技术领域
本发明涉及一种裸花紫珠无菌播种与快速组培繁殖方法。
背景技术
裸花紫珠(Callicarpa nudiflora Hook.ex Am)为马鞭草科紫珠属 多年生小灌木植物，主产于中国海南，广东、广西也有分布，国外主 要分布在越南、马来西亚和印度。裸花紫珠是一种珍贵的药材，始载 于唐《本草拾遗》，其根、茎、叶均可入药，有消炎、收敛、止血、 清热解毒等功效。裸花紫珠用途广泛，其药用历史悠长，作用广且疗 效显著，目前医用临床上有裸花紫珠胶囊、裸花紫珠片、裸花紫珠栓 等成品药剂，此外，裸花紫珠还用于制作牙膏，其叶可直接泡水饮用 。由于裸花紫珠种子出苗率低，扦插繁殖系数较小，基本上没有大面 积种植，其生产原材料主要依靠采挖野生资源，随着市场需求量的逐 年增加，野生资源的逐年锐减，已远远不能满足生产的需求。而且由 于人为无度的大肆采收，资源破坏严重。因此，进行裸花紫珠的人工 繁殖极有必要，而采用组织培养技术是最为有效的人工繁殖途经。目 前，有关裸花紫珠的研究主要集中在化学成分、药理作用及临床应用 上，利用种子和枝条进行人工繁育的报道极少，而裸花紫珠的组织培 养和快速繁殖尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供了裸花紫珠无菌播种与快速组培繁殖方法，该方 法操作简单、繁殖率高，可快速大量生产性状一致的裸花紫珠组培苗 ，解决了播种出苗率低，扦插繁殖系数小而致繁殖速度过慢问题。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供裸花紫珠无菌播种 与快速组培繁殖方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）材料与外植体消毒：选用裸花紫珠成熟种子，将裸花紫珠种子在 自来水中清洗干净后用纱布包裹，在超净工作台上，先用浓度为75%酒 精浸泡10 s， 无菌水冲洗3次，再用浓度为0.1% HgCl2溶液浸泡10 min，再用无菌 水冲洗5次；
（2）种子诱导培养基的制备：以MS为基本培养基,添加蔗糖30 g/L、 卡拉胶6 g/L，pH 5.8，配制后,于温度121℃、压力0.14 MPa高温 高压灭菌20 min；
（3）种子的萌发：将已消毒好的种子接入步骤（2）种子诱导培养基 中，培养25天后开始萌发，培养温度为24～28℃，光照强度1500 lx ，光照时间8 h/d；
（4）丛生芽的诱导：切取小苗上端约1.0 cm长转入增殖培养基中， 28～30天可分化出5～6个芽，萌发出的新芽即可用解剖刀切分转入相 同的培养基中进行增殖培养;增殖培养基为MS+ 6-BA 2.00 mg/L+ NAA 0.05 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉胶6.0 g/L，pH 5.8；
（5）丛生芽继代增殖:丛生芽接入培养基MS+ 6-BA 2.00 mg/L+ NAA 0.05 mg/L +蔗糖30 g/L+卡拉胶6.0 g/L，pH 5.8，置于温 度为24～28℃，光照强度为1500 lx的培养室中培养，光照时间8 h /d，继代时间为30～40 d；
（6）生根培养：将高度达到2 cm的小苗进行生根培养，培养基为MS +NAA 0.5～0.75 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉胶6.0 g/L，pH 5.8，培 养温度为24～28℃，光照强度1500 lx，光照时间8 h/d；
（7）组培苗的炼苗与移栽：无根苗在生根培养基中培养30天后，苗高 3～5 cm，根5条以上，将其移入拱棚内炼苗7～15天即可移栽;小苗从 培养袋中取出后，用清水洗去根部残留的培养基，栽植于下列体积比 为1:1:1混合基质中：河沙、珍珠岩和表土，种后浇透水，盖上透明塑 料薄膜，注意遮阴， 20天揭去覆盖的透明薄膜，常规管理。
本发明提供了裸花紫珠高效快速组织培养的方法。该方法选取裸花紫 珠的成熟种子，经初代培养形成不定芽，利用不定芽进行继代增殖及 生根培养。采用此组织培养方法繁殖裸花紫珠，操作简单，繁殖率高 ，可快速大量生产性状一致的裸花紫珠组培苗，解决了播种出苗率低 ，扦插繁殖系数小而致繁殖速度过慢的问题。该技术可用于工厂化生 产，将对裸花紫珠的保护、开发和利用提供有效的新途径，具有重要 的经济、社会和生态效益。
具体实施方式
1 材料与方法
1.1 材料与外植体消毒
材料为采自海南五指山的裸花紫珠成熟种子。将裸花紫珠种子在自来 水中清洗干净后用纱布包裹，在超净工作台上，先用75%酒精浸泡10 s，无菌水冲洗3次，再用0.1% HgCl2溶液浸泡10 min，无菌水冲洗 5次，然后将种子接种到诱导培养基上。
1.2 培养基
以MS为基本培养基, 根据试验目的添加不同浓度的植物生长调节剂6 -BA（6-苄基腺嘌呤）和NAA （萘乙酸），附加蔗糖30 g/L、卡拉胶 6 g/L，pH 5.8，配制分装后,于温度121℃、压力0.14 MPa高温高 压灭菌20 min。
1.3 丛生芽的增殖
1.3.1 生长调节剂组合对丛生芽增殖的影响 设计6-BA和NAA 2种生长调节剂4个浓度水平的配比，30天统计丛生芽增殖系数。培养 温度为(26±2)℃，光照强度1500 lx，光照时间8 h/d。
1.3.2 温度对丛生芽增殖的影响 将丛生芽接入MS+ 6-BA 2. 00 mg/L+ NAA 0.05 mg/L培养基中，置于光照强度1500 lx，温 度分别为22、25、28、32℃的培养室中培养，每种处理接种10袋，每 袋3块丛芽，3次重复，定期观察记录，30天后统计丛生芽增殖系数。
1.3.3 光照强度对丛生芽增殖的影响 将丛生芽接入MS+ 6-BA 2.00 mg/L+ NAA 0.05 mg/L培养基中，置于温度为28℃，光照 强度分别为500、1000、1500、2000、2500 lx的光照培养箱中培养， 每种处理接种10袋，每袋3块丛芽，3次重复，30天后统计丛生芽增殖 系数，观察生长状况。
1.4 生根培养
将高度达到2cm的小苗进行生根培养，培养基中添加不同浓度的NAA共 5种处理，每种处理接种6袋，每袋8株，3次重复，30天统计生根情况 。培养温度为24～28℃，光照强度1500 lx，光照时间8 h/d。
1.5 组培苗的炼苗与移栽
无根苗在生根培养基中培养30天后，苗高3～5 cm，根5条以上，将其 移 入拱棚内炼苗7～15天即可移栽。小苗从培养袋中取出后，用清水洗去 根部残留的培养基，分别栽植于下列基质中：①河沙:珍珠岩=1:1，② 河沙:椰糠=1:1，③河沙:红土=1:1，④河沙:珍珠岩:表土=1:1:1，每 种基质各栽种100株，种后浇透水，盖上透明塑料薄膜，注意遮阴，3 0天后统计成活率。每种基质随机选择30株，量取植株地上部分高度， 统计高生长量。
1.6 统计方法
采用方差分析法，F测验显著后用新复极差法(SSR)进行多重比较。
2 结果与分析
2.1 种子的萌发和丛生芽的诱导
种子在诱导培养基（MS基本培养基）上培养25天后开始萌发，切取小 苗上端约1.0 cm长转入增殖培养基中，30天左右可分化出5～6个芽， 萌发出的新芽即可用解剖刀切分转入相同的培养基中进行增殖培养。 增殖培养基为MS+ 6-BA 2.00 mg/L+ NAA 0.05 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉胶6.0 g/L，pH 5.8；
2.2 丛生芽的增殖继代
2.2.1 植物生长调节剂组合对裸花紫珠丛生芽增殖的影响 裸花 紫珠丛生芽增殖培养的最优组合为丛生芽接入培养基MS+ 6-BA 2.0 0 mg/L+ NAA 0.05 mg/L +蔗糖30 g/L+卡拉胶6.0 g/L，pH 5.8，置于温度为24～28℃，光照强度为1500 lx的培养室中培养，光 照时间8 h/d，继代时间为30 d；丛生芽的增殖系数达10.87，而且 丛生芽的生长状况也最好，芽苗健壮鲜绿较为整齐，高2.5 cm。
2.2.2 温度对丛生芽增殖的影响 裸花紫珠丛生芽继代增殖最适 宜的温度为28℃，丛生芽的增殖系数达10.48。
2.2.3 光照强度对丛生芽增殖的影响 裸花紫珠丛生芽继代增殖 培养的最适宜光照强度为1500 lx，丛生芽的增殖系数达10.18。
2.2.4 NAA浓度对生根的影响 培养基为MS+NAA 0.5～0.75 m g/L+蔗糖30 g/L+卡拉胶6.0 g/L，pH 5.8，培养温度为24～28℃， 光照强度1500 lx，光照时间8 h/d适于裸花紫珠的生根培养。结果 ：平均生根条数5.57～9.83条、平均根长1.75～1.92 cm、平均株高 3.91～3.98cm、平均生根率100%、生长状况 良好。
2.3 组培苗移栽
裸花紫珠组培苗移栽在河沙、珍珠岩和表土(1:1:1)的混合基质最好， 20天揭去覆盖的透明薄膜，常规管理，移栽30天的成活达96%。裸花紫 珠组培苗不仅成活率高，而且生长快。
3 结论
（1）裸花紫珠种子是适宜的外植体材料，其表面光洁，自身携带的杂 菌少，灭菌较容易。种子用75%酒精预处理10 s，再用0.1% HgCl2浸 泡10 min，灭菌效果最好，污染率低于30%。
（2）培养基MS+ 6-BA 2.00 mg/L+ NAA 0.05 mg/L能很好地诱 导丛生芽，适宜继代增殖，30天的增殖系数为10.87，芽苗生长状况好 。培养基中6-BA浓度过高或过低，丛生芽增殖系数较低长势弱，6-BA 为3.00 mg/L时，出现玻璃化现象，因此，在继代增殖培养中，6-BA 浓度不宜超过3.00 mg/L。
（3）裸花紫珠丛生芽继代增殖最适宜的培养温度是28℃，光照强度是 1500 lx，在这样的培养条件下，丛生芽长势好，增殖系数高。过高 、过低的培养温度和光照强度均不利于从生芽的生长，温度达到32℃ 时，出现玻璃化苗。
（4）培养基为MS+NAA 0.5～0.75 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉胶6.0 g/L适宜诱导生根，生根率100%，根系质量好。NAA浓度超过1.00 mg /L会产生畸形根。
（5）裸花紫珠组培苗移栽基质要求通气保水性好而且富含营养，组培 苗移栽于河沙、珍珠岩、表土按照1:1:1比例混合的基质中，成活率最 高，达到96%，植株生长状态良好，而且较其他基质表现速生。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本 发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本 发明所涵盖的范围。