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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510010242.3 (22)申请日 2015.01.09 A01H 4/00(2006.01) (73)专利权人 陈平 地址 430000 湖北省武汉市常青花园学府南 路 68 号 专利权人 张绍鹏 高佩 黄璐琦 宋佳 杨涛 孙巧 伍翀 王如峰 邓琛 陈超 霍梦蕊 (72)发明人 陈平 张绍鹏 高佩 黄璐琦 杨涛 宋佳 孙巧 伍翀 王如峰 邓琛 郑用琏 陈超 霍梦蕊 (74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001 代理人 王敏锋 (54) 发明名称 一种野生竹节参无糖开放式组织培养快速育 苗方法 (57) 摘要 本发明公开。
2、了一种野生竹节参无糖开放式组 织培养快速育苗方法， A、 取野生竹节参幼苗的茎 或叶， 经表面灭菌处理 B、 将步骤 A 处理的外植体 接种至竹节参无糖组织培养初代培养基中， 置于 上开口的透明玻璃植物生长箱进行初代培养 ； C、 将步骤 B 培养的无根苗进行筛选并用无菌水冲 洗， 将冲洗干净的无根苗切割为单苗 ； D、 将经步 骤 C 处理的单苗接种至竹节参无糖组织培养继代 培养基中， 置于透明玻璃植物生长箱进行继代培 养。E、 将 D 中得到的植株移栽于腐殖土和蛭石混 合的土壤中， 按常规方式培植。 利用本发明所述方 法， 外植体的分化率在90%以上， 增值率可达4.2， 污染率极少， 获。
3、得的都是可以用于种植的合格健 壮组培苗， 移栽成活率在 98% 以上。 (51)Int.Cl. 审查员 胡可 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 CN 104604678 B 2016.05.04 CN 104604678 B 1.一种野生竹节参无糖开放式组织培养育苗方法， 其步骤如下： A.外植体的选取与消毒处理： 取野生竹节参幼苗的茎或叶， 经表面灭菌处理后， 在无菌 条件下将茎切段、 叶切片作为组培用的外植体； B.初代无糖组织培养： 将经步骤A处理的外植体接种至竹节参无糖组织培养初代培养 基中， 置于上开口的透明玻璃植物生长箱进行初代培养。
4、； C.无根苗筛选： 将经过步骤B培养的无根苗进行筛选， 选择大小为1-2.5cm的无根苗并 用无菌水冲洗， 将冲洗干净的无根苗切割为1-2.5cm单苗； D.继代无糖组织培养： 将经步骤C处理的单苗接种至竹节参无糖组织培养继代培养基 中， 置于透明玻璃植物生长箱进行继代培养； E.植株的移栽： 将D中得到的35cm高的植株移栽于腐殖土和蛭石按体积比为5:1混合 的土壤中， 按常规方式培植； 所述的竹节参无糖组织培养初代培养基的配方为： 不含糖和琼脂的MS+GA30.81.2mg/ L+6-BA 2.03.5mg/L+椰子汁100150g/L+活性炭200300mg/L+0.25毫米的蛭石8 。
5、10g/L， pH为5.8； 步骤B的培养周期2545天， CO2浓度65050 L/L， 培养温度2227， 利用LED灯进 行光照， 光质红光： 蓝光为1:13:1， 光照强度15002500Lx， 光照时间1016小时/天； 所述的竹节参无糖组织培养继代培养基的配方为： 不含糖和琼脂的MS+6-BA0.8 1.2mg/L+IBA 2.73.3mg/L+椰子汁100150g/L+活性炭300600mg/L+0.25毫米的蛭石 810g/L， pH为5.8； 步骤D的培养周期3050天， CO2浓度65050 L/L， 培养温度2227， 利用LED灯进 行光照， 光质红光： 蓝光为1:13。
6、:1， 光照强度15002500Lx， 光照时间1016小时/天； 所述的上开口的透明玻璃植物生长箱在培养箱中离液体培养基液面以上0.5cm处设置 有进气口， 在培养箱中离液体培养基液面以上2cm处设置有二氧化碳监测仪， 二氧化碳与空 气的混合气体通过进气口进入植物生长箱中， 通过调整二氧化碳与空气的比例， 使得二氧 化碳检测仪检测的二氧化碳浓度在65050 L/L。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于： 所述的竹节参无糖组织培养初代培养基的 配方为： 不含糖和琼脂的MS培养基+1.2mg/L或1.0mg/L GA3+3.0mg/L 6-BA+130g/L椰子汁 +250mg/L活性炭。
7、+10g/L 0.25毫米的蛭石， pH为5.8； 当外植体为茎时， 培养基中GA3的含量 为1.2mg/L； 当外植体为叶时培养基中GA3的含量为1.0mg/L； 6-BA的含量为3.0mg/L。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于： 所述的竹节参无糖组织培养继代培养基的 配方为： 不含糖和琼脂的MS培养基+1.0mg/L 6-BA+3.0mg/L IBA+130g/L椰子汁+450mg/L活 性炭+10g/L 0.25毫米的蛭石， pH为5.8。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于： 步骤B的培养条件为CO2浓度650 L/L， 培养 温度24， 利用LED灯进行光照， 光。
8、质红光： 蓝光为2:1， 光照强度2000Lx， 光照时间13小时/ 天。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于： 步骤D的培养条件为CO2浓度650 L/L， 培养 温度24， 利用LED灯进行光照， 光质红光： 蓝光为2:1， 光照强度2000Lx， 光照时间15小时/ 天。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104604678 B 2 一种野生竹节参无糖开放式组织培养快速育苗方法 技术领域 0001 本发明涉及植物组织培养技术领域， 主要是野生竹节参的无糖开放式组织培养快 速育苗的方法。 背景技术 0002 竹节参(Panaxjaponicus C.A.Meyer)为五加科。
9、人参属多年生草本植物， 是我国珍 稀濒危的名贵七类 中草药之一， 被誉为草药之王 ， 具有 北药人参滋补强壮和 南药 三七活血化瘀之功效， 有抗炎镇痛、 免疫调节、 抗心肌缺血、 降血糖、 抗衰老、 抗疲劳、 抗癌和改善学习记忆功能等多种生物活性。 0003 近年来， 由于竹节参具有多种药理作用而广泛运用于临床， 导致其需求量增大， 长 期以来因为竹节参药用价值高而导致民间以杀鸡取卵的方式进行采挖， 这一利用行为使得 本来就稀少的野生竹节参资源变得即将濒临灭绝。 所以仅仅依靠野生原料药的供应， 在数 量和质量上都很难以满足国内医药市场的需要。 因此， 开展竹节参大规模、 工厂化育苗是保 存竹节。
10、参种质资源和开发利用的重要基础， 也是延长产业链的关键。 0004 在竹节参皂苷类物质开发利用层面， 随着竹节参皂苷类物质的提取、 分离技术的 日趋成熟， 一些药物生产厂家争相开发口服液、 胶囊、 复方含片及提取中间体等产品， 而日 本、 东欧等外商也纷纷要求从中国订购竹节参皂苷， 可见， 大力发展以竹节参药材为原材料 的产业链， 具有巨大的市场前景和经济效益。 0005 多数学者在民间应用、 化学成分研究、 生物活性分析、 栽培管理等方面对竹节参做 了大量的研究工作， 为竹节参的深层次开发利用和产业化发展提供了宝贵的科学资料， 但 要实现竹节参植物资源可持续利用， 还有一系列的工作要做， 而。
11、目前面对产业化发展急需 解决种苗问题。 0006 大量研究已经证实， 高度分化的植物细胞仍然保持着细胞分化的全能性。 基于植 物细胞的全能性， 建立植物体外培养体系， 可以在短时间内繁育出大量的植株幼苗， 是解决 目前竹节参种质资源保护和合理开发利用之间矛盾的关键。 理论上， 植物体的各个器官， 组 织细胞及原生质体都可以做外植体。 但在实际组织培养过程中， 需要对外植体进行选择， 因 为不同来源的外植体， 在离体条件下对环境因子的敏感性不同， 生长潜力也不一样， 细胞恢 复分裂能力或愈伤组织再次分化的能力也有差异。 如果选择不好， 就很难获得培养的成功。 因此， 合适外植体的选择是确保组织培。
12、养是否成功的关键。 0007 目前， 竹节参属各个部位， 如茎尖， 茎节， 皮层， 子叶， 花梗等都能成功诱导出愈伤 组织。 研究表明竹节参种子繁殖速度慢。 牟的雅(2000)的研究表明， 竹节参属植物中的叶片 作为外植体其愈伤组织的诱导率最高， 达到100。 目前在申请号:200610052487.3的专利 中就是采用的外植体是野生竹节参的叶和茎。 0008 植物组织培养技术自20世纪初建立以来， 在理论研究和应用技术上不断发展， 广 泛应用于植物的快速繁殖、 品种改良、 基因工程育种、 种质资源保存、 次生代谢产物生产等 方面， 产生了巨大的经济效益和社会效益， 对现代农业和医药等领域产生。
13、了深刻影响,。 但 说 明 书 1/5 页 3 CN 104604678 B 3 这些传统组培技术,培育出的苗生长缓慢、 污染严重、 存活率低等， 会导致成本过高,不利于 组培苗的大规模商品化生产,无法满足市场对高质量低价位组培苗的需求。 随着对植物组 织培养技术的不断深入研究， 植物无糖组培快繁技术将解决这些问题。 0009 传统竹节参组织培养主要依靠培养基中的糖作为碳源， 极易引起微生物的污染。 为了减少微生物的污染， 必须使用封闭的、 小的培养容器。 培养容器小， 并且由于培养基中 糖的存在， 导致叶片表层结构发育差， 气孔开闭功能不强， 叶片小， 叶绿素含量低， 最终抑制 和降低了小植。
14、株的光合作用能力。 与植株自然生长差异悬殊的容器内环境， 还导致植株生 理、 形态上的一定紊乱， 难以适应的会生长发育延缓或死亡， 有的会出现植株生长细弱， 叶 片舒展度差， 生根不良， 引起驯化阶段植株较高的死亡率。 传统组织培养以荧光灯为光源， 植物对其光源利用度低。 0010 为解决竹节参产业化发展的技术瓶颈， 我们开展了以竹节参茎和叶为基础的无糖 开放式组织培养， 以CO2代替糖作为植物体的碳源， 建立植株再生体系， 以满足药农对竹节 参种苗的需求。 发明内容 0011 本发明要解决上述现有问题， 缩短培养周期， 并且降低组培苗生产成本； 提供一种 以野生竹节参茎和叶为基础的无糖开放式。
15、组织培养快速育苗方法。 0012 为了达到上述目的， 本发明的技术方案是： 0013 一种野生竹节参无糖开放式组织培养育苗方法， 其步骤如下： 0014 A、 外植体的选取与消毒处理： 取野生竹节参幼苗的茎或叶， 经表面灭菌处理后， 在 无菌条件下将茎切段(1cm长)、 叶切片(1cm1cm)作为组培用的外植体； 0015 B、 初代无糖组织培养： 将经步骤A处理的外植体接种至竹节参无糖组织培养初代 培养基中， 置于上开口的透明玻璃植物生长箱进行初代培养； 0016 C、 无根苗筛选： 将经过步骤B培养的无根苗进行筛选， 选择大小为12.5cm的无根 苗并用无菌水冲洗， 将冲洗干净的无根苗切割。
16、为1-2.5cm单苗； 0017 D、 继代无糖组织培养： 将经步骤C处理的单苗接种至竹节参无糖组织培养继代培 养基中， 置于透明玻璃植物生长箱进行继代培养。 0018 E、 植株的移栽： 将D中得到的35cm高的植株移栽于腐殖土和蛭石按体积比为5:1 混合的土壤中， 按常规方式培植。 0019 所述的竹节参无糖组织培养初代培养基的配方为： 不含糖和琼脂的MS+GA30.8 1.2mg/L+6-BA 2.03.5mg/L+椰子汁100150g/L+活性炭200300mg/L+0.25毫米的蛭石 810g/L， PH为5.8。 优选配方为不含糖和琼脂的MS培养基+1.2mg/L或1.0mg/L 。
17、GA3+3.0mg/ L 6-BA+130g/L椰子汁+250mg/L活性炭+10g/L 0.25毫米的蛭石， PH为5.8； 当外植体为茎 时， 培养基中GA3的含量为1.2mg/L； 当外植体为叶时培养基中GA3的含量为1.0mg/L； 6-BA的 含量为3.0mg/L。 0020 步骤B的培养周期2545天， CO2浓度65050 L/L， 培养温度2227， 利用LED 灯进行光照， 光质红光： 蓝光为1:13:1， 光照强度15002500Lx， 光照时间1016小时/ 天。 优选培养条件为CO2浓度650 L/L， 培养温度24， 利用LED灯进行光照， 光质红光： 蓝光 为2:1。
18、光照强度2000Lx， 光照时间13小时/天。 说 明 书 2/5 页 4 CN 104604678 B 4 0021 步骤D所述的竹节参无糖组织培养继代培养基的配方为： 不含糖和琼脂的MS+6- BA0.81.2mg/L+IBA 2.73.3mg/L+椰子汁100150g/L+活性炭300600mg/L+0.25毫米 的蛭石810g/L， pH为5.8。 优选继代培养基配方为： 不含糖和琼脂的MS培养基+1.0mg/L6- BA+3.0mg/L IBA+130g/L椰子汁+450mg/L活性炭+10g/L 0.25毫米的蛭石， PH为5.8。 0022 步骤D的培养周期3050天， CO2浓。
19、度65050 L/L， 培养温度2227， 利用LED 灯进行光照， 光质红光： 蓝光为1:13:1， 光照强度15002500Lx， 光照时间1016小时/ 天。 优选培养条件为CO2浓度650 L/L， 培养温度24， 利用LED灯进行光照， 光质红光： 蓝光 为2:1， 光照强度2000Lx， 光照时间15小时/天。 0023 所述的上开口透明玻璃植物生长箱在培养箱中离液体培养基液面以上0.5cm处设 置有进气口， 在培养箱中离液体培养基液面以上2cm处设置有二氧化碳监测仪， 二氧化碳与 空气的混合气体通过进气口进入植物生长箱中， 通过调整二氧化碳与空气的比例， 使得二 氧化碳检测仪检测。
20、的二氧化碳浓度在65050 L/L。 0024 本发明的这种竹节参无糖组织培养方法与传统竹节参组织培养方法优点在于： 0025 (1)碳源的改变： 在传统的植物组培快繁技术中， 小植株以糖(如蔗糖、 葡萄糖、 果 糖等)作为主要碳源进行异养或兼养生长， 糖被看作是植物组织培养中必不可少的物质。 而 本发明中则用CO2替代糖作为小植株生长的唯一碳源， 通过强制性换气系统供给小植株生 长所需CO2， 使其在人工光照下， 吸收CO2进行完全的自养生长， 在一定程度上避免了微生物 的污染。 0026 (2)培养基质的改变： 在传统的组织培养中， 通常使用琼脂作为培养基质， 它的透 气性差， 不利于水分。
21、、 气体和营养物质的移动和吸收。 本发明使用蛭石作为培养基质， 此基 质具有良好的透气性， 可以极大地提高小植株的生根率和生根质量， 而且与琼脂相比， 此无 机基质价格相对低廉， 节约了培养成本。 0027 (3)培养容器的改变： 在传统的组织培养中， 由于培养基中糖的存在， 为了防止污 染， 只能使用小的培养容器。 本发明在培养过程中不使用糖及各类有机物质， 极大地避免了 污染的发生， 因此选用透光性好的玻璃外壳植物生长箱作为培养容器， 既可以人工控制CO2 浓度又可以人工控制光照强度， 充分利用光源。 0028 (4)光源的改变： 在传统的组织培养中， 通常使用的荧光灯作为光源， 有体积大。
22、、 寿 命短、 耗能高、 波长不固定、 发热高等缺点。 光是影响植物生长发育的重要因素之一， 光质对 植物的生长、 形态建成、 光合作用、 物质代谢以及基因表达均有调控作用。 新型的照明光源 的发光二极管(light emitting diode， LED)其波长正好与植物光合成和光形态建成的光 谱范围吻合， 光能有效利用率可达8090， 并能对不同光质和发光强度实现单独控制。 最新研究发现,光质比例和光照强度可调的LED光源比通常植物组织培养使用的荧光灯更 能有效地促进试管苗的光合作用和生长发育。 在植物组织培养中采用LED提供照明， 调控光 质和光合光量子通量密度， 不仅能够调控组培植物的。
23、生长发育和形态建成， 缩短培养周期， 还能节约能耗， 降低生产成本。 除此之外， LED还具有体积小、 寿命长、 耗能低、 波长固定、 发 热低等优点， 而且还能根据植物的生长需要进行发光光谱的精确配置， 实现传统光源无法 替代的节能、 环保和空间高效利用等功能。 0029 (5)继代与生根培养过程合二为一， 且没有愈伤组织的发生； 培养周期缩短了40 以上。 说 明 书 3/5 页 5 CN 104604678 B 5 0030 (6)节省投资， 降低生产成本。 与传统的微繁殖技术相比， 种苗生产综合成本平均 降低30。 组培生产工艺的简单化， 流程缩短， 技术和设备的集成度提高， 降低了操。
24、作技术 难度和劳动作业强度， 更易于在规模化生产上推广应用。 0031 (7)利用本发明所述方法， 外植体的分化率在90以上， 增值率可达4.2， 污染率极 少， 获得的都是可以用于种植的合格健壮组培苗， 移栽成活率在98以上。 具体实施方式 0032 下面结合实施例对本发明作进一步介绍： 但本发明的内容并不局限于此。 0033 实施例1： 0034 (1)、 外植体的选取与消毒处理： 取56月份野生竹节参幼苗的茎作为外植体， 将 其浸泡在酒精体积百分含量为75的烧杯中45秒进行灭菌， 然后用无菌水冲洗2次； 在无菌 条件下将茎切成1cm长作为组培用的外植体； 0035 (2)、 初代无糖组织。
25、培养： 将经步骤(1)处理的外植体接种至竹节参无糖组织培养 初代培养基中， 置于上开口透明玻璃植物生长箱进行初代培养。 培养周期为35天， CO2浓度 650 L/L， 培养温度为24， 利用LED灯进行光照， 光质红光： 蓝光为2:1， 光照强度为2000Lx， 光照时间13小时/天。 0036 所述竹节参无糖组织培养初代培养基为： 不含糖和琼脂的MS培养基+1.2mg/L GA3 +3.0mg/L 6-BA+130g/L椰子汁+250mg/L活性炭+10g/L 0.25毫米的蛭石， pH为5.8。 0037 外植体分化率达90-93,在培养35天后生成无根苗的长度在1.4cm-2.2cm,。
26、且无 愈伤组织生成。 0038 所述的上开口透明玻璃植物生长箱在培养箱中离液体培养基液面以上0.5cm处设 置有进气口， 在培养箱中离液体培养基液面以上2cm处设置有二氧化碳监测仪， 二氧化碳与 空气的混合气体通过进气口进入植物生长箱中， 通过调整二氧化碳与空气的比例， 使得二 氧化碳检测仪检测的二氧化碳浓度在650 L/L。 0039 (3)、 无根苗筛选： 将经过步骤(2)培养的无根苗进行筛选， 选择大小达1.72.2cm 的无根苗并用无菌水冲洗， 将冲洗干净的无根苗切割为单苗； 0040 (4)、 继代无糖组织培养： 将经步骤(3)处理的单苗接种至竹节参无糖组织培养继 代培养基中， 置于。
27、上开口透明玻璃植物生长箱进行继代培养。 培养周期为40天， CO2浓度650 L/L， 培养温度为24， 利用LED灯进行光照， 光质红光： 蓝光为2:1， 光照强度为2000Lx， 光 照时间15小时/天。 0041 所述竹节参无糖组织培养继代培养基为： 不含糖和琼脂的MS培养基+1.0mg/L6-BA +3.0mg/L IBA+130g/L椰子汁+450mg/L活性炭+10g/L 0.25毫米的蛭石， pH为5.8。 0042 培养40天后平均增值系数为3.9。 0043 (5)植株的移栽： 将(4)中得到的35cm高的植株移栽于腐殖土和蛭石按体积比为 5:1混合的土壤中， 进行常规培植即。
28、可。 0044 实施例2： 0045 一种野生竹节参无糖开放式组织培养育苗方法， 包括以下步骤： 0046 (1)、 外植体的选取与消毒处理： 取56月份野生竹节参幼苗的叶作为外植体， 将 其浸泡在酒精体积百分含量为75的烧杯中60秒进行灭菌， 然后用无菌水冲洗2次； 在无菌 说 明 书 4/5 页 6 CN 104604678 B 6 条件下将叶切成1cm1cm大小作为组培用的外植体； 0047 (2)、 初代无糖组织培养： 将经步骤(1)处理的外植体接种至竹节参无糖组织培养 初代培养基中， 置于上开口透明玻璃植物生长箱进行初代培养。 培养周期为35天， CO2浓度 650 L/L， 培养温。
29、度为24， 利用LED灯进行光照， 光质红光： 蓝光为2:1， 光照强度为2000Lx， 光照时间13小时/天。 0048 所述竹节参无糖组织培养初代培养基为： 不含糖和琼脂的MS培养基+1.0mg/L GA3 +3.0mg/L 6-BA+130g/L椰子汁+250mg/L活性炭+10g/L 0.25毫米的蛭石， pH为5.8。 0049 所述的上开口透明玻璃植物生长箱在培养箱中离液体培养基液面以上0.5cm处设 置有进气口， 在培养箱中离液体培养基液面以上2cm处设置有二氧化碳监测仪， 二氧化碳与 空气的混合气体通过进气口进入植物生长箱中， 通过调整二氧化碳与空气的比例， 使得二 氧化碳检测。
30、仪检测的二氧化碳浓度在650 L/L。 0050 经过步骤(2)后， 外植体分化率达96-98,在培养35天后生成无根苗的长度在 1.5-2.5cm,且无愈伤组织生成。 0051 (3)、 无根苗筛选： 将经过步骤(2)培养的无根苗进行筛选， 选择大小达1.8-2.5cm 的无根苗并用无菌水冲洗， 将冲洗干净的无根苗分割为各1.8-2.5cm的单苗； 0052 (4)、 继代无糖组织培养： 将经步骤(3)处理的单苗接种至竹节参无糖组织培养继 代培养基中， 置于上开口透明玻璃植物生长箱进行继代培养。 培养周期为40天， CO2浓度650 L/L， 培养温度为24， 利用LED灯进行光照， 光质红。
31、光： 蓝光为2:1， 光照强度为2000Lx， 光 照时间15小时/天。 0053 所述竹节参无糖组织培养继代培养基为： 不含糖和琼脂的MS培养基+1.0mg/L6-BA +3.0mg/L IBA+130g/L椰子汁+450mg/L活性炭+10g/L 0.25毫米的蛭石， pH为5.8。 0054 培养40天后平均增值系数为4.2。 0055 (5)植株的移栽： 将(4)中得到的35cm高的植株移栽于腐殖土和蛭石按体积比为 5:1混合的土壤中， 进行常规培植即可。 0056 红光培养的植株与阴生植物相似， 红光可促进幼苗的生长， 红光处理的幼苗干物 质积累多， 营养生长旺盛。 竹节参属于阴生植物； 所以光照时红光要多于蓝光， 光照强度相 对较弱， 更利于组培苗的生长。 0057 通过上述实验显示： 本发明的两组实施例培养基中污染率在1之内,仅有少量的 菌斑,不影响组培苗的正常生长； 在培养周期75天左右达到茎高4左右， 根数4根， 叶片数5 片可以用于种植的合格健壮组培苗， 在初代无糖组织培养中以叶为外植体比以茎为外植体 得到的无根苗要健壮些， 可能是因为叶片能更好的进行光合作用， 利用碳源。 其组培苗移栽 成活率达到98以上。 说 明 书 5/5 页 7 CN 104604678 B 7 。