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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610373521.0 (22)申请日 2016.05.31 (71)申请人 东北林业大学 地址 150040 黑龙江省哈尔滨市香坊区和 兴路26号 申请人 齐凤慧 詹亚光 (72)发明人 齐凤慧 詹亚光 景天忠 陈思齐 崔丽婷 曾凡锁 由香玲 范桂枝 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (54)发明名称 一种利用悬浮培养技术快速繁殖水曲柳的 方法 (57)摘要 本发明公开了一种利用悬浮培养技术快速 繁殖水曲柳的方法， 选取水曲柳种子， 用酒精溶 。
2、液浸泡， 无菌水冲洗， 放入次氯酸钠溶液中消毒， 之后再用无菌水冲洗， 取出成熟胚接种于种子萌 发培养基中培养， 7-10d后转入液体增殖培养基 中进行培养15-20天， 将侧芽切下， 继续转入液体 增殖培养基中培养， 将健壮的苗驯化一周后移栽 入灭菌处理的基质中直至幼苗成活。 本发明的优 点在于用悬浮培养法诱导水曲柳快繁实用技术 方法简便， 打破了由于种子发芽率低而造成的生 产瓶颈， 缩短培养周期， 提高了繁殖系数， 减少了 组培实验过程中过多的人力和物力的消耗， 从根 本上提高了工作效率， 节约了生产成本， 并能达 到工厂化育苗的目的。 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 CN 1059。
3、41155 A 2016.09.21 CN 105941155 A 1.一种利用悬浮培养技术快速繁殖水曲柳苗木的方法， 其特征在于， 所述方法采用无 菌苗作为悬浮物。 2.根据权利要求1所述悬浮培养技术快速繁殖水曲柳苗木的方法， 其特征在于， 所述方 法包括以下步骤： (1)通过无菌培养技术， 以水曲柳优良苗木成熟胚为材料， 诱导获得水曲柳无菌苗； (2)将步骤(1)所得的水曲柳无菌苗至于液体增殖培养基中， 在白天光照强度为2000- 3000Lux， 光照时间12-14h/d， 温度251， 夜间温度181条件下， 至于摇床上进行震荡 培养， 15-20天顶芽快速生长， 侧芽分化， 根也形成。
4、， 将侧芽切下， 继续转入增殖培养基中培 养； (3)将步骤(2)所得的无菌苗进行炼苗移栽。 3.根据权利要求2所述悬浮培养技术快速繁殖水曲柳苗木的方法， 其特征在于所述步 骤(2)中的悬浮培养基为WPM基本培养基+6-BA 0.5-4.0mg/L+NAA 0.01-2.0mg/L+蔗糖20- 35g/L， pH值5.8-6.0。 4.根据权利要求2所述悬浮培养技术快速繁殖水曲柳苗木的方法， 其特征在于所述步 骤(2)中摇床的转速为100-125rpm。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105941155 A 2 一种利用悬浮培养技术快速繁殖水曲柳的方法 技术领域 0001 本发明涉。
5、及一种利用悬浮培养技术快速繁殖水曲柳苗木的方法， 属于林木组培繁 育技术领域。 背景技术 0002 水曲柳(Fraxinus mandschurica Rupr.)木犀科， 白蜡树属， 高大落叶乔木。 自然 生长环境下15年到20年才开花结果实， 果实的生长期为9月到10月。 水曲柳是古老的残遗植 物， 分布区较广， 但多为散生， 是我国东北素有 “三大硬阔” 之称的珍贵树木之一， 木材材质 优良， 纹理美观， 广泛应用于各领域。 由于水曲柳开发历史较早， 近年来其天然林资源越来 越少， 由于过量采伐， 以至于其数量与日俱减， 目前不仅成材树木少之又少， 就连分布地区 也严重缩减。 国家对这种。
6、濒危植物采取多种措施， 因而在个别地区的自然保护区有少量分 布。 0003 因此， 加强水曲柳优良苗木繁殖， 以满足林木育种的需求， 变成了亟待解决的问 题。 据调查发现， 用种子繁殖的苗木中， 有5-7的超级苗， 其生长量超过该批苗木平均高 的2倍。 如果能够把这些优良苗木扩繁， 用于造林， 则有望提高人工林生长速度。 如今水曲柳 种苗的繁育及栽培技术已成为制约育种及其加工品发展的瓶颈， 而文献中关于水曲柳的种 苗繁育报道甚少。 0004 目前， 已发表的研究结果主要集中在未成熟胚的离体培养(张惠君等， 2003)、 下胚 轴不定芽诱导(谭燕双等， 2003)、 腋芽培养(张丽杰等， 200。
7、7)、 体细胞胚与合子胚发生的细 胞学研究(孔冬梅等， 2006)、 嫩茎尖培养(顾地周， 2010)等方面， 这些研究结果都比较初步， 尚未达到实际生产性应用的水平。 上述研究材料多数选择腋芽、 嫩茎尖， 水曲柳树形高大， 材料有极大的限制性， 而且水曲柳内部微生物的污染控制较难， 因此即使进行增殖培养， 也 因污染造成增殖失败， 张惠君的研究选择未成熟胚， 但在继代分化时分化率低， 没有达到组 织培养快速繁殖苗木的要求。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种快速繁殖水曲柳的方法。 该方法可以明显促进水曲柳 分化、 壮苗、 生根， 从而为水曲柳工业化生产育苗， 优树资源繁殖提供技术支。
8、持。 0006 为了达到上述目的， 本发明水曲柳优良品种的种子， 经过外植体消毒， 取其成熟胚 培养， 之后利用液体悬浮培养技术， 添加植物激素诱导， 使水曲柳在短时间内快速分化、 壮 苗和生根， 建立了利用悬浮培养技术快速繁殖水曲柳的体系。 0007 一种利用悬浮培养技术快速繁殖水曲柳苗木的方法， 该方法采用无菌苗作为悬浮 物进行培养。 0008 一种利用悬浮培养技术快速繁殖水曲柳苗木的方法， 包括以下步骤： 0009 (1)通过无菌培养技术， 得到水曲柳无菌苗： 取水曲柳优良苗木种子， 在无菌环境 中用70乙醇浸泡30-60s， 然后水洗3次， 每次1-2min； 再将种子移入用10次氯酸。
9、钠溶液 说 明 书 1/3 页 3 CN 105941155 A 3 中， 消毒12-20min， 然后水洗5-6次， 每次1-5min； 用无菌刀将种子顶端切开， 取出完整胚， 接 种到种子萌发培养基中， 置于组培室， 昼夜光照周期培养条件为： 白天光照强度为1500- 3000Lux， 光照时间12-14h/d， 温度25+1； 夜间温度181； 7-10d后种子萌发， 获得无菌 苗； 0010 其中： 种子萌发培养基配方是： WPM基本培养基+蔗糖20-35g/L+琼脂4-5g/L， pH值 5.8-6.0； 0011 (2)水曲柳快速繁殖方法的建立： 将步骤(1)获得的无菌苗转接于快繁。
10、增殖培养基 中， 置于摇床上震荡培养， 转速为100-125rpm； 昼夜光照周期培养条件为： 白天光照强度为 2000-3000Lux， 光照时间12-14h/d， 温度251； 夜间温度181； 15-20天顶芽快速生 长， 侧芽分化， 根也形成， 增殖倍数4-6倍， 将侧芽切下， 继续转入增殖培养基中； 0012 其中： 快繁增殖培养基配方是： WPM基本培养基+6-BA 0.5-4.0mg/L+NAA 0.01- 2.0mg/L+蔗糖20-35g/L， pH值5.8-6.0； 0013 (3)炼苗转移： 将步骤(2)健壮幼苗于组培瓶中移至自然环境条件下3天， 打开组培 瓶盖5天驯化练苗。
11、， 经过驯化炼苗一周后移栽入灭菌处理的草炭土： 落叶松腐殖质： 蛭石 2:1:1中， 上覆薄膜， 浇水， 保持空气湿度， 一周后逐渐打开薄膜， 直至幼苗成活。 0014 与现有技术相比， 本研究选择成熟胚， 很好的继承了超级苗的优良特性， 而且， 本 研究利用液体悬浮培养技术， 分化与生根同时进行， 打破了悬浮培养只可培养细胞不可培 养苗木的结论， 悬浮培养体系的建立， 也为后期利用生物反应器培养及工业化生产奠定了 基础。 0015 同时本发明采用悬浮培养法诱导水曲柳快繁实用技术方法简便， 从外植体诱导到 植株繁殖， 移栽炼苗整个培养周期打破传统组培繁殖方式， 将芽诱导和生根培养一步完成， 缩。
12、短培养周期， 提高了繁殖系数， 减少了组培实验过程中过多的人力和物力的消耗， 从根本 上提高了工作效率， 节约了生产成本， 并能达到工厂化育苗的目的。 附图说明 0016 图1水曲柳悬浮培养无菌苗 具体实施方式 0017 下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。 0018 本发明采用WPM为基础培养基， 配置不同植物生长物质的组合： 0019 水曲柳种子萌发培养基： WPM基本培养基+蔗糖20/L+琼脂4.5g/L， pH值5.8-6.0； 0020 水曲柳快繁增殖培养基： WPM基本培养基+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.15mg/L+蔗糖20g/ L， pH值5.8-6.0； 00。
13、21 本发明按照以下步骤进行： 0022 (1)取水曲柳优良苗木种子， 在无菌环境中用70乙醇浸泡30-60s， 然后水洗3次， 每次1-2min； 0023 (2)再将种子移入用10次氯酸钠溶液中， 消毒15min， 然后水洗5-6次， 每次1- 2min； 0024 (3)用无菌刀将种子顶端切开， 取出完整胚， 接种到种子萌发培养基中， 置于组培 说 明 书 2/3 页 4 CN 105941155 A 4 室， 昼夜光照周期培养条件为： 白天光照强度为2000-3000Lux， 光照时间12-14h/d， 温度25 1； 夜间温度181； 7-10d后种子萌发， 获得无菌苗； 0025 。
14、(4)将获得的无菌苗转接于快繁增殖培养基中， 置于摇床上震荡培养， 转速为 120rpm； 昼夜光照周期培养条件为： 白天光照强度为2000-3000Lux， 光照时间12-14h/d， 温 度251； 夜间温度181； 15-20天顶芽快速生长， 侧芽分化， 根也形成， 将侧芽切下， 继 续转入增殖培养基中； 0026 (5)炼苗转移： 将健壮幼苗于组培瓶中移至自然环境条件下3天， 打开组培瓶盖5天 驯化练苗， 经过驯化炼苗一周后移栽入灭菌处理的草炭土： 落叶松腐殖质： 蛭石2:1:1中， 上覆薄膜， 浇水， 保持空气湿度， 一周后逐渐打开薄膜， 直至幼苗成活。 0027 本发明通过成熟胚诱导， 利用悬浮培养技术构建水曲柳的新型繁育体系， 打破了 由于种子发芽率低而造成的生产瓶颈， 为规模化生产提供了条件。 0028 以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已， 并非对本发明作任何形式上的限 制， 凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改， 等同变化与修饰， 均 属于本发明技术方案的范围内。 说 明 书 3/3 页 5 CN 105941155 A 5 图1 说 明 书 附 图 1/1 页 6 CN 105941155 A 6 。