脱氧mugineic酸合酶及其基因 【技术领域】
本发明涉及一种在mugineic酸的生物合成过程中将酮-烟酰胺还原成2’-脱氧mugineic酸的还原酶，该mugineic酸参与植物体内的铁-获得性机制；一种编码该酶的基因；和一种由于其中转入了上述基因而对铁-缺乏具有高耐受性的植物。本发明还涉及用于构建一种对铁-缺乏具有高耐受性的植物的酶试剂盒和基因试剂盒，所述试剂盒包含用于生物合成mugineic酸的酶或编码该酶的基因，所述mugineic酸参与植物体内的铁-获得性机制。
背景技术
铁是地表中含量第四丰富的元素而且是植物的必需元素。在有氧存在的普通需氧状况下，铁以不溶性三价铁的形式存在，而植物不能吸收不溶性形式的铁。特别是，在富含石灰石的地方，土壤成为碱性土壤，多种植物不能吸收非溶解形式的铁并且由于铁的缺乏而枯萎。
通过溶解非溶解形式的三价铁而使植物获得了吸收铁的机制从而能够对植物的必需元素-铁加以吸收和利用。已知被称作“途径I”和“途径II”的两种方法是被用来溶解非溶解形式地三价铁并对其进行吸收的机制。
在被称作“途径I”的机制中，通过由根部释放质子而降低假根球体(rizosphere)中的pH来溶解非溶解形式的Fe3+，并通过根表面上的铁还原酶来将Fe3+还原成Fe2+，接着二价铁的转运蛋白将二价铁转运到胞内。这种铁-获得机制被双子叶植物和单子叶植物所采用而不被禾本科植物所采用。另一方面，禾本科植物通过高度灵活的机制吸收铁，在该机制中被统称为植物铁载体的天然铁螯合剂mugineic酸由根部分泌出来，土壤中的非溶解形式的三价铁以“铁-mugineic酸”螯合物的形式被溶解从而以螯合物的形式被根部吸收。禾本科植物的这种获得铁的机制被称作“途径II”。
mugineic酸(MA)是由下式表示的化合物：
其具有含氮原子的4员环，并且该mugineic酸及其五种衍生物已经被确认为是天然的铁螯合剂而被统称为与三价铁形成螯合物的植物铁载体。该五种衍生物分别是脱氧mugineic酸(DMA)，该脱氧mugineic酸(DMA)是mugineic酸的前体并且不含羟基；燕麦酸(avenicacid)(AVA)，该燕麦酸(AVA)是一种开环形式的脱氧mugineic酸(DMA)；3-羟基mugineic酸(HMA)和3-表-羟基mugineic酸((表)-HMA)，其中羟基与mugineic酸的氮杂环丁烷环连接；以及disticomic酸，该disticomic酸是一种开环形式的3-羟基mugineic酸。
图1中列出了mugineic酸及其衍生物的化学结构式以及它们的生物合成途径。首先，通过S-腺苷甲硫氨酸合酶由甲硫氨酸生成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。然后，通过烟酰胺合酶结合三个分子的S-腺苷甲硫氨酸从而产生一个分子的烟酰胺(NA)。烟酰胺氨基转移酶将所生成的烟酰胺转化成3’-酮体，然后，某一还原酶将3’-酮体转化成2’-脱氧mugineic酸(DMA)。2’-脱氧mugineic酸(DMA)被进一步水解成包括mugineic酸(MA)在内的其它mugineic酸衍生物(Mori和Nishizawa，植物细胞生理学(Plant Cell Physiol.)，28：1081-1092，1987；Shojima等，生物金属(Biol.Metals)，2：142-145。1989；Shojima等，植物生理学(PlantPhysiol.)，93：1497-1503，1990)。
Mugineic酸的合成与分泌能够被铁-缺乏状态强烈地诱导。存在6种已知的mugineic酸。mugineic酸的类型和分泌量随着禾本科植物种类不同而不同，而且可以肯定这种差异造成在禾本科植物种类之间存在着对铁-缺乏的耐受力的差异。
水稻、玉米和小麦分泌DMA，该DMA是mugineic酸的生物合成途径中的第一种mugineic酸。大麦分泌DMA、MA以及其它羟基化的(表)-HMA。黑麦分泌DMA、MA和HMA。燕麦分泌DMA和燕麦酸(VAV)。迄今为止已经验证了具有“途径II”的铁-获得机制的所有禾本科植物都分泌DMA，因此认为这些植物具备生物合成DMA的途径。
在mugineic酸的生物合成途径中，烟酰胺合酶(NAS)催化由SAM生成NA的反应的活性以及烟酰胺氨基转移酶(NAAT)催化由NA生成酮体的反应的活性通过铁-缺乏处理而被强烈诱导(Kanazaw等，ed J.Abadia，37-41，1995)。这两种酶被从铁-缺乏大麦的根部纯化出来而且它们的基因也得到克隆(Takahashi等，植物生理学(Plant Physiol.)，121：947-956，1999；Higuchi等，植物生理学(Plant Physiol.)，119：471-479，1999)。
IDS3是一种参与将DMA转化为MA的蛋白质。通过铁缺乏处理Ids3基因能够进行最高的表达(Takahashi等，植物细胞生理学(Plant CellPhysiol.)，34：401-410，1993)。在禾本科植物当中，在大麦和黑麦中检测到了IDS3蛋白及其在生物合成途径中的下游中间体，所述大麦和黑麦分泌包括MA在内的mugineic酸。在实验过程中，分别采用了其中将大麦的每一条染色体插入到小麦的基因组的小麦-大麦染色体插入突变株，仅在插入了大麦的第四条染色体的植物中分泌MA，仅在插入了大麦的第四条染色体的突变株中表达IDS3，因此产生这样一种假设，即IDS3可能是mugineic酸合酶。而且最近，通过对具有转入的Ids3基因的被转化水稻分泌的mugineic酸进行分析，结果发现除了DMA外，还分泌MA。通过综合考虑，得出了IDS3是mugineic酸合酶的结论。
而且，还分离出了SAM合酶的基因，该SAM合酶能够由甲硫氨酸产生SAM(Takizawa等，植物核酸杂志(J.Plant Nu)19(8-9)：1189-1200，1996)，而且已经阐明了在由甲硫氨酸生物合成mugineic酸(MA)的途径中所涉及到的几乎所有的酶。然而，对于由酮体合成DMA的酶来说，尽管已经知道这种酶可能是NADH-或NADPH-依赖性还原酶，但是既没有纯化和分离出该酶的蛋白也没有纯化和分离出该蛋白的基因。
本发明的目的在于分离和鉴定催化酮体产生DMA的还原酶及其基因，以便阐明在mugineic酸的生物合成过程中所涉及到的酶的完整图谱，从而提供将铁-获得机制引进植物体内的方法。
顺便提一句，植物体内分泌mugineic酸的表观特征包括近昼夜节律。日出后大麦开始分泌mugineic酸，经过3至5个小时的高峰后分泌减弱，日落后停止分泌(Takagi等，植物核酸杂志(J.Plant Nu)，469-477，1984)。由于铁-缺乏，观察到大麦根部的精细结构发生了变化，观察到根部末端细胞中的特定颗粒数目和尺寸有所增加。由于脂质体存在于表面上以及膜比高尔基体的薄，所以所述颗粒似乎来源于具有粗糙表面的内质网(rER)。这种颗粒被发现存在于皮质细胞、表皮细胞和根冠细胞中。日出前所述颗粒呈现一种膨胀状态，这时分泌mugineic酸，随着mugineic酸的分泌，颗粒缩小。因此，推测所述颗粒是mugineic酸的合成及贮存场所(Takizawa等，植物核酸杂志(J.Plant Nu)15：695-713，1987)。
因此，通过利用免疫染色法和源自水母的绿色荧光蛋白(GFP)的瞬时测定方法来观察mugineic酸生物合成途径中的相关蛋白(NAS，NAAT)的定位，结果发现所有蛋白都定位于特定的颗粒中，这些特定颗粒在铁缺乏的大麦根部中增加(数据没有公布)。而且，通过对催化酮体产生DMA的还原酶进行鉴定以及对它的定位进行检测能够更加清楚地证明所述颗粒是mugineic酸的合成场所。
而且近来，已经对被转化的水稻进行了分析，该水稻具有被转入的naat-A。在分析过程中，发现某些水稻在铁-缺乏的土壤中能够生长而没有患上缺绿症并且mugineic酸的分泌仍有所增加。这被认为是由于通过引入了naat-A而增加了酮体合成的量以及由于内源性还原酶而产生了DMA。然而，在这种情况下，DMA和mugineic酸的产量受到内源性还原酶的量的限制。因此确信当naat-A和还原酶的基因被同时转入水稻时，所构建的水稻对铁-缺乏的耐受性比只具有被转移naat-A的转化水稻对铁-缺乏的耐受性高。
因此，为了构建对铁-缺乏具有更高耐受性的植物，需要测定出生物合成mugineic酸所需要的一组酶的完整图谱，在铁获得机制中所述mugineic酸是被统称为植物铁载体的铁螯合剂。
本发明的内容
本发明的目的在于证实生物合成mugineic酸所需要的一组酶的完整图谱，在铁获得机制中所述mugineic酸是被统称为植物铁载体的铁螯合剂，另一个目的在于分离和鉴定用于上述目的的催化酮体产生DMA的还原酶及其基因。
本发明的目的还在于证实在植物体内生物合成mugineic酸所需要的一组酶的完整图谱以及构建对铁-缺乏具有更高耐受性的植物。
附图的简述
图1表示禾本科植物体内的mugineic酸及其衍生物的生物合成途径。
图2是显示通过利用简并引物的PCR而获得的三个扩增片段的电泳图谱的照片。
图3是显示对铁-缺乏组和铁-充足组中的大麦芽部分和大麦根部分(2个星期)进行诺慎(Northern)印迹分析的结果的电泳图谱照片。1，2和3是分别利用200，500和700bp PCR片段所得到的结果的电泳图谱照片。
图4表示通过HPLC对本发明还原酶的活性进行测定的结果，其中将还原酶的活性值测定为通过HPLC测定的DMA的量。1，2，3，4，5，6和7分别表示只有DMA，还原酶基因1、还原酶基因2，还原酶基因5，还原酶基因7，NAAT+NaBH4和载体对照(PYH23)的情况。
图5是为了检测本发明还原酶基因对铁缺乏的响应随时间发生变化而进行诺慎印迹分析所得结果的照片。在进行铁-缺乏处理后的第0、2、4、7、14天以及在铁-缺乏处 14天后重新补铁后的第5天对大麦根部进行实验。1和2分别表示还原酶1和2(5)的情况。
图6表示本发明还原酶基因1的cDNA碱基序列和推导出的氨基酸序列。
图7表示本发明还原酶基因2的cDNA碱基序列和推导出的氨基酸序列。
图8表示本发明还原酶基因5的cDNA碱基序列和推导出的氨基酸序列。
图9表示本发明的还原酶基因1、还原酶基因2(5)和水稻的谷胱甘肽还原酶的氨基酸序列之间进行的比较。
图10是本发明的还原酶基因和谷胱甘肽还原酶基因针对金属应力所作出的响应的照片。在图10中，DMAS和GR分别表示本发明的还原酶基因和谷胱甘肽还原酶基因。R和S分别表示根部和芽(叶、茎等)部分。
图11表示当检测本发明的还原酶基因和谷胱甘肽还原酶基因针对金属应力所作出的响应时所使用的探针区域的氨基酸序列。在图11中，DMAS1和DMAS2表示本发明的还原酶基因，而GR表示谷胱甘肽还原酶基因。而且在图11中，用细框圈起来的顶部代表观察到GR对金属作出响应时所使用的探针区域，从顶部至底部用宽框圈起来的部分代表观察到DMAS对金属作出响应时所使用的探针区域。实施本发明的最佳方式
本发明涉及一种将酮-烟酰胺还原成2’-脱氧mugineic酸的还原酶以及编码该酶的基因。
本发明还涉及其中转入了编码还原酶的基因的转化体和植物，所述还原酶是将酮-烟酰胺还原成2’-脱氧mugineic酸的还原酶。
而且，本发明涉及用于生物合成作为铁螯合剂的mugineic酸的酶试剂盒以及用于构建对铁-缺乏具有高耐受性的植物的基因试剂盒，所述酶试剂盒包含将烟酰胺的酮体还原成2’-脱氧mugineic酸的还原酶和至少另外一种用于生物合成作为铁螯合剂的mugineic酸的酶，所述基因试剂盒包含编码这些酶的基因。
mugineic酸的生物合成途径中所涉及到的多种酶已经被成功地纯化出来或者其基因已经被成功地分离出来。然而，还没有成功地纯化和分离出催化由酮体至DMA的反应的酶以及编码该酶的基因。因此，本发明人试图分离出编码这样一种酶的基因，该酶在mugineic酸的生物合成途径中催化由酮体至DMA的反应。尽管10年前，Shoiima通过摄取实验已经报道了这种基因是一种NAD(P)H-依赖性酶(Shojima等，植物生理学(Plant Physiol)，93：1497-1503，1990)，但该研究却没有实现纯化和分离所述蛋白及其基因的目的。
当从DMA的分泌量进行推导时，发现水稻分泌内源性还原酶的量比大麦低，因此尝试了由大麦来进行分离。
首先，寻找目的还原酶所归属的酶家族，结果表明醛-酮还原酶基因超家族(Seery等，J.Mol.Evol.，46：139-146，1998)最合适，该超家族广泛包括了NADH-和NADPH-依赖性还原酶。然后，在该家族中相对保守的氨基酸序列的基础上选择以下两个区域。
5’-YTIGAYTAYBTIGAC-3’(5’-端)
5’-RTGRCAYTCIAYYTG-3’(3’-端)
在编码所述两个区域序列的碱基序列的基础上设计简并引物。
以源自处于铁-缺乏状态的大麦(Hordeum vulgare L.cv.Ehimehadaka 1号)根部的cDNA文库为模板、利用上述这些引物进行PCR。
结果，得到三个PCR片段(200，500和700bp)(图2)。图2是显示所获得的三个PCR片段的电泳图谱照片。在图2中，右侧的带从底部起分别表示200、500和700bp的片段。
为了检测所得到的PCR片段是否为目的基因，通过诺慎印迹法分析在铁-缺乏(-Fe)和铁-充足(+Fe)的大麦根部和芽端中进行的基因表达。结果见图3中的照片。图3中的左上方的照片1表示使用200bp PCR片段的情况，图3中的右上下方照片2表示使用500bp PCR片段的情况，以及位于中下部的照片3表示使用700bp PCR片段的情况。在每个照片中，左侧两个泳道表示得自根部的结果而右侧的两个泳道表示得自芽端的结果。对于每个根部和芽端，-Fe表示铁-缺乏组(两个星期)而+Fe表示铁-充足组。
当将500和700bp PCR片段作为探针时，在铁-缺乏组和铁-充足组中没有观察到基因的表达。另一方面，当将200bp PCR片段作为探针时，检测到了在所有条件下都表达的电泳带以及仅在铁-缺乏组的根部中表达的电泳带(参见图3-1)。仅在铁-缺乏的大麦根部中表达了在mugineic酸的生物合成途径中催化由酮体产生DMA的途径之前和之后反应的所有酶的基因。从这一结果来看，目的基因似乎非常有可能仅在铁-缺乏状态下的大麦根部进行表达。因此，可以确定200bp PCR片段可能含有目的基因的碱基片段，并且分离出含有该碱基序列的cDNA克隆。
通过以PCR片段中的一个片段作为探针进行菌落杂交来进行cDNA克隆的分离，所述PCR片段中的一个片段是通过诺慎印迹分析在铁-缺乏状态下检测到的。将铁-缺乏大麦根cDNA文库涂布到八个含有氨苄青霉素的LB平板上从而使得克隆密度达到25000至50000个克隆/平板。进行第二次和第三次筛选从而使得第一次筛选中的阳性克隆成为单一克隆。结果，获得了四个阳性克隆(分别被称作1，2，5和7)。对这样获得的cDNA文库进行测序。这些基因的碱基序列都显示出与水稻的谷胱甘肽还原酶(Kaminaka等，植物细胞生理学(Plant CellPhysiol)，39：1269-1280，1998)的高度同源性。
接着，利用通过以这些cDNA转化酵母而获得的蛋白质来检测由这些cDNA克隆编码的酶的活性。由于作为底物的酮体是一种不稳定的化合物，因此将作为前体的烟酰胺用作起始物。该检测过程按照NAAT活性测定方法通过Takahashi法来进行(Takahashi等，植物生理学(Plant Physiol)，121：947-956，1999)。也就是说在有NAAT存在的条件下，烟酰胺反应生成酮体，然后将由酵母转化体表达的蛋白质代替NaBH4用于化学还原反应中。将由不含插入物的空载体(pYH23)表达的蛋白质用作对照。通过利用HPLC检测DMA的量来测定活性值。
HPLC的结果如图4所示。图4-1是仅有DMA的情况并且显示了标准DMA的保留时间。图4-2是还原酶基因1被表达的情况。图4-3是还原酶基因2被表达的情况。图4-4是还原酶基因5被表达的情况。图4-5是还原酶基因7被表达的情况。图4-6是由NaBH4催化的化学还原的情况。图4-7是对照载体(pYH23)被表达的情况。
其中将DMA的量比仅使用载体本身情况下(图4-7)的量多的那些结果确定为阳性。结果，在由除还原酶基因7(图4-5)之外的cDNA编码的所有蛋白中检测到了DMA。其中，发现由还原酶基因2(图4-3)和5(图4-4)的cDNA编码的蛋白的活性最高。
然后，在其中检测到了DMA活性的1，2和5的情况下，观察了针对铁-缺乏的响应。
在得到的具有DMA活性的cDNA克隆中，通过诺慎印迹法分析了在对铁-缺乏的响应随时间变化的过程中还原酶基因1，2和5的表达。总共使用了六个RNA样品，也就是说，即将处于铁-缺乏状态的大麦根部(0天)，处于铁-缺乏状态后第2、第4、第7和第14天的大麦根部，以及铁-缺乏第14天后补充了5天铁的大麦根部。在进行RNA电泳和成像的同时利用PCR片段进行诺慎印迹分析。
结果如图5的照片所示。图5-1是利用还原酶基因1的情况，图5-2是利用还原酶基因2的情况。图5中的0d，、2d，、4d、7d、14d和5d分别表示铁-缺乏处理后第0、第2、第4、第7、第14天和铁-缺乏处理14天后再施加铁后的第5天的大麦根部。
结果发现所有基因的表达受铁-缺乏状态的诱导而且发现通过补铁降低了表达(图5-5d)。
然后，对具有DMA活性的还原酶基因1、2和5的cDNA克隆进行测序。结果，还原酶基因2和5的可读框(ORF)部分具有相同的碱基序列。还原酶基因1的ORF在5’端比其它两个基因的ORF多出315个碱基对。还原酶基因1和2的氨基酸序列分别如序列表中的1号和2号序列所示。并且，还原酶基因1、2和5的碱基序列分别如序列表中的3号、4号和5号序列所示。而且，还原酶基因1、2和5的碱基序列和推测氨基酸序列分别如图6、7和8所示。
然后，检测在所测碱基序列的基础上推导出的氨基酸序列的信息。每个氨基酸序列与水稻中的谷胱甘肽还原酶具有89.5％的同源性(参见图9)。在图9中，上行表示还原酶基因1的氨基酸序列，中间行表示还原酶基因2或5的氨基酸序列，以及下行表示水稻的谷胱甘肽还原酶的氨基酸序列。
然后，通过PSORT预测所得到的蛋白质的定位。结果发现由还原酶基因1编码的蛋白质可能定位在质膜上，而由还原酶基因2(5)编码的蛋白质可能定位在内质网(膜)上。另一方面，与由本发明的还原酶基因编码的氨基酸序列具有89.3％的最高同源性的水稻谷胱甘肽还原酶最可能定位在细胞质中。
本发明的还原酶及其基因与NAD(P)H依赖性还原酶家族的成员不具同源性而与谷胱甘肽还原酶具有最高的同源性，基于这一点设计出了简并引物。通过其氨基酸序列预测出基因2(或5)定位于内质网膜上。这一点以及mugineic酸的生物合成途径中所涉及NAS和NAAT来自内质网粗糙表面上的颗粒中的事实表明被分离的基因2或5很可能就是目的基因，其中所述颗粒是处于铁-缺乏状态的大麦根部所特有的。而且，在针对铁-缺乏的响应随时间发生变化的过程中，这些基因的表达受铁-缺乏处理的诱导并且通过补充铁而被降低，从而表明这些基因对铁具有响应能力。
总之，本发明的基因是编码还原酶的基因，该还原酶在mugineic酸的生物合成途径中催化由酮体生成DMA的反应，而且可以得出这样的结论，即未来可能会研制出一种对铁-缺乏具有高耐受性的新型水稻品种。
因此，本发明的还原酶是将酮-烟酰胺还原成2’-脱氧mugineic酸的还原酶，并且本发明已经以被称作“途径II”的植物铁-获得性机制的方式阐明了生物合成mugineic酸的整套酶，所述mugineic酸是天然的铁-螯合剂，这种铁-螯合剂被统称为植物铁载体。
由此，植物能够获得被称作“途径II”的植物铁-获得性机制并且由于将这些酶或编码这些酶的基因引进了植物体内而使得这种植物对铁-缺乏的耐受性得到了提高。
由于NAAT是用于生物合成mugineic酸的酶组中的一种酶，所以通过引进naat基因组已经制备出转化水稻。NAAT是在mugineic酸的生物合成途径中催化由NA生成酮体的反应的酶，而且已经发现通过引进该基因植物能够在铁-缺乏的土壤中生长而不会患上缺绿症。因此认为在仅以NAAT基因转化的水稻体内，由铁-缺乏诱导的naat基因的表达产生了过量的酮体以及过量的酮体被内源性还原酶转化成DMA，结果使得水稻能够在铁-缺乏的土壤中生长而不会患上缺绿症。
然而，由DMA的分泌量估测出的水稻体内的内源性还原酶的量比大麦体内的少，因此由naat基因诱导表达而过量产生的酮体很有可能不能被有效地转化成DMA。基于这一观点，预计被本发明的基因和naat基因组共同转化的水稻可通过还原酶将由NAAT过量产生的酮体有效地转化成DMA而且对铁-缺乏的耐受性也远远比仅被naat基因组转化的水稻高，其中所述本发明的基因编码催化由酮体生成DMA的反应的酶。根据这一观点，可以得出这样的结论即分离出催化由酮体生成DMA的反应的还原酶是非常重要的。
本发明提供了在mugineic酸的生物合成过程中将酮-烟酰胺还原成2’-脱氧mugineic酸的还原酶，所述mugineic酸在植物体内参与铁获得性机制。本发明的还原酶优选地是一种具有序列表中的1号或2号序列所示的氨基酸序列。只要所述酶蛋白在mugineic酸的生物合成过程中具有将酮-烟酰胺还原成2’-脱氧mugineic酸的活性，那么在该氨基酸序列中，就可以用其它氨基酸取代一个或多个氨基酸，可以缺失一个或多个氨基酸，并且还可以插入一个或多个氨基酸。而且，本发明的还原酶可以具有同时发生了取代、缺失和插入的氨基酸序列。
本发明还提供了编码上述本发明还原酶的基因。本发明基因的优选碱基序列由序列表中的3号、4号或5号序列所示的碱基序列组成，但并不只限于所示的碱基序列。这些碱基序列可被修饰成易表达的序列，条件是被修饰后仍能够编码上述的氨基酸序列。本发明的基因还包括由与这些碱基序列互补的序列组成的基因，以及能够在严格条件下与所述碱基序列进行杂交的碱基序列。
另外，由本发明的部分基因组成的碱基序列也被包括在本发明中。这些部分序列也可被用作PCR的引物，并且本发明包括用于此方法的部分序列。
本发明的基因还含有一个其上游序列所需的启动子。这种启动子并不限于下面的序列表，适于植物的启动子可根据本发明基因所要转入的植物来进行选择。
本发明提供了被本发明的上述基因转化的转化体。多种细胞，例如诸如大肠杆菌这样的细菌细胞、动物细胞如仓鼠细胞、植物细胞和酵母细胞可被用作本发明转化体的宿主细胞。本发明的还原酶可以由这些转化体来表达和产生。
本发明还提供了引进了上述本发明基因的植物。由于mugineic酸的生物合成中所涉及的一组酶的完整图谱已经通过阐明本发明的还原酶而得到说明，因此编码这组酶的一套基因有可能被转入不具有“途径II”的植物中从而使得该植物被重新赋予通过“途径II”的铁获得性机制，其中所述“途径II”以mugineic酸作为铁获得性机制的铁螯合剂。因此，引进了本发明基因的植物不限于具有通过“途径II”的铁获得性机制的禾本科植物，但是引进禾本科植物是优选的。
尽管可以预测出即使单引进本发明的基因也能够提高对铁-缺乏的耐受性，但是对铁-缺乏的耐受性得到进一步提高的植物可以通过同时优选引进编码其它酶的基因，优选地是naat来得到。
如上所述，如图1所示的mugineic酸的生物合成途径中的所有酶已经通过阐明本发明的还原酶而得到明确，而且这些酶的完整图谱也得到证实。因此，本发明提供了用于“途径II”中生物合成mugineic酸的一组酶。即，本发明提供了用于生物合成铁螯合剂-mugineic酸的酶试剂盒，该试剂盒由将甲硫氨酸转化成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的“S-腺苷甲硫氨酸合酶”、将S-腺苷甲硫氨酸转化成烟酰胺(NA)的“烟酰胺合酶”、将烟酰胺转化成酮体的“烟酰胺氨基转移酶(NAAT)”和本发明的“还原酶”以及将酮体进一步转化成mugineic酸的“IDS3”等组成。本发明的酶试剂盒以本发明的还原酶为一种必需酶而且还含有至少一种其它酶，并且优选地是含有能够完成由甲硫氨酸进行生物合成的所有酶的试剂盒。利用本发明的酶试剂盒，可以由甲硫氨酸轻易地生产出mugineic酸或其生物合成途径的产物。
为了构建对铁-缺乏具有高耐受性的植物，本发明提供了包含编码上述一组酶中的每种酶的基因的基因试剂盒。对铁-缺乏具有高耐受性的植物可以通过将这些基因引进植物体内来构建。具有由甲硫氨酸形成mugineic酸的高生物合成能力的植物可以通过引进编码所述上述酶中的每种酶的基因来构建。
被引进植物体内的酶基因优选地是一种含有其中将被引进基因的植物的启动子区域的基因。并且，其中引进了每种基因的植物不限于，但优选地是禾本科植物。
实施例
下面通过实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1大麦的栽培
将大麦种子(Hordeum vulgare L.cv.Ehimehadaka 1号)放置在经蒸馏水润湿的纸巾上，通过采用铝箔进行避光，于室温下保持3天以便诱发生芽。将幼苗移到悬浮在水培溶液中的网上并利用气泵进行通气培养。当长出第二片叶子后，将植物移到20L的容器中来继续进行水培培养。
水培溶液的组成是[7×10-4M K2SO4，1×10-4M KCl，1×10-4MKH2PO4，2×10-3M Ca(NO3)2，5×10-4M MgSO4，1×10-5M H2BO3，5×10-7M MnSO4，5×10-7M ZnSO4，2×10-7M CuSO4，1×10-8M(NH4)6MoO24，1.5×10-4M Fe-EDTA]。
每天用1N HCl将水培溶液的pH值调到约5.5。采用蒸馏水配制水培溶液并且每周换一次。当长出第四片叶子后，用蒸馏水冲洗根部来去除粘附上的铁，然后将植物移到不含铁的水培溶液中从而开始进行铁-缺乏处理，并且一直栽培到指定的时间周期。
实施例2简并引物的设计以及利用这些引物的PCR
首先，通过寻找目的还原酶所属的酶家族来开始实验。结果表明醛-酮还原酶基因超家族最合适，该超家族广泛包括了NADH-和NADPH-依赖性还原酶。然后，在该家族中相对保守的氨基酸序列的基础上选择出两个区域。在取代所述两个区域序列的碱基序列的基础上设计简并引物。合成该简并引物。
LDYV/LD....5’-YTIGAYTAYBTIGAC-3’(5’-端)
QV/IECH....5’-RTGRCAYTCIAYYTG-3’(3’-端)
以来源于处于铁-缺乏状态的大麦根部的cDNA文库为模板利用这些引物进行PCR。
结果，得到三个片段，即200，500和700bp PCR片段。结果如图2所示。
实施例3对在处于铁-缺乏状态的大麦根部中被诱导的PCR片段进行的选择
目的显然是在处于铁-缺乏状态的大麦根部中诱导由PCR扩增的片段，因此将诺慎印迹分析用作选择这些片段的手段。从源自经过2周铁缺乏处理的大麦根部和芽部的那些样品中提取RNA。用于提取RNA的方法如下所述。
将利用液氮粉碎的植物溶解在提取缓冲液(150mM LiCl，5mMEDTA，pH8，5％SDS，800mM Tris-HCl，pH9)中。接着进行两次苯酚-氯仿提取。向上清液中加入0.3M醋酸钠和一份体积的异丙醇并进行离心。将沉淀溶解在3M的氯化锂中和冰浴10分钟，然后离心。用80％的乙醇冲洗沉淀，然后将沉淀溶解在蒸馏水中。在-80℃下进行保存。将得到的RNA在1.2％的琼脂糖凝胶上跑电泳后印迹到膜上(Hybond-N+，Amersham-Pharmacia)。
利用PCR片段通过随机引物DNA标记试剂盒2.0版(Takara)制备杂交探针。利用Church杂交溶液(0.5M Church磷酸盐缓冲液，1mMEDTA，7％(w/v)SDS)在65℃下杂交18小时。在65℃下用Church杂交洗涤溶液(40mM Church磷酸盐缓冲液，1％(w/v)SDS)将膜冲洗两次，一共10分钟。冲洗后，用莎伦(Saran)包装膜将上述膜包起来并过夜曝光给置于暗盒中的IP显像胶片(富士胶片)。利用BAS2000图象分析仪进行图象处理(富士胶片)。
结果如图3所示。图3-1，3-2和3-3分别是利用200、500和700bp的PCR片段的实例。
实施例4筛选
以通过诺慎印迹分析检测到的那些在铁-缺乏根部中被诱导的cDNA作为探针，通过菌落杂交来分离cDNA克隆。将铁-缺乏大麦根部cDNA文库涂布到8个含有氨苄青霉素LB平板上从而使得克隆密度达到25000至50000个克隆/平板。进行第二轮和第三轮筛选从而使得第一轮筛选中的阳性克隆变成单个克隆。对最终得到的cDNA克隆进行测序。
实施例5通过活性测定进行选择
检测通过筛选得到的cDNA克隆的酶活性。将通过所述cDNA克隆转化酵母获得的蛋白质作为使用的蛋白。由于mugineic酸生物合成途径中的酮体是一种不稳定的化合物，所以将其前体烟酰胺用作起始物。按照NAAT活性测定方法通过Takahashi法进行(Takahashi等，植物生理学(Plant Physiol)，121：947-956，1999)检测。通过NAAT催化，烟酰胺反应生成酮体，然后由所得到的cDNA克隆表达的蛋白质代替NaBH4的化学还原反应。所用蛋白是通过将酵母粉碎后利用超游离C3-LTK(Japan Millipore Co.)截留分子量为30kDa或更大分子量的蛋白来获得的。所述酶反应是在截留杯上进行的。用于还原酶反应的缓冲液是0.1M Tris，0.1mM EDTA，10mM NAD(P)H，pH8.5。将由不含插入物的载体(pYH23)表达的蛋白作为对照。通过利用HPLC检测DMA的量来确定活性值。
结果如图4所示。图4-1仅仅是DMA的情况并显示了标准DMA的保留时间。图4-2是还原酶基因1被表达的情况。图4-3是还原酶基因2被表达的情况。图4-4是还原酶基因5被表达的情况。图4-5是还原酶基因7被表达的情况。图4-6是通过NaBH4进行的化学还原反应的情况。图4-7是对照载体(PYH23)被表达的情况。
将所观察到的其中DMA含量高于仅仅有载体存在的情况下的DMA含量的那些克隆确定为阳性克隆。结果，在由除还原酶基因7(图4-5)以外的其它cDNA编码的所有蛋白中检测到了DMA。其中，发现由还原酶基因2(图4-3)和5(图4-4)的cDNA编码的蛋白的活性最高。
实施例6诺慎印迹分析
在所得到的cDNA克隆中，通过诺慎印迹分析那些具有DMA活性的克隆针对Fe-缺乏所产生的应答随时间发生的变化。总共使用了6个RNA样品，这6个样品就是发生Fe-缺乏前的大麦根部(0天)，发生Fe-缺乏后第2、第4、第7和第14天时的大麦根部，和发生Fe-缺乏14天后又补充了5天铁的大麦根部。按照对PCR片段进行诺慎印迹分析的方式进行RNA的电泳和图象分析。
结果如图5所示。图5-1是采用还原酶基因1的情况，图5-2是采用还原酶基因2的情况。图5中的符号0d，2d，4d，7d，14d和5d分别表示铁-缺乏处理后的第0、第2、第4、第7、第14天时的大麦根部和Fe-缺乏处理14天后又重新施加5天铁后的大麦根部。
结果，发现所有基因的表达随着铁-缺乏的发生而被诱导，并且表达由于施加铁而被减弱(图5-5d)。
实施例7本发明的还原酶基因和谷胱甘肽还原酶基因的表达对金属应力的应答
当对水稻中的还原酶基因(DMAS1和DMAS2)的碱基序列与水稻中的谷胱甘肽还原酶基因(GR)的碱基序列进行比较时，发现前者属于后者的一部分。因此，GR本身有可能被Fe-缺乏所诱导而其编码的产物谷胱甘肽还原酶本身具有DMAS活性。为了研究这种可能性，在铁和锌的金属应力下、以属于GR的5’上游序列的碱基序列为探针，通过诺慎印迹法来检测基因的表达。
(1)植物材料
将大麦种子(Hordeum vulgare L.cv.Ehimehadaka 1号)放置在被蒸馏水侵湿的纸巾上，通过采用铝箔遮光在室温下保持3天来诱发生芽。将幼苗移植到浮在水培溶液上的网状物上并在利用泵通气的条件下进行培养。当长出第二片叶子后，将该植物移植到20L的容器中并继续进行水培。所述水培溶液的组成为[7×10-4M K2SO4，1×10-4M KCl，1×10-4M KH2PO4，2×10-3M Ca(NO3)，2.5×10-4M MgSO4，1×10-5MH2BO3，5×10-7M MnSO4，5×10-7M ZnSO4，2×10-7M CuSO4，1×10-8M(NH4)6Mo7O24，1.5×10-4M Fe-EDTA]。每天用1N的HCl将水培溶液的pH值调到5.5左右。水培溶液采用蒸馏水进行制备并且每周只换一次。当长出第四片叶子后，用蒸馏水冲洗根部以便除去所粘附的金属，然后将植物移植到不含每种金属(Fe，Zn)的水培溶液中从而开始进行金属-缺乏(Fe，Zn)处理，并在一定的时间周期内持续培养。(2)诺慎印迹分析
将金属(Fe，Zn)缺乏的大麦根和芽作为样品来进行RNA的提取。
提取RNA的方法如下所述。
用研钵将液氮冷冻的植物磨碎后溶解在提取缓冲液(150mM LiCl，5mM EDTA，pH8，5％SDS，80mM Tris-HCl，pH9)中。接下来，进行两次苯酚-氯仿提取。向上清液中加入0.3M的醋酸钠和部分体积的异丙醇并进行离心。将沉淀物溶解在3M的氯化锂中并进行10分钟的冰浴，然后进行离心。用80％的乙醇冲洗沉淀物并用蒸馏水溶解。在-80℃下进行保存。
使得到的RNA在1.2％的琼脂糖凝胶上跑电泳，然后印迹到膜(Hybond-N+，Amersham-Pharmacia)上。
通过利用随机引物DNA标记试剂盒2.0版(Takra)标记PCR片段来制备杂交探针。利用Church杂交溶液(0.5M的Church磷酸缓冲液，1mM EDTA，7％(w/v)SDS)在65℃下杂交18小时。用Church杂交冲洗溶液(40mM的Church磷酸缓冲液，1％(w/v)SDS)在65℃下冲洗10分钟，共进行两次。冲洗后，用Saran Wrap将膜包起来并对暗盒中的IP成象胶片(Fuji Film)进行过夜曝光。利用BAS3000图象分析仪(FujiFilm)进行图象处理。(3)结果与讨论
以DMAS1序列(对应于DMAS1、DMAS2和GR的共同序列，在图11中用大方框将该共同序列圈了起来)作为探针进行诺慎印迹分析的结果如图10所示。在处于Fe-缺乏状态的根部进行很强的表达(另外，在处于Zn-缺乏的根部和芽部(叶子、茎等)进行较强的表达)。然而，在对照组中以及在以GR-固有序列(被封闭在图11中的细长框中的序列)为探针时的任何应力的作用下没有观察到表达的进行。这两个结果表明GR基因的表达与Fe-缺乏无关，而且还表明在通常条件下该基因几乎不被表达。相反，所述结果表明DMAS1和DMAS2基因在处于Fe-缺乏状态的大麦根部中的表达很强。因此，可以得出结论DMAS是其基因表达在Fe-缺乏条件下被诱导的酶而且该酶催化酮体合成脱氧mugineic酸。尽管DMAS的基因组基因仍未被克隆出来，但认为该基因组基因的5’上游序列中可能含有针对Fe-缺乏仍然未知的应答系统成分。
工业实用性
本发明提供了在mugineic酸的生物合成过程中将酮-烟酰胺还原成2’-脱氧mugineic酸的还原酶，该mugineic酸参与植物体的铁-获得性机制；编码该酶的基因和一种由于其中转入了上述基因而使得对铁-缺乏的耐受性得到增强的植物。植物体对铁-缺乏的高耐受性能够使得植物即使在供铁困难的土壤如碱性土壤中也能进行栽培、扩大能够进行栽培的耕作面积，而且能够解决未来面临的食物和环境问题。并且，通过本发明还原酶的描述能够阐明植物体内的mugineic酸的生物合成途径的全貌。因此，利用这些生物合成途径中所涉及的一组酶及编码这些酶的基因构建对铁缺乏具有高耐受性的植物成为可能。
因此，本发明提供了生物合成mugineic酸所需的一系列的酶和编码这些酶的一系列基因，而且还能够赋予植物以被称作途径II的铁获得性机制。
序列表<110>科学技术振兴事业团(Japan Science and Technology Corporation)<120>脱氧mugineic酸合酶有其基因
(Deoxymugineic acid synthetase and gene thereof)<130>JA909897<150>JP2001-086162<151>2001-03-23<160>5<210>1<211>359<212>PRT<213>Hordeum vulgare L.cv.Ehimehadaka no.1<400>1Met Ile Glu Gly Ala Gly Ser Ile Val Asp Ala His Thr Val Glu Val1 5 10 15Thr Gln Pro Asp Gly Ser Lys Gln Arg His Thr Thr Lys His Ile Leu
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