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1、(10)授权公告号 CN 101836594 B (45)授权公告日 2011.11.30 CN 101836594 B *CN101836594B* (21)申请号 201010197948.2 (22)申请日 2010.06.03 A01H 4/00(2006.01) (73)专利权人 中国农业大学 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路 2 号 (72)发明人 郭仰东 赵冰 李仁 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 任凤华 B.V.CONGER.Plantlet formation from cultured inflorecences o。
2、f Dactylis glomerata LPlant Cell Tissue Organ Culture .1983,191-197. 刘玲珑等 . 无融合生殖在牧草育种上的应 用. 草业科学 .2000,第17卷(第6期),26-30. 钟声等 . 野生二倍体鸭茅染色体加倍及杂交 利用研究 .热带农业工程 .2009, 第 33 卷 ( 第 3 期 ),40-42. 彭燕等 . 野生鸭茅生育特性多样性研 究 .安徽农业科学 .2008, 第 36 卷 ( 第 13 期 ),5368-5370. 曾兵 . 鸭茅种质资源遗传多样性的分子标记 及优异种质评价 .中国博士学位论文全文数据 库 .2。
3、008,( 第 2 期 ),15-19. (54) 发明名称 一种通过游离小孢子培养获得鸭茅单倍体植 株的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种通过组织培养获得鸭茅幼 苗的方法。该方法包括如下步骤 ： 组织培养鸭茅 的小孢子， 得到鸭茅幼苗。在杂交育种中， 由于杂 种后代遗传组成高度杂合， 性状不断分离， 要得到 一个稳定的品系往往需要多年时间， 耗费大量的 人力物力。本发明方法可以获得具有纯合遗传背 景的鸭茅植株 ( 品系 )， 固定优良外源基因， 固定 属间杂种优势， 创造丰富的变异类型， 提高选择效 率。本发明组织培养鸭茅小孢子获得鸭茅幼苗的 方法， 成胚率高、 成苗率高， 而且获得的鸭。
4、茅单倍 体幼苗的纯度高。另外， 本发明方法操作简单、 成 本低廉。 因此， 本发明方法在鸭茅的遗传育种中具 有广阔的应用前景。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 马越 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 2 页 说明书 12 页 CN 101836594 B1/2 页 2 1. 一种获得鸭茅单倍体植株的方法， 包括如下步骤 ： 组织培养鸭茅的小孢子， 得到鸭 茅单倍体植株 ； 所述小孢子为处于如下发育时期的小孢子 ： 小孢子的细胞核处于单核中期 或单核晚期 ； 所述组织培养的方法包括如下步骤 ： 1)培养所述小孢子， 得到胚状体 ； 2)培养 所。
5、述胚状体， 得到鸭茅单倍体植株 ； 所述步骤 1) 中， 培养的条件为 ： 温度为 20 -30、 黑暗和培养时间为 20 天 -30 天 ； 所述步骤 1) 中使用的培养基的组成为 ： 由 NH4NO3、 KNO3、 KH2PO4、 MgSO47H2O、 CaCl22H2O、 MnSO45H2O、 ZnSO47H2O、 H3BO3、 Na2MoO42H2O、 CuSO45H2O、 CoCl26H2O、 Fe-Na2EDTA、 谷氨酸、 肌醇、 维生素B1、 麦芽糖、 植物凝胶和水组成 ； NH4NO3在培养基中的浓度为165mg/L， KNO3在培养基中的浓度为 1900mg/L， KH2P。
6、O4在培养基中的浓度为 170mg/L， MgSO47H2O 在 培养基中的浓度为 370mg/L， CaCl22H2O 在培养基中的浓度为 440mg/L， MnSO45H2O 在培 养基中的浓度为 22.3mg/L， ZnSO47H2O 在培养基中的浓度为 8.6mg/L， H3BO3在培养基中的 浓度为 6.2mg/L， Na2MoO42H2O 在培养基中的浓度为 0.25mg/L， CuSO45H2O 在培养基中的 浓度为 0.025mg/L， CoCl26H2O 在培养基中的浓度为 0.025mg/L， Fe-Na2EDTA 在培养基中 的浓度为 40mg/L， 谷氨酸在培养基中的浓。
7、度为 750mg/L， 肌醇在培养基中的浓度为 100mg/ L， 维生素 B1 在培养基中的浓度为 0.4mg/L， 麦芽糖在培养基中的浓度为 62， 000mg/L， 植物 凝胶在培养基中的浓度为 3000mg/L ； 所述步骤 2) 中， 培养的条件为 ： 温度为 20 -30， 光照时间为 5 小时 / 天 -11 小 时 / 天， 光照强度为 20mol/m2s-80mol/m2s ； 所述步骤 2) 中使用的培养基的组成 为 ： 由 NH4NO3、 KNO3、 KH2PO4、 MgSO47H2O、 CaCl22H2O、 MnSO44H2O、 ZnSO47H2O、 H3BO3、 KI。
8、、 Na2MoO42H2O、 CuSO45H2O、 CoCl26H2O、 Na2EDTA、 FeSO47H2O、 甘氨酸、 蔗糖、 琼脂和水组 成 ； NH4NO3在培养基中的浓度为 1650mg/L， KNO3在培养基中的浓度为 1900mg/L， KH2PO4在培 养基中的浓度为 170mg/L， MgSO47H2O 在培养基中的浓度为 370mg/L， CaCl22H2O 在培养基 中的浓度为 440mg/L， MnSO44H2O 在培养基中的浓度为 22.3mg/L， ZnSO47H2O 在培养基中 的浓度为 8.6mg/L， H3BO3在培养基中的浓度为 6.2mg/L， KI 在培。
9、养基中的浓度为 0.83mg/L， Na2MoO42H2O 在培养基中的浓度为 0.25mg/L， CuSO45H2O 在培养基中的浓度为 0.025mg/ L， CoCl26H2O 在培养基中的浓度为 0.025mg/L， Na2EDTA 在培养基中的浓度为 37.25mg/L， FeSO47H2O 在培养基中的浓度为 27.85mg/L， 甘氨酸在培养基中的浓度为 2mg/L， 蔗糖在培 养基中的浓度为 30,000mg/L， 琼脂在培养基中的浓度为 8000mg/L。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于 ： 所述步骤1)中， 培养的条件为 ： 所述温度 为 20、 25或 30 。
10、； 所述培养时间为 20 天、 25 天或 30 天。 3. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 1) 中， 所述小孢子的初始密度 为 10,000 个 /ml 培养基 -500,000 个 /ml 培养基。 4. 根据权利要求 3 所述的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 1) 中， 所述小孢子的初始密度 为 10,000 个 /ml 培养基、 100,000 个 /ml 培养基或 500,000 个 /ml 培养基。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于 ： 所述步骤2)中， 培养的条件为 ： 所述温度 为 20、 25或 30； 所述光照时间为 5 小时 / 天。
11、、 8 小时 / 天或 11 小时 / 天 ； 所述光照强 度为 20mol/m2s、 50mol/m2s 或 80mol/m2s。 6. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 2) 中， 所述胚状体的长度为 1mm-2mm。 权 利 要 求 书 CN 101836594 B2/2 页 3 7. 根据权利要求 6 所述的方法， 其特征在于 ： 所述方法中， 在所述步骤 1) 后， 步骤 2) 前， 包括如下步骤 ： 将步骤 1) 中得到的小于 1mm 长的胚状体继代培养至胚状体长度为 1mm-2mm ； 所述继代培养的条件为 ： 温度为 20 -30和黑暗。 8. 根据权利。
12、要求 7 所述的方法， 其特征在于 ： 所述继代培养的条件为 ： 所述温度为 20、 25或 30。 9. 根据权利要求 1-8 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述方法中， 在所述组织培养 前， 包括如下分离所述小孢子的步骤 ： 用有效氯质量百分含量为 3的次氯酸钠水溶液将 鸭茅穗表面消毒 10-15min， 得到消毒后的鸭茅穗 ； 将所述消毒后的鸭茅穗用 0.3M 甘露醇水 溶液在 4条件下浸泡 3-5 天， 得到预处理后的鸭茅穗 ； 将预处理后的鸭茅穗剪成 2-3 厘米 小段， 然后在 600r/min 转速下粉碎 5-10 秒， 得到粉碎混合物 ； 将所述粉碎混合物经 100m 孔。
13、径过滤， 收集滤液， 将滤液 50g 离心 5min， 收集沉淀， 即得到小孢子。 权 利 要 求 书 CN 101836594 B1/12 页 4 一种通过游离小孢子培养获得鸭茅单倍体植株的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种通过游离小孢子培养获得鸭茅单倍体植株的方法。 背景技术 0002 鸭茅， 学名 Dactylis glomerata L， 又名鸡脚草、 果园草， 其野生种分布于我国 新疆、 天山山脉的森林边缘地带、 四川的峨眉山、 二郎山、 邛崃山脉、 凉山及岷山山系海拔 1600 3100 米的森林边缘、 灌丛及山坡草地 ； 并且散见于大兴安岭东南坡地。栽种鸭茅除 驯化当地野生。
14、种外多引自丹麦、 美国、 澳大利亚等国。一种疏丛型牧草， 寿命 5 6 年。为 牛、 马上等饲料。根系特别发达。茎秆直立， 高约 40 120 厘米。基叶繁多， 叶片扁长而柔 软， 边缘粗糙有刺。 圆锥花序， 小穗着生在穗轴的一侧， 形似鸡脚， 内、 外稃均具纤毛。 种子长 卵形， 黄褐色。喜温暖湿润气候， 抗寒力中等， 不耐高温和干旱。耐荫性强， 多生长于山坡、 路旁和林下。喜肥沃粘壤土 ； 耐微酸， 不耐碱。鸭茅草质柔软， 牛、 马、 羊、 兔等均喜食。幼嫩 时尚可用以喂猪。叶量丰富， 叶占 60， 茎约占 40。鸭茅可作用放牧或制作干草， 也可收 割青饲或制作青贮料。 0003 单倍体培。
15、养是用植物的组织细胞进行的育种方法， 多用花药离体培养法。单倍体 的产生， 可以通过离体诱导， 植物细胞具有潜在的再生性和全能性， 能发育为完整植株， 故 应用组织培养技术对特定组织进行离体培养， 可诱导产生单倍体。方法是将一定发育阶段 的花药、 子房或幼胚， 通过无菌操作接种在培养基上， 使单倍体细胞分裂形成胚状体或愈伤 组织， 然后由胚状体发育成小苗或诱导愈伤组织发育为植株。因为它们的二倍数染色体是 由单倍数染色体本身加倍而来的， 所以都是纯系， 自交后代不会发生性状分离， 因此进行单 倍体培养在作物品种选育上， 可加快纯合速度， 提高选择效率。 发明内容 0004 本发明的一个目的是提供。
16、一种获得鸭茅单倍体植株的方法。 0005 本发明所提供的获得鸭茅单倍体植株的方法， 包括如下步骤 ： 组织培养鸭茅的小 孢子， 得到鸭茅单倍体植株。 0006 上述方法中， 所述小孢子为处于如下发育时期的小孢子 ： 小孢子的细胞核处于单 核中期或单核晚期。 0007 上述方法中， 所述组织培养的方法包括如下步骤 ： 1) 培养所述小孢子， 得到胚状 体 ； 2) 培养所述胚状体， 得到鸭茅单倍体植株。 0008 上述方法中， 所述步骤 1) 中， 培养的条件为 ： 温度为 20 -30、 黑暗和培养时间 为 20 天 -30 天 ； 所述温度具体为 20、 25、 30 ； 所述培养时间为 2。
17、0 天、 25 天、 30 天。 0009 上述方法中， 所述步骤 1) 中， 所述小孢子的初始密度为 10,000 个 /ml 培养 基 -500,000 个 /ml 培养基， 具体为 10,000 个 /ml 培养基、 100,000 个 /ml 培养基、 500,000 个 /ml 培养基。 0010 上述方法中， 所述步骤 2) 中， 培养的条件为 ： 温度为 20 -30， 光照时间为 5 小 说 明 书 CN 101836594 B2/12 页 5 时 / 天 -11 小时 / 天， 光照强度为 20mol/m2s-80mol/m2s ； 所述温度具体为 20、 25或 30； 所。
18、述光照时间具体为 5 小时 / 天、 8 小时 / 天或 11 小时 / 天 ； 所述光照强度具 体为 20mol/m2s、 50mol/m2s 或 80mol/m2s。 0011 上述方法中， 所述步骤 2) 中， 所述胚状体的长度为 1mm-2mm。 0012 上述方法中， 在所述步骤 1) 后， 步骤 2) 前， 包括如下步骤 ： 将步骤 1) 中得到的 小于 1mm 长的胚状体继代培养至胚状体长度为 1mm-2mm ； 所述继代培养的条件为 ： 温度为 20 -30和黑暗 ； 所述温度具体为 20、 25或 30。 0013 上述方法中， 所述步骤 1) 中使用的培养基的组成为 ： 由。
19、 NH4NO3、 KNO3、 KH2PO4、 MgSO47H2O、 CaCl22H2O、 MnSO45H2O、 ZnSO47H2O、 H3BO3、 Na2MoO42H2O、 CuSO45H2O、 CoCl26H2O、 Fe-Na2EDTA、 谷氨酸、 肌醇、 维生素 B1、 麦芽糖、 植物凝胶和水组成 ； NH4NO3在 培养基中的浓度为 165mg/L， KNO3在培养基中的浓度为 1900mg/L， KH2PO4在培养基中的浓 度为 170mg/L， MgSO47H2O 在培养基中的浓度为 370mg/L， CaCl22H2O 在培养基中的浓度 为 440mg/L， MnSO45H2O 在。
20、培养基中的浓度为 22.3mg/L， ZnSO47H2O 在培养基中的浓度为 8.6mg/L， H3BO3在培养基中的浓度为 6.2mg/L， Na2MoO42H2O 在培养基中的浓度为 0.25mg/ L， CuSO45H2O 在培养基中的浓度为 0.025mg/L， CoCl26H2O 在培养基中的浓度为 0.025mg/ L， Fe-Na2 EDTA 在培养基中的浓度为 40mg/L， 谷氨酸在培养基中的浓度为 750mg/L， 肌醇在 培养基中的浓度为100mg/L， 维生素B1在培养基中的浓度为0.4mg/L， 麦芽糖在培养基中的 浓度为 62， 000mg/L， 植物凝胶在培养基中。
21、的浓度为 3000mg/L ； 0014 上述方法中， 所述步骤 2) 中使用的培养基的组成为 ： 由 NH4NO3、 KNO3、 KH2PO4、 MgSO47H2O、 CaCl22H2O、 MnSO44H2O、 ZnSO47H2O、 H3BO3、 KI、 Na2MoO42H2O、 CuSO45H2O、 CoCl26H2O、 Na2EDTA、 FeSO47H2O、 甘氨酸、 蔗糖、 琼脂和水组成 ； NH4NO3在培养基中的浓 度为 1650mg/L， KNO3在培养基中的浓度为 1900mg/L， KH2PO4在培养基中的浓度为 170mg/ L， MgSO47H2O 在培养基中的浓度为 3。
22、70mg/L， CaCl22H2O 在培养基中的浓度为 440mg/L， MnSO44H2O 在培养基中的浓度为 22.3mg/L， ZnSO47H2O 在培养基中的浓度为 8.6mg/L， H3BO3在培养基中的浓度为 6.2mg/L， KI 在培养基中的浓度为 0.83mg/L， Na2MoO42H2O 在 培养基中的浓度为 0.25mg/L， CuSO45H2O 在培养基中的浓度为 0.025mg/L， CoCl26H2O 在 培养基中的浓度为 0.025mg/L， Na2EDTA 在培养基中的浓度为 37.25mg/L， FeSO47H2O 在培 养基中的浓度为 27.85mg/L， 。
23、甘氨酸在培养基中的浓度为 2mg/L， 蔗糖在培养基中的浓度为 30,000mg/L， 琼脂在培养基中的浓度为 8000mg/L。 0015 上述方法中， 在所述组织培养前， 包括如下分离所述小孢子的步骤 ： 用有效氯质量 百分含量为 3的次氯酸钠水溶液将鸭茅穗表面消毒 10-15min， 得到消毒后的鸭茅穗 ； 将 所述消毒后的鸭茅穗用 0.3M 甘露醇水溶液在 4条件下浸泡 3-5 天， 得到预处理后的鸭茅 穗 ； 将预处理后的鸭茅穗剪成 2-3 厘米小段， 然后在 600r/min 转速下粉碎 5-10 秒， 得到粉 碎混合物 ； 将所述粉碎混合物经 100m 孔径过滤， 收集滤液， 将。
24、滤液 50g 离心 5min， 收集沉 淀， 即得到小孢子。 0016 在杂交育种中， 由于杂种后代遗传组成高度杂合， 性状不断分离， 要得到一个稳定 的品系往往需要多年时间， 耗费大量的人力物力。本发明方法可以获得具有纯合遗传背景 的鸭茅植株 ( 品系 )， 固定优良外源基因， 固定属间杂种优势， 创造丰富的变异类型， 提高选 择效率。本发明组织培养鸭茅小孢子获得鸭茅幼苗的方法， 成胚率高、 成苗率高， 而且获得 说 明 书 CN 101836594 B3/12 页 6 的鸭茅单倍体幼苗的纯度高， 因其全部是从小孢子发育而来的。另外， 本发明方法操作简 单、 成本低廉。因此， 本发明方法在鸭。
25、茅的遗传育种中具有广阔的应用前景。 具体实施方式 0017 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0018 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0019 下述实验中的鸭茅穗均是按照如下方法种植得到的 ： 将鸭茅种子种植于温室中至 得到鸭茅幼穗 ； 温室条件为 16 小时光照 / 天， 光照强度约为 350-400mol/m2s， 温度为 20 /15 ( 白天 / 夜间 )。鸭茅种子购买于克劳沃草业有限公司。 0020 实施例 1、 鸭茅的小孢子组培 0021 1、 鸭茅小孢子的分离 0022 用醋酸洋红溶液染色后镜检， 观察鸭茅幼穗。
26、中小孢子的发育时期。将穗的花粉小 孢子处于单核中期或单核晚期的鸭茅穗剪下， 作为分离小孢子的鸭茅穗。 0023 将鸭茅穗在有效氯含量为 3 ( 质量百分含量 ) 的次氯酸钠水溶液中表面消毒 10-15min， 之后用无菌水漂洗 3-5 次， 每次 5min， 得到消毒后的鸭茅穗 ； 0024 将消毒后的鸭茅穗放入直径 9 厘米培养皿， 倒入 10-15ml 0.3M 甘露醇水溶液， 使 消毒后的鸭茅穗浸泡在甘露醇中， 在 4冰箱内浸泡 3-5 天， 得到预处理后的鸭茅穗 ； 0025 在无菌条件下将预处理后的鸭茅穗剪成 2-3 厘米小段， 放入经冰箱预冷的粉碎机 盛物杯内， 加入0.3M冰温(。
27、0)甘露醇水溶液至盛物杯体积一半， 在600r/min条件下粉碎 5-10 秒， 得到粉碎混合物。粉碎时间过长速度过高会损伤小孢子， 降低其活性。 0026 将粉碎混合物用100m尼龙网过滤， 收集滤液， 将滤液倒入离心管中， 在50g条件 下离心 5min， 收集沉淀， 即为分离的小孢子。为确保小孢子的纯净， 可以重复 1-2 次离心过 程。 0027 2、 小孢子的培养 0028 (1) 胚状体的获得 0029 将纯净小孢子悬浮在 FHG 培养基中， 用吸管将小孢子悬浮液移入直径 6 厘米一次 性无菌培养皿内， 双层封口膜封口， 皿内最终 FHG 培养基体积为 2.5ml， 小孢子培养密度。
28、为 100,000个/mlFHG培养基。 将培养皿置于黑暗条件下25静止培养25天， 得到胚状体。 得 到的胚状体有的 1-2mm 长， 有的小于 1mm 长。小孢子密度可以用血球计数器测定。 0030 FHG 培养基组成 0031 化合物名称 每升培养基用量 (mg/L) 大量元素 NH4NO3 165 KNO3 1900 KH2PO4 170 说 明 书 CN 101836594 B4/12 页 7 MgSO47H2O 370 CaCl22H2O 440 微量元素 MnSO45H2O 22.3 ZnSO47H2O 8.6 H3BO3 6.2 Na2MoO42H2O 0.25 CuSO45H。
29、2O 0.025 CoCl26H2O 0.025 Fe-Na2EDTA 40 其他元素 谷氨酸 750 肌醇 100 维生素 B1 0.4 麦芽糖 62,000 植物凝胶 3000 0032 将小于 1mm 长的胚状体进行继代培养至胚状体长大。继代培养的方法如下 ： 将小 于1mm长的胚状体接入FHG培养基中， 黑暗条件下25静止培养1-2周， 得到1-2mm长的胚 状体。 0033 继 代 培 养 过 程 中， FHG 培 养 基 中 加 入 200g/ml 凯 福 捷 ( 头 孢 噻 肟 钠 ) (Cefotaxime， sigma C-7039)用以控制污染(凯福捷在FHG培养基中的浓度。
30、为200g/ml)。 0034 成胚率的计算公式 ： 成胚率得到的胚状体数目 / 接种的花药数目。 0035 成胚率为 68。 0036 (2) 鸭茅幼苗的获得 0037 将 1-2mm 长的胚状体移入 MS 再生培养基， 在温度为 25、 光照时间为 8 小时 / 天 且光照强度为 50mol/m2s 的条件下培养， 至得到鸭茅单倍体幼苗。 0038 MS 培养基组成 0039 说 明 书 CN 101836594 B5/12 页 8 化合物名称 每升培养基用量 (mg/L) 大量元素 NH4NO3 1650 KNO3 1900 KH2PO4 170 MgSO47H2O 370 CaCl22。
31、H2O 440 微量元素 MnSO44H2O 22.3 ZnSO47H2O 8.6 H3BO3 6.2 KI 0.83 Na2MoO42H2O 0.25 CuSO45H2O 0.025 CoCl26H2O 0.025 其他元素 Na2EDTA 37.25 FeSO47H2O 27.85 甘氨酸 2 蔗糖 30,000 琼脂 8000 0040 成苗率的计算公式 ： 成苗率得到的幼苗数目 / 接种的花药数目。 0041 成苗率为 11。 0042 3、 移栽 0043 将生根良好的幼苗 (3-4 叶 ) 开瓶炼苗 3-5 天， 然后洗净幼苗根上附着的培养基， 说 明 书 CN 101836594。
32、 B6/12 页 9 移栽到含有草炭 / 蛭石营养钵中， 保持温度在 25 /20 ( 白天 / 夜间 )， 光照强度约为 200mol/m2s 的条件下培养， 光照时间为 16/h 天， 保持湿度， 注意通风， 2-3 周后即可成 活。 0044 移苗成活率移栽后成活幼苗株数 / 移栽幼苗总数 0045 成活率 86 0046 4、 田间种植 0047 将成活后的鸭茅植株移栽到露地栽培， 注意通风， 保持湿度。 0048 田间成活率田间移栽幼苗成活株数 / 移栽幼苗总数 0049 田间成活率 82 0050 实验结果表明， 组培得到的鸭茅幼苗大多可成活至完整的植株， 不需要进行染色 体加倍。。
33、 0051 实施例 2、 鸭茅的小孢子组培 0052 1、 鸭茅小孢子的分离 0053 用醋酸洋红溶液染色后镜检， 观察鸭茅穗中小孢子的发育时期。将穗中部花粉小 孢子处于单核中期或单核晚期的鸭茅穗剪下， 作为分离小孢子的鸭茅穗。 0054 将鸭茅穗在有效氯含量为 3 ( 质量百分含量 ) 的次氯酸钠水溶液中表面消毒 10min， 之后用无菌水漂洗 3 次， 每次 5min， 得到消毒后的鸭茅穗 ； 0055 将消毒后的鸭茅穗放入直径 9 厘米培养皿， 倒入 100.3M 甘露醇水溶液， 使消毒后 的鸭茅穗浸泡在甘露醇中， 在 4冰箱内浸泡 3 天， 得到预处理后的鸭茅穗 ； 0056 在无菌条。
34、件下将预处理后的鸭茅穗剪成 2-3 厘米小段， 放入经冰箱预冷的粉碎机 盛物杯内， 加入0.3M冰温(0)甘露醇水溶液至盛物杯体积一半， 在600r/min条件下粉碎 5 秒， 得到粉碎混合物。粉碎时间过长速度过高会损伤小孢子， 降低其活性。 0057 将粉碎混合物用100m尼龙网过滤， 收集滤液， 将滤液倒入离心管中， 在50g条件 下离心 5min， 收集沉淀， 即为分离的小孢子。 0058 2、 小孢子的培养 0059 (1) 胚状体的获得 0060 将纯净小孢子悬浮在 FHG 培养基中， 用吸管将小孢子悬浮液移入直径 6 厘米一 次性无菌培养皿内， 双层封口膜封口， 皿内最终 FHG 。
35、培养基体积为 2ml， 小孢子培养密度为 10,000 个 /mlFHG 培养基。将培养皿置于黑暗条件下 20静止培养 20 天， 得到胚状体。得 到的胚状体有的 1-2mm 长， 有的小于 1mm 长。小孢子密度可以用血球计数器测定。 0061 FHG 培养基组成 0062 化合物名称 每升培养基用量 (mg/L) 大量元素 NH4NO3 165 KNO3 1900 说 明 书 CN 101836594 B7/12 页 10 KH2PO4 170 MgSO47H2O 370 CaCl22H2O 440 微量元素 MnSO45H2O 22.3 ZnSO47H2O 8.6 H3BO3 6.2 N。
36、a2MoO42H2O 0.25 CuSO45H2O 0.025 CoCl26H2O 0.025 Fe-Na2EDTA 40 其他元素 谷氨酸 750 肌醇 100 维生素 B1 0.4 麦芽糖 62,000 植物凝胶 3000 0063 将小于 1mm 长的胚状体进行继代培养至胚状体长大。继代培养的方法如下 ： 将小 于1mm长的胚状体接入FHG培养基中， 黑暗条件下20静止培养1-2周， 得到1-2mm长的胚 状体。 0064 继 代 培 养 过 程 中， FHG 培 养 基 中 加 入 200g/ml 凯 福 捷 ( 头 孢 噻 肟 钠 ) (Cefotaxime， sigma C-703。
37、9)用以控制污染(凯福捷在FHG培养基中的浓度为200g/ml)。 0065 成胚率的计算公式 ： 成胚率得到的胚状体数目 / 接种的花药数目。 0066 成胚率为 32。 0067 (2) 鸭茅幼苗的获得 0068 将 1-2mm 长的胚状体移入 MS 再生培养基， 在温度为 20、 光照时间为 5 小时 / 天 且光照强度为 20mol/m2s 的条件下培养， 至得到鸭茅幼苗。 0069 MS 培养基组成 说 明 书 CN 101836594 B8/12 页 11 0070 化合物名称 每升培养基用量 (mg/L) 大量元素 NH4NO3 1650 KNO3 1900 KH2PO4 170。
38、 MgSO47H2O 370 CaCl22H2O 440 微量元素 MnSO44H2O 22.3 ZnSO47H2O 8.6 H3BO3 6.2 KI 0.83 Na2MoO42H2O 0.25 CuSO45H2O 0.025 CoCl26H2O 0.025 其他元素 Na2EDTA 37.25 FeSO47H2O 27.85 甘氨酸 2 蔗糖 30,000 琼脂 8000 0071 成苗率的计算公式 ： 成苗率得到的幼苗数目 / 接种的花药数目。 0072 成苗率为 2。 0073 3、 移栽 说 明 书 CN 101836594 B9/12 页 12 0074 将生根良好的幼苗 (3-4 。
39、叶 ) 开瓶炼苗 3-5 天， 然后洗净幼苗根上附着的培养基， 移栽到含有草炭 / 蛭石营养钵中， 保持温度在 25 /20 ( 白天 / 夜间 )， 光照强度约为 200mol/m2s 的条件下培养， 光照时间为 16/h 天， 保持湿度， 注意通风， 2-3 周后即可成 活。 0075 移苗成活率移栽后成活幼苗株数 / 移栽幼苗总数 0076 成活率 85 0077 4、 田间种植 0078 将成活后的鸭茅植株移栽到露地栽培， 注意通风， 保持湿度。 0079 田间成活率田间移栽幼苗成活株数 / 移栽幼苗总数 0080 田间成活率 80 0081 实验结果表明， 组培得到的鸭茅幼苗大多可成。
40、活至完整的植株， 不需要进行染色 体加倍。 0082 实施例 3、 鸭茅的小孢子组培 0083 1、 鸭茅小孢子的分离 0084 用醋酸洋红溶液染色后镜检， 观察鸭茅穗中小孢子的发育时期。将穗中部花粉小 孢子处于单核中期或单核晚期的鸭茅穗剪下， 作为分离小孢子的鸭茅穗。 0085 将鸭茅穗在有效氯含量为 3 ( 质量百分含量 ) 的次氯酸钠水溶液中表面消毒 15min， 之后用无菌水漂洗 5 次， 每次 5min， 得到消毒后的鸭茅穗 ； 0086 将消毒后的鸭茅穗放入直径9厘米培养皿， 倒入15ml 0.3M甘露醇水溶液， 使消毒 后的鸭茅穗浸泡在甘露醇中， 在 4冰箱内浸泡 5 天， 得到。
41、预处理后的鸭茅穗 ； 0087 在无菌条件下将预处理后的鸭茅穗剪成 2-3 厘米小段， 放入经冰箱预冷的粉碎机 盛物杯内， 加入0.3M冰温(0)甘露醇水溶液至盛物杯体积一半， 在600r/min条件下粉碎 10 秒， 得到粉碎混合物。粉碎时间过长速度过高会损伤小孢子， 降低其活性。 0088 将粉碎混合物用100m尼龙网过滤， 收集滤液， 将滤液倒入离心管中， 在50g条件 下离心 5min， 收集沉淀， 即为分离的小孢子。 0089 2、 小孢子的培养 0090 (1) 胚状体的获得 0091 将纯净小孢子悬浮在 FHG 培养基中， 用吸管将小孢子悬浮液移入直径 6 厘米一 次性无菌培养皿。
42、内， 双层封口膜封口， 皿内最终 FHG 培养基体积为 2ml， 小孢子培养密度为 500,000个/mlFHG培养基。 将培养皿置于黑暗条件下30静止培养30天， 得到胚状体。 得 到的胚状体有的 1-2mm 长， 有的小于 1mm 长。小孢子密度可以用血球计数器测定。 0092 FHG 培养基组成 0093 化合物名称 每升培养基用量 (mg/L) 大量元素 NH4NO3 165 说 明 书 CN 101836594 B10/12 页 13 KNO3 1900 KH2PO4 170 MgSO47H2O 370 CaCl22H2O 440 微量元素 MnSO45H2O 22.3 ZnSO47。
43、H2O 8.6 H3BO3 6.2 Na2MoO42H2O 0.25 CuSO45H2O 0.025 CoCl26H2O 0.025 Fe-Na2EDTA 40 其他元素 谷氨酸 750 肌醇 100 维生素 B1 0.4 麦芽糖 62,000 植物凝胶 3000 0094 将小于 1mm 长的胚状体进行继代培养至胚状体长大。继代培养的方法如下 ： 将小 于1mm长的胚状体接入FHG培养基中， 黑暗条件下30静止培养1-2周， 得到1-2mm长的胚 状体。 0095 继 代 培 养 过 程 中， FHG 培 养 基 中 加 入 200g/ml 凯 福 捷 ( 头 孢 噻 肟 钠 ) (Cefo。
44、taxime， sigma C-7039)用以控制污染(凯福捷在FHG培养基中的浓度为200g/ml)。 0096 成胚率的计算公式 ： 成胚率得到的胚状体数目 / 接种的花药数目。 0097 成胚率为 34。 0098 (2) 鸭茅幼苗的获得 0099 将1-2mm长的胚状体移入MS再生培养基， 在温度为30、 光照时间为11小时/天 且光照强度为 80mol/m2s 的条件下培养， 至得到鸭茅幼苗。 说 明 书 CN 101836594 B11/12 页 14 0100 MS 培养基组成 0101 化合物名称 每升培养基用量 (mg/L) 大量元素 NH4NO3 1650 KNO3 190。
45、0 KH2PO4 170 MgSO47H2O 370 CaCl22H2O 440 微量元素 MnSO44H2O 22.3 ZnSO47H2O 8.6 H3BO3 6.2 KI 0.83 Na2MoO42H2O 0.25 CuSO45H2O 0.025 CoCl26H2O 0.025 其他元素 Na2EDTA 37.25 FeSO47H2O 27.85 甘氨酸 2 蔗糖 30,000 琼脂 8000 0102 成苗率的计算公式 ： 成苗率得到的幼苗数目 / 接种的花药数目。 0103 成苗率为 3。 0104 3、 移栽 说 明 书 CN 101836594 B12/12 页 15 0105 将。
46、生根良好的幼苗 (3-4 叶 ) 开瓶炼苗 3-5 天， 然后洗净幼苗根上附着的培养基， 移栽到含有草炭 / 蛭石营养钵中， 保持温度在 25 /20 ( 白天 / 夜间 )， 光照强度约为 200mol/m2s 的条件下培养， 光照时间为 16/h 天， 保持湿度， 注意通风， 2-3 周后即可成 活。 0106 移苗成活率移栽后成活幼苗株数 / 移栽幼苗总数 0107 成活率 82。 0108 4、 田间种植 0109 将成活后的鸭茅植株移栽到露地栽培， 注意通风， 保持湿度。 0110 田间成活率田间移栽幼苗成活株数 / 移栽幼苗总数 0111 田间成活率 80。 0112 实验结果表明， 组培得到的鸭茅幼苗大多可成活至完整的植株， 不需要进行染色 体加倍。 说 明 书 。