093实施例5全长CDNA序列的拼接与克隆测序0094根据重叠区域对实施例2、3和4中所得序列进行常规拼接，设计两端序列为上下游引物，引物序列分别为F1GGGCAGACCGTGGGATTCTTC，如SEQIDNO13所示，和F2ACACGACCTCCTTTTTATTTG，如SEQIDNO14所示。经PCR扩增、克隆测序同实施例2，获得MYL2基因的CDNA全。
22、长序列，长为776BP，序列见SEQIDNO1。0095实施例6CDNA编码蛋白的氨基酸序列分析说明书CN104212809A7/7页90096登录HTTP/GENESMITEDU/GENSCANHTML分析MYL2的CDNA序列，确定该基因编码蛋白的氨基酸序列。其编码区编码166个氨基酸，具有如SEQIDNO2所述的氨基酸序列。0097实施例7小尾寒羊各组织中MYL2基因的表达分析00981小尾寒羊各种组织的采取选取小尾寒羊母羊三只，分别取心、肝、肺、脾、肾、背最长肌、脂肪、卵巢、血管和胃组织25G，立即投入液氮保存备用。00992组织RNA的提取及反转录取各种组织2G左右，总RNA的提取及。
23、反转录合成CDNA第一链方法同实施例1。01003设计荧光定量PCR引物从两条CDNA序列的5端设计扩增片段长度为80200BP的荧光定量PCR引物，引物序列如下010101024QRTPCR反应以GAPDH为内参基因，依照TAKARA公司的PREMIXEXTAQTMDRR081A说明书加样，反应体系为15L，具体成份如下01030104将上述试剂混匀，所有反应一式三份，采用SYBRGREENI染料法在MX3000P荧光定量仪上以两步法进行PCR扩增95预变性10MIN；9530S，6030S，7220S40CYCLES。01055结果的分析统计反应结果经MX3000P配套软件对所得CT值进行。
24、初步分析。每个基因表达的相对值根据标准曲线运用法进行计算，基因的表达水平表示为用SAS81软件中的ONEWAYANOVA法进行差异显著性分析，差异显著性表达水平为P005。各组织间MYL2的表达水平见附图5。0106定量PCR结果表明，MYL2在这十种组织中均有表达，而在心肌中表达量最高，其次为背最长肌，说明通过调控MYL2基因的表达量增加，可应用于培育生长速度快的绵羊进行育种。说明书CN104212809A1/6页1000010002序列表CN104212809A102/6页110003序列表CN104212809A113/6页120004序列表CN104212809A124/6页130005序列表CN104212809A135/6页140006序列表CN104212809A146/6页15序列表CN104212809A151/2页16图1图2图3图4说明书附图CN104212809A162/2页17图5说明书附图CN104212809A17。