一种唐古特白刺无性系离体生根培养方法.pdf

1、(10)授权公告号 CN 103250643 B (45)授权公告日 2014.08.27 CN 103250643 B (21)申请号 201310179173.X (22)申请日 2013.05.15 A01H 4/00(2006.01) (73)专利权人 中国林业科学研究院 地址 100000 北京市海淀区东小府 1 号 (72)发明人 成铁龙 张景波 杨秀艳 史胜青 江泽平 (74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所 ( 普通合伙 ) 32204 代理人 邱兴天 范小峰等 . 唐古特白刺愈伤组织诱导及再 生体系的研究 .西北师范大学学报 （自然科学 版） .2009, 第 45 卷

2、( 第 2 期 ), 何斌琼等 . 天津野生白刺再生体系的建 立 .北方园艺 .2010,( 第 10 期 ), 郭晔红等 . 唐古特白刺组织培养及其培养基 筛选研究. 草业学报 .2009,第18卷(第6期), 张红晓等 . 白刺组织培养技术的研究 .西 北植物学报 .2004, 第 24 卷 ( 第 1 期 ), (54) 发明名称 一种唐古特白刺无性系离体生根培养方法 (57) 摘要 本发明公开了一种唐古特白刺叶片再生植株 方法， 该方法包括以下步骤 ： 选取白刺成年树优 良品种的叶片为组织培养材料， 表面灭菌后接入 愈伤组织诱导培养基， 待愈伤组织诱导出来以后 建立悬浮培养体系进行愈伤

3、组织的增殖， 然后将 悬浮培养后的小细胞团转入固体培养基上进行不 定芽的诱导 ； 不定芽诱导出来以后转入 MS 基本培 养基上生长， 待不定芽长到 2 3cm 时， 转入诱导 生根培养基培养， 得生根试管苗。 与现有技术中的 白刺组培方法相比， 本发明的白刺成年树叶片再 生植株培养方法优势在于 ： 有效解决了白刺优良 成年树在组织培养条件下的植株再生问题， 实现 白刺稳定高效的组培体系， 为加快白刺组培苗植 株再生提供技术支撑。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 高欣 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利

4、要求书1页 说明书3页 附图1页 (10)授权公告号 CN 103250643 B CN 103250643 B 1/1 页 2 1. 一种唐古特白刺无性系离体生根培养方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： （1） 选取白刺优良成年树的当年生新枝条的叶片为组织培养材料， 经清洗、 消毒后接入 愈伤组织诱导培养基培养， 使高度分化的叶片脱分化为愈伤组织， 其中， 愈伤组织诱导培养 基配方为 1/2MS 2,4-D 2mgL-1 BA 0.2mgL-1 NAA0.2mgL-1+ 水解酪蛋白 1 gL-1+ 蔗糖 3%， 培养条件为 23， 暗培养， 培养材料每 25 天继代培养一次 ； （2） 当

5、愈伤组织鲜重达到 2g 时， 转入液体培养基中进行悬浮培养， 将愈伤组织进行增 殖并分散成小细胞团或单细胞 ； 液体悬浮培养基以 1/2MS 为基本培养基， 在其中添加植物 生长调节剂和 3% 蔗糖 ； 植物生长调节剂为 2,4-D 2mgL-1、 BA 0.2mgL-1； 液体悬浮培养基 中添加水解酪蛋白1 gL-1， 天冬酰胺200 mgL-1； 液体培养条件为摇床转速90rpm， 23， 暗 培养， 液体材料每 7 天继代培养一次 ； （3） 将步骤 （2） 的悬浮培养细胞转入不定芽诱导培养基， 悬浮培养的单细胞或者小细 胞团在不定芽诱导培养基上经过 1 个月的生长会产生不定芽 ； 不定

6、芽诱导培养基为 MS+KT 1mgL-1BA 1mgL-1NAA0. 2mgL-1+蔗糖3%， 培养条件为25， 16h光培养， 培养材料每 25 天继代培养一次 ； 经过 1-2 次继代培养后， 培养细胞再分化为不定芽 ； 不定芽生长在 MS 基本培养基上进行， 添加 30 gL-1蔗糖 ； （4） 待不定芽长到 2-3cm 时， 转入生根培养基， 生根培养基为 1/2MS， 植物生长调节剂为 IBA0.52mgL-1。 2. 根据权利要求 1 所述的唐古特白刺无性系离体生根培养方法， 其特征在于 ： 所述 新枝条的叶片的清洗、 消毒方法为 ： 经流水冲洗 2h， 70% 乙醇处理 1min

7、， 0.1% HgCl2处理 10min， 即可。 权 利 要 求 书 CN 103250643 B 2 1/3 页 3 一种唐古特白刺无性系离体生根培养方法 技术领域 0001 本发明涉及唐古特白刺成年树叶片再生植株技术， 具体涉及一种唐古特白刺无性 系离体植株再生培养方法。 背景技术 0002 白刺属在全世界范围内共有 12 种， 而在我国内蒙、 甘肃、 青海、 新疆、 宁夏、 辽宁等 省区有齿叶白刺 （N.roborowskii） 、 毛瓣白刺 （N.praevisa） 、 泡果白刺 （N.sphaerocarpa） 、 唐古特白刺 （N.tangutorum） 、 西伯利亚白刺 （N.

8、sibirica） 、 盐生白刺 （N.schoberi L.） 和 帕米尔白刺 （N.pamirica） 等 7 种。白刺属植物系第三纪孑遗植物， 通常高 0.5 2m， 具有 极强的抗干旱和耐盐碱能力， 是荒漠戈壁地区植被生态系统的重要建群种之一， 具有重要 的生态、 经济价值。 白刺属耐高温干旱或重盐碱胁迫， 抗风蚀沙埋、 枝茎机械组织发达， 近地 面匍匐丛生， 对多风环境具有良好的适应能力 ； 萌生能力强， 被沙土埋覆后能产生大量不定 根， 从而形成新的植株， 形成白刺沙堆， 可拦蓄和固定大量流沙。它们还是沙生植物中少有 的药食两用的浆果类植物， 其果实酸甜可口， 富含各种氨基酸、 维

9、生素 C、 多种微量元素等各 类生理活性物质， 其中氨基酸、 黄酮和糖总含量均高于沙棘， 有非常好的开发利用前景。从 其果实、 叶片、 幼枝、 种子等提取的次生代谢物质 （主要为黄酮类化合物） 具有重要的药用价 值， 具有健脾胃、 助消化和安神解表之功效， 在食用、 药用、 保健等方面具有很大开发利用潜 力。 0003 唐古特白刺是适合在我国西北部沙漠地区干旱、 盐碱环境条件下生长的重要树 种， 并且具有重要的经济价值。 近年来随着荒漠化的治理改造的进行， 良种种苗得到高度重 视。 关于白刺属植物的组织培养进行过初步的研究， 本专利提供的方法适合唐古特白刺、 泡 果白刺等白刺属植物成年树的快速

10、高效繁殖。 发明内容 0004 发明目的 ： 针对现有技术中存在的不足， 本发明的目的是提供一种唐古特白刺无 性系离体植株再生培养方法， 以实现提供周期短、 效率高、 成本低的唐古特白刺苗木的生产 技术。 0005 技术方案 ： 为了实现上述发明目的， 本发明采用的技术方案为 ： 0006 一种唐古特白刺无性系离体生根培养方法， 包括以下步骤 ： 0007 （1） 选取白刺优良成年树的当年生新枝条的叶片为组织培养材料， 经清洗、 消毒后 接入愈伤组织诱导培养基培养， 使高度分化的叶片脱分化为愈伤组织， 其中， 愈伤组织诱导 培养基配方为 1/2MS 2,4-D2mgL-1 BA0.2mgL-1

11、 NAA0.2mgL-1+ 水解酪蛋白 （CH） 1gL-1+ 蔗糖 3%， 培养条件为 23， 暗培养， 培养材料每 25 天继代培养一次 ； 0008 （2）将愈伤组织接入继代增殖培养基进行继代增殖培养， 诱导分化出不定芽， 然后将不定芽转入 MS 培养基上进行伸长培养 ； 其中， 继代增殖培养基配方为 3/4MS 6BA0.3mgL-1 NAA0.02mgL-1蔗糖 3% ； 说 明 书 CN 103250643 B 3 2/3 页 4 0009 （3） 待不定芽长到 2-3cm 时， 转入生根培养基， 生根培养基为 1/2MS， 植物生长调节 剂为 IBA0.5 2mgL-1。 001

12、0 其中， 步骤 （1） 操作完成后， 直接进行以下操作， 然后直接进行步骤 （3） 操作 0011 1） 当愈伤组织鲜重达到 2g 时， 转入液体培养基中进行悬浮培养， 将愈伤组织进行 增殖并分散成小细胞团或单细胞 ； 液体悬浮培养基以 1/2MS 为基本培养基， 在其中添加植 物生长调节剂和 3% 蔗糖 ； 植物生长调节剂为 2,4-D2mgL-1、 BA0.2mgL-1； 液体悬浮培养 基中添加水解酪蛋白 1gL-1， 天冬酰胺 （ASN） 200mgL-1； 液体培养条件为摇床转速 90rpm， 23， 暗培养， 液体材料每 7 天继代培养一次 ； 0012 2） 将步骤 1） 的悬浮

13、培养细胞转入不定芽诱导培养基， 悬浮培养的单细胞或者 小细胞团在不定芽诱导培养基上经过 1 个月的生长会产生不定芽 ； 不定芽诱导培养基为 MS+KT1mgL-1 BA1mgL-1 NAA0.2mgL-1+ 蔗糖 3%， 培养条件为 25， 16h 光培养， 培养 材料每 25 天继代培养一次 ； 经过 1-2 次继代培养后， 培养细胞再分化为不定芽 ； 不定芽生 长在 MS 基本培养基上进行， 添加 30gL-1蔗糖。 0013 所述新枝条的叶片的清洗、 消毒方法为 ： 经流水冲洗 2h， 70% 乙醇处理 1min， 0.1%HgCl 处理 10min， 即可。 0014 有益效果 ： 与

14、现有技术相比， 本发明的唐古特白刺无性系离体植株再生培养方法， 有效解决了白刺优良成年树在组织培养条件下的植株再生问题， 实现白刺稳定高效的组培 体系， 提供大量唐古特白刺种植材料， 缓解社会对唐古特白刺苗木的紧迫需求， 为加快白刺 组培苗植株再生提供技术支撑。是一种周期短、 效率高、 成本低的良种苗木的生产技术， 具 有很好的实用性。 附图说明 0015 图 1 由唐古特白刺叶片诱导的愈伤组织图 ； 0016 图 2 从愈伤组织上产生不定芽 ； 0017 图 3 不定芽的生长 ； 0018 图 4 唐古特白刺的生根图。 具体实施方式 0019 下面结合具体实施例最本发明做进一步的说明。 00

15、20 实施例 1 0021 一种唐古特白刺无性系离体生根培养方法， 包括以下步骤 ： 0022 （1）选取唐古特白刺优良成年树的当年生新枝条的叶片为组织培养材料， 经 流水冲洗 2h， 70% 乙醇处理 1min， 0.1%HgCl 处理 10min 后接入愈伤组织诱导培养基培 养， 使高度分化的叶片脱分化为愈伤组织。其中， 愈伤组织诱导培养基配方为 1/2MS 2,4-D2mgL-1 BA0.2mgL-1 NAA0.2mgL-1+ 水解酪蛋白 （CH） 1gL-1+ 蔗糖 3%。培养 条件为 23， 暗培养， 培养材料每 25 天继代培养一次， 一般培养 10 天后叶片脱分化形成愈 伤组织，

16、 如图 1 所示。 0023 （2）继代增殖培养基进行继代增殖培养， 诱导分化出不定芽， 然后将不定芽转 入 MS 培养基上进行伸长培养 ； 其中， 继代增殖培养基配方为 3/4MS 6BA0.3mgL-1 说 明 书 CN 103250643 B 4 3/3 页 5 NAA0.02mgL-1蔗糖 3% ； 0024 （4） 不定芽生长在 MS 基本培养基上进行， 添加 30gL-1蔗糖， 16h 光照 /8h 暗培 养， 如图 3 所示 ； 0025 （5） 待不定芽长到 2-3cm 时， 转入生根培养基， 生根培养基为 1/2MS， 添加植物生长 调节剂， 为 IBA0.5 2mg L-1

17、。生根培养在光照条件下进行 （16h 光照 /8h 暗培养） ， 培养 20 天后有健康根系长出， 唐古特白刺的生根图， 如图 4 所示。 0026 生根后， 进行常规培养， 即可实现植株的再生和培育成苗。 0027 实施例 2 0028 一种唐古特白刺无性系离体生根培养方法， 包括以下步骤 ： 0029 （1）选取唐古特白刺优良成年树的当年生新枝条的叶片为组织培养材料， 经 流水冲洗 2h， 70% 乙醇处理 1min， 0.1%HgCl 处理 10min 后接入愈伤组织诱导培养基培 养， 使高度分化的叶片脱分化为愈伤组织。其中， 愈伤组织诱导培养基配方为 1/2MS 2,4-D2mgL-1

18、 BA0.2mgL-1 NAA0.2mgL-1+ 水解酪蛋白 （CH） 1gL-1+ 蔗糖 3%。培养 条件为 23， 暗培养， 培养材料每 25 天继代培养一次， 如图 1 所示。 0030 （2） 步骤 （1） 的愈伤组织鲜重达到 2g 时， 转入液体培养基中进行悬浮培养， 将愈伤 组织进行增殖并分散成小细胞团或单细胞 ； 液体悬浮培养基以 1/2MS 为基本培养基， 在其 中添加植物生长调节剂和 3% 蔗糖 ； 植物生长调节剂为 2,4-D2mgL-1、 BA0.2mgL-1； 液体 悬浮培养基中添加水解酪蛋白 1gL-1， 天冬酰胺 （ASN） 200mgL-1； 液体培养条件为摇床转

19、 速 90rpm， 23， 暗培养， 液体材料每 7 天继代培养一次。 0031 （3）步骤 （2）的悬浮培养细胞转入不定芽诱导培养基， 悬浮培养的单细胞或者 小细胞团在不定芽诱导培养基上经过 1 个月的生长会产生不定芽 ； 不定芽诱导培养基为 MS+KT1mgL-1 BA1mgL-1 NAA0.2mgL-1+ 蔗糖 3%， 培养条件为 25， 16h 光培养， 培 养材料每25天继代培养一次 ； 经过1-2次继代培养后， 培养细胞再分化为不定芽， 如图2所 示。 0032 （4） 不定芽生长在 MS 基本培养基上进行， 添加 30gL-1蔗糖， 16h 光照 /8h 暗培 养， 如图 3 所示 ； 0033 （5） 待不定芽长到 2-3cm 时， 转入生根培养基， 生根培养基为 1/2MS， 添加植物生长 调节剂， 为 IBA0.5 2mgL-1。唐古特白刺的生根图， 如图 4 所示。 0034 生根后， 进行常规培养， 即可实现植株的再生和培育成苗。 说 明 书 CN 103250643 B 5 1/1 页 6 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103250643 B 6