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1、(10)授权公告号 CN 103250643 B (45)授权公告日 2014.08.27 CN 103250643 B (21)申请号 201310179173.X (22)申请日 2013.05.15 A01H 4/00(2006.01) (73)专利权人 中国林业科学研究院 地址 100000 北京市海淀区东小府 1 号 (72)发明人 成铁龙 张景波 杨秀艳 史胜青 江泽平 (74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所 ( 普通合伙 ) 32204 代理人 邱兴天 范小峰等 . 唐古特白刺愈伤组织诱导及再 生体系的研究 .西北师范大学学报 (自然科学 版) .2009, 第 45 卷 。
2、( 第 2 期 ), 何斌琼等 . 天津野生白刺再生体系的建 立 .北方园艺 .2010,( 第 10 期 ), 郭晔红等 . 唐古特白刺组织培养及其培养基 筛选研究. 草业学报 .2009,第18卷(第6期), 张红晓等 . 白刺组织培养技术的研究 .西 北植物学报 .2004, 第 24 卷 ( 第 1 期 ), (54) 发明名称 一种唐古特白刺无性系离体生根培养方法 (57) 摘要 本发明公开了一种唐古特白刺叶片再生植株 方法, 该方法包括以下步骤 : 选取白刺成年树优 良品种的叶片为组织培养材料, 表面灭菌后接入 愈伤组织诱导培养基, 待愈伤组织诱导出来以后 建立悬浮培养体系进行愈伤。
3、组织的增殖, 然后将 悬浮培养后的小细胞团转入固体培养基上进行不 定芽的诱导 ; 不定芽诱导出来以后转入 MS 基本培 养基上生长, 待不定芽长到 2 3cm 时, 转入诱导 生根培养基培养, 得生根试管苗。 与现有技术中的 白刺组培方法相比, 本发明的白刺成年树叶片再 生植株培养方法优势在于 : 有效解决了白刺优良 成年树在组织培养条件下的植株再生问题, 实现 白刺稳定高效的组培体系, 为加快白刺组培苗植 株再生提供技术支撑。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 高欣 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利。
4、要求书1页 说明书3页 附图1页 (10)授权公告号 CN 103250643 B CN 103250643 B 1/1 页 2 1. 一种唐古特白刺无性系离体生根培养方法, 其特征在于, 包括以下步骤 : (1) 选取白刺优良成年树的当年生新枝条的叶片为组织培养材料, 经清洗、 消毒后接入 愈伤组织诱导培养基培养, 使高度分化的叶片脱分化为愈伤组织, 其中, 愈伤组织诱导培养 基配方为 1/2MS 2,4-D 2mgL-1 BA 0.2mgL-1 NAA0.2mgL-1+ 水解酪蛋白 1 gL-1+ 蔗糖 3%, 培养条件为 23, 暗培养, 培养材料每 25 天继代培养一次 ; (2) 当。
5、愈伤组织鲜重达到 2g 时, 转入液体培养基中进行悬浮培养, 将愈伤组织进行增 殖并分散成小细胞团或单细胞 ; 液体悬浮培养基以 1/2MS 为基本培养基, 在其中添加植物 生长调节剂和 3% 蔗糖 ; 植物生长调节剂为 2,4-D 2mgL-1、 BA 0.2mgL-1; 液体悬浮培养基 中添加水解酪蛋白1 gL-1, 天冬酰胺200 mgL-1; 液体培养条件为摇床转速90rpm, 23, 暗 培养, 液体材料每 7 天继代培养一次 ; (3) 将步骤 (2) 的悬浮培养细胞转入不定芽诱导培养基, 悬浮培养的单细胞或者小细 胞团在不定芽诱导培养基上经过 1 个月的生长会产生不定芽 ; 不定。
6、芽诱导培养基为 MS+KT 1mgL-1BA 1mgL-1NAA0. 2mgL-1+蔗糖3%, 培养条件为25, 16h光培养, 培养材料每 25 天继代培养一次 ; 经过 1-2 次继代培养后, 培养细胞再分化为不定芽 ; 不定芽生长在 MS 基本培养基上进行, 添加 30 gL-1蔗糖 ; (4) 待不定芽长到 2-3cm 时, 转入生根培养基, 生根培养基为 1/2MS, 植物生长调节剂为 IBA0.52mgL-1。 2. 根据权利要求 1 所述的唐古特白刺无性系离体生根培养方法, 其特征在于 : 所述 新枝条的叶片的清洗、 消毒方法为 : 经流水冲洗 2h, 70% 乙醇处理 1min。
7、, 0.1% HgCl2处理 10min, 即可。 权 利 要 求 书 CN 103250643 B 2 1/3 页 3 一种唐古特白刺无性系离体生根培养方法 技术领域 0001 本发明涉及唐古特白刺成年树叶片再生植株技术, 具体涉及一种唐古特白刺无性 系离体植株再生培养方法。 背景技术 0002 白刺属在全世界范围内共有 12 种, 而在我国内蒙、 甘肃、 青海、 新疆、 宁夏、 辽宁等 省区有齿叶白刺 (N.roborowskii) 、 毛瓣白刺 (N.praevisa) 、 泡果白刺 (N.sphaerocarpa) 、 唐古特白刺 (N.tangutorum) 、 西伯利亚白刺 (N.。
8、sibirica) 、 盐生白刺 (N.schoberi L.) 和 帕米尔白刺 (N.pamirica) 等 7 种。白刺属植物系第三纪孑遗植物, 通常高 0.5 2m, 具有 极强的抗干旱和耐盐碱能力, 是荒漠戈壁地区植被生态系统的重要建群种之一, 具有重要 的生态、 经济价值。 白刺属耐高温干旱或重盐碱胁迫, 抗风蚀沙埋、 枝茎机械组织发达, 近地 面匍匐丛生, 对多风环境具有良好的适应能力 ; 萌生能力强, 被沙土埋覆后能产生大量不定 根, 从而形成新的植株, 形成白刺沙堆, 可拦蓄和固定大量流沙。它们还是沙生植物中少有 的药食两用的浆果类植物, 其果实酸甜可口, 富含各种氨基酸、 维。
9、生素 C、 多种微量元素等各 类生理活性物质, 其中氨基酸、 黄酮和糖总含量均高于沙棘, 有非常好的开发利用前景。从 其果实、 叶片、 幼枝、 种子等提取的次生代谢物质 (主要为黄酮类化合物) 具有重要的药用价 值, 具有健脾胃、 助消化和安神解表之功效, 在食用、 药用、 保健等方面具有很大开发利用潜 力。 0003 唐古特白刺是适合在我国西北部沙漠地区干旱、 盐碱环境条件下生长的重要树 种, 并且具有重要的经济价值。 近年来随着荒漠化的治理改造的进行, 良种种苗得到高度重 视。 关于白刺属植物的组织培养进行过初步的研究, 本专利提供的方法适合唐古特白刺、 泡 果白刺等白刺属植物成年树的快速。
10、高效繁殖。 发明内容 0004 发明目的 : 针对现有技术中存在的不足, 本发明的目的是提供一种唐古特白刺无 性系离体植株再生培养方法, 以实现提供周期短、 效率高、 成本低的唐古特白刺苗木的生产 技术。 0005 技术方案 : 为了实现上述发明目的, 本发明采用的技术方案为 : 0006 一种唐古特白刺无性系离体生根培养方法, 包括以下步骤 : 0007 (1) 选取白刺优良成年树的当年生新枝条的叶片为组织培养材料, 经清洗、 消毒后 接入愈伤组织诱导培养基培养, 使高度分化的叶片脱分化为愈伤组织, 其中, 愈伤组织诱导 培养基配方为 1/2MS 2,4-D2mgL-1 BA0.2mgL-1。
11、 NAA0.2mgL-1+ 水解酪蛋白 (CH) 1gL-1+ 蔗糖 3%, 培养条件为 23, 暗培养, 培养材料每 25 天继代培养一次 ; 0008 (2)将愈伤组织接入继代增殖培养基进行继代增殖培养, 诱导分化出不定芽, 然后将不定芽转入 MS 培养基上进行伸长培养 ; 其中, 继代增殖培养基配方为 3/4MS 6BA0.3mgL-1 NAA0.02mgL-1蔗糖 3% ; 说 明 书 CN 103250643 B 3 2/3 页 4 0009 (3) 待不定芽长到 2-3cm 时, 转入生根培养基, 生根培养基为 1/2MS, 植物生长调节 剂为 IBA0.5 2mgL-1。 001。
12、0 其中, 步骤 (1) 操作完成后, 直接进行以下操作, 然后直接进行步骤 (3) 操作 0011 1) 当愈伤组织鲜重达到 2g 时, 转入液体培养基中进行悬浮培养, 将愈伤组织进行 增殖并分散成小细胞团或单细胞 ; 液体悬浮培养基以 1/2MS 为基本培养基, 在其中添加植 物生长调节剂和 3% 蔗糖 ; 植物生长调节剂为 2,4-D2mgL-1、 BA0.2mgL-1; 液体悬浮培养 基中添加水解酪蛋白 1gL-1, 天冬酰胺 (ASN) 200mgL-1; 液体培养条件为摇床转速 90rpm, 23, 暗培养, 液体材料每 7 天继代培养一次 ; 0012 2) 将步骤 1) 的悬浮。
13、培养细胞转入不定芽诱导培养基, 悬浮培养的单细胞或者 小细胞团在不定芽诱导培养基上经过 1 个月的生长会产生不定芽 ; 不定芽诱导培养基为 MS+KT1mgL-1 BA1mgL-1 NAA0.2mgL-1+ 蔗糖 3%, 培养条件为 25, 16h 光培养, 培养 材料每 25 天继代培养一次 ; 经过 1-2 次继代培养后, 培养细胞再分化为不定芽 ; 不定芽生 长在 MS 基本培养基上进行, 添加 30gL-1蔗糖。 0013 所述新枝条的叶片的清洗、 消毒方法为 : 经流水冲洗 2h, 70% 乙醇处理 1min, 0.1%HgCl 处理 10min, 即可。 0014 有益效果 : 与。
14、现有技术相比, 本发明的唐古特白刺无性系离体植株再生培养方法, 有效解决了白刺优良成年树在组织培养条件下的植株再生问题, 实现白刺稳定高效的组培 体系, 提供大量唐古特白刺种植材料, 缓解社会对唐古特白刺苗木的紧迫需求, 为加快白刺 组培苗植株再生提供技术支撑。是一种周期短、 效率高、 成本低的良种苗木的生产技术, 具 有很好的实用性。 附图说明 0015 图 1 由唐古特白刺叶片诱导的愈伤组织图 ; 0016 图 2 从愈伤组织上产生不定芽 ; 0017 图 3 不定芽的生长 ; 0018 图 4 唐古特白刺的生根图。 具体实施方式 0019 下面结合具体实施例最本发明做进一步的说明。 00。
15、20 实施例 1 0021 一种唐古特白刺无性系离体生根培养方法, 包括以下步骤 : 0022 (1)选取唐古特白刺优良成年树的当年生新枝条的叶片为组织培养材料, 经 流水冲洗 2h, 70% 乙醇处理 1min, 0.1%HgCl 处理 10min 后接入愈伤组织诱导培养基培 养, 使高度分化的叶片脱分化为愈伤组织。其中, 愈伤组织诱导培养基配方为 1/2MS 2,4-D2mgL-1 BA0.2mgL-1 NAA0.2mgL-1+ 水解酪蛋白 (CH) 1gL-1+ 蔗糖 3%。培养 条件为 23, 暗培养, 培养材料每 25 天继代培养一次, 一般培养 10 天后叶片脱分化形成愈 伤组织,。
16、 如图 1 所示。 0023 (2)继代增殖培养基进行继代增殖培养, 诱导分化出不定芽, 然后将不定芽转 入 MS 培养基上进行伸长培养 ; 其中, 继代增殖培养基配方为 3/4MS 6BA0.3mgL-1 说 明 书 CN 103250643 B 4 3/3 页 5 NAA0.02mgL-1蔗糖 3% ; 0024 (4) 不定芽生长在 MS 基本培养基上进行, 添加 30gL-1蔗糖, 16h 光照 /8h 暗培 养, 如图 3 所示 ; 0025 (5) 待不定芽长到 2-3cm 时, 转入生根培养基, 生根培养基为 1/2MS, 添加植物生长 调节剂, 为 IBA0.5 2mg L-1。
17、。生根培养在光照条件下进行 (16h 光照 /8h 暗培养) , 培养 20 天后有健康根系长出, 唐古特白刺的生根图, 如图 4 所示。 0026 生根后, 进行常规培养, 即可实现植株的再生和培育成苗。 0027 实施例 2 0028 一种唐古特白刺无性系离体生根培养方法, 包括以下步骤 : 0029 (1)选取唐古特白刺优良成年树的当年生新枝条的叶片为组织培养材料, 经 流水冲洗 2h, 70% 乙醇处理 1min, 0.1%HgCl 处理 10min 后接入愈伤组织诱导培养基培 养, 使高度分化的叶片脱分化为愈伤组织。其中, 愈伤组织诱导培养基配方为 1/2MS 2,4-D2mgL-1。
18、 BA0.2mgL-1 NAA0.2mgL-1+ 水解酪蛋白 (CH) 1gL-1+ 蔗糖 3%。培养 条件为 23, 暗培养, 培养材料每 25 天继代培养一次, 如图 1 所示。 0030 (2) 步骤 (1) 的愈伤组织鲜重达到 2g 时, 转入液体培养基中进行悬浮培养, 将愈伤 组织进行增殖并分散成小细胞团或单细胞 ; 液体悬浮培养基以 1/2MS 为基本培养基, 在其 中添加植物生长调节剂和 3% 蔗糖 ; 植物生长调节剂为 2,4-D2mgL-1、 BA0.2mgL-1; 液体 悬浮培养基中添加水解酪蛋白 1gL-1, 天冬酰胺 (ASN) 200mgL-1; 液体培养条件为摇床转。
19、 速 90rpm, 23, 暗培养, 液体材料每 7 天继代培养一次。 0031 (3)步骤 (2)的悬浮培养细胞转入不定芽诱导培养基, 悬浮培养的单细胞或者 小细胞团在不定芽诱导培养基上经过 1 个月的生长会产生不定芽 ; 不定芽诱导培养基为 MS+KT1mgL-1 BA1mgL-1 NAA0.2mgL-1+ 蔗糖 3%, 培养条件为 25, 16h 光培养, 培 养材料每25天继代培养一次 ; 经过1-2次继代培养后, 培养细胞再分化为不定芽, 如图2所 示。 0032 (4) 不定芽生长在 MS 基本培养基上进行, 添加 30gL-1蔗糖, 16h 光照 /8h 暗培 养, 如图 3 所示 ; 0033 (5) 待不定芽长到 2-3cm 时, 转入生根培养基, 生根培养基为 1/2MS, 添加植物生长 调节剂, 为 IBA0.5 2mgL-1。唐古特白刺的生根图, 如图 4 所示。 0034 生根后, 进行常规培养, 即可实现植株的再生和培育成苗。 说 明 书 CN 103250643 B 5 1/1 页 6 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103250643 B 6 。