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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410856733.5 (22)申请日 2014.12.25 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104521567 A (43)申请公布日 2015.04.22 (73)专利权人 新疆大学 地址 830046 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐 市天山区胜利路666号 (72)发明人 陈恒雷 冯光文 (51)Int.Cl. A01G 1/04(2006.01) 审查员 李伊乐 (54)发明名称 一种裂盖马鞍菌人工菌种的分离培养方法 (57)摘要 本发明提供了一种裂盖马鞍。
2、菌人工菌种的 分离培养方法， 该方法包括裂盖马鞍菌子实体和 基质的原产地采集和收集、 子实体的辐照处理和 组织分离、 菌丝体的平板培养和种瓶培养等步 骤。 优选地， 在裂盖马鞍菌人工菌种分离培养的 步骤中还包括对裂盖马鞍菌子实体组织分离前 进行就地的一次无菌处理和运返实验室的二次 无菌处理的步骤， 经过上述处理可获得裂盖马鞍 菌人工纯菌种。 权利要求书1页 说明书4页 CN 104521567 B 2017.02.01 CN 104521567 B 1.一种裂盖马鞍菌人工菌种的分离培养方法， 其特征在于： 裂盖马鞍菌子实体和生长 基质的原产地采集和收集： 五一期间是新疆裂盖马鞍菌大量发生、 子。
3、实体发育成熟的季节， 赶赴距巴楚县城30余公里的夏河和夏玛勒胡杨林场跟随当地采菇经验丰富的维吾尔族老 乡深入林间寻找发育成熟的裂盖马鞍菌子实体， 用经过121灭过菌的大镊子从沙土中夹 取出裂盖马鞍菌子实体， 用吹风机对附着在子实体上的沙土进行清理， 清理干净后再用医 用剪刀将裂盖马鞍菌带有泥土的须根剪除， 并将菌盖和菌柄剪开， 将菌柄投入装有80mL 75酒精的150mL三角瓶中杀菌3min， 然后用镊子将菌柄捞出与菌盖分别放入事先准备好 的无菌空白培养皿中， 并一起放入四周装有冰袋的苯板保鲜箱中， 最后用聚丙烯袋收集子 实体发生地周围的生长基质， 并用标记笔在培养皿、 袋体上做上一一对应的编。
4、号、 时间、 采 集地、 采集人信息， 其它子实体和生长基质的采集和收集方法同上； 子实体的辐照处理和组 织分离： 将上述经过就地无菌处理并于第二天运返实验室装有裂盖马鞍菌菌柄和菌盖的培 养皿置于60Co源辐照室分别用1.0KGy和0.5KGy的剂量进行辐照处理， 然后移至接种室静 置2h后在超净工作台上对菌柄进行组织分离， 在酒精灯火焰的保护下将装有菌柄的培养皿 盖打开呈45度角并用医用剪刀在裂盖马鞍菌菌柄中部剪取组织块； 菌丝体的平板培养： 用 无菌接种钩分别挑取经医用剪刀分离的裂盖马鞍菌菌柄中部组织块一一接种于装有优化 平板培养基的培养皿中心处， 置于人工气候箱中25恒温培养12h、 2。
5、0恒温培养12h， 以此 类推培养10d， 挑选菌丝体活力旺盛、 长势良好的平板置于冰柜4低温保藏以备后续研究 之用， 其中， 优化平板培养基的质量百分比为： 马铃薯煮汁20、 麸皮煮汁1 .5、 蔗糖 2.0、 蛋白胨1.0、 KH2PO40.2、 MgSO4 0.15、 琼脂1.8， 其余为自来水， pH值灭菌前 8.5， 121灭菌30min； 菌丝体的种瓶培养： 用无菌接种钩挑取1朵经辐照处理的裂盖马鞍菌 菌盖， 接种到装有350mL种瓶培养基的500mL广口瓶中， 置于人工气候箱中将1d每隔6h设为 一段， 对应的培养温度分别设为27、 23、 19、 15， 如是仿生变温培养30d。
6、， 挑选菌丝体 长势旺盛的种瓶置于冰柜4低温保藏以备后续栽培之用， 其中， 种瓶培养基的质量百分比 为： 裂盖马鞍菌发生基质27、 木屑粉10、 麸皮6.7、 白砂糖1.0、 KH2PO4 0.2、 MgSO4 0.1， 其余为自来水， pH值灭菌前8.5， 121灭菌30min。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104521567 B 2 一种裂盖马鞍菌人工菌种的分离培养方法 技术领域 0001 本发明涉及一种野生食用菌人工菌种的分离培养方法， 具体的涉及一种基于裂盖 马鞍菌生物学特性、 通过对裂盖马鞍菌子实体和基质的原产地采集和收集、 子实体的辐照 处理和组织分离、 菌丝体的平板。
7、培养和种瓶培养人工分离培养裂盖马鞍菌人工菌种的方 法。 背景技术 0002 裂盖马鞍菌(Helvella leucopus Pers.)俗名巴楚蘑菇、 地木耳， 属子囊菌亚门 (Ascomycotina)、 盘菌目(Pizizales)、 马鞍菌科(Helvellaceae)、 马鞍菌属(Helvella)， 原 产于新疆巴楚县原始胡杨林场， 是叶尔羌河水、 千年胡杨树、 干旱少雨的大漠气候条件经大 自然融合孕育出的一种绿色珍稀食用菌， 素以纯天然、 质嫩味美、 营养丰富而著称， 它不但 具有较高的营养价值， 还有提高人体免疫力、 促进大脑发育、 防止脑动脉硬化、 促进副肾皮 质激素分泌、 增。
8、强人体应激能力、 溶血栓、 降血压、 降低胆固醇等多种保健作用， 市场上干品 价格高达每公斤600元仍供不应求。 0003 裂盖马鞍菌是一种珍稀名贵的野生食用菌， 该菌子实体香气浓郁、 味道鲜美、 质地 细腻， 其营养价值高于大宗的平菇、 香菇及黑木耳等担子菌， 与羊肚菌相当。 裂盖马鞍菌的 子实体含有氨基酸、 脂肪酸、 矿质元素等成分， 经测定： 裂盖马鞍菌子实体中含有17种氨基 酸， 菌盖、 菌柄氨基酸含量分别为19.46g/kg和13.14g/kg， 必需氨基酸含量为9.26g/kg和 2.41g/kg， 必需氨基酸分别占各自氨基酸总量的47.58和48.78， 油酸、 亚油酸、 亚麻酸。
9、 组成的不饱和脂肪酸的含量为8.56， 多糖含量为11.33。 裂盖马鞍菌形态特征独特， 菌 盖呈黑木耳状， 菌盖裂片一般35片， 暗褐色至黑褐色， 表面光滑至粉状， 裂瓣边缘卷曲， 边 缘有的与柄连生， 宽2.04.0cm。 菌柄白色至乳白色， 上细下粗， 中空， 根部主体亦呈圆形， 有须根， 菌柄长2.06.0cm， 上部粗1.01.5cm， 下部粗达1.22.8cm， 基部膨大处有沟和 凹坑。 裂盖马鞍菌分布地域广阔， 主要沿塔里木盆地北缘塔里木河流域分布， 常见于南疆的 胡杨林、 新疆杨和库尔勒香梨林中地面上或腐殖落叶层， 北疆也偶有发现。 裂盖马鞍菌主要 生长于新疆塔里木盆地天然胡杨。
10、林的沙土中， 在新疆农田防护林、 老苜蓿地中也有生长， 是 一种土生型食用菌。 裂盖马鞍菌生长发育条件苛刻， 土壤多为林灌草甸土， 有机质含量 1.503.18， 全氮0.060.07， 全磷0.120.14， C/N 16.818.4， pH 7.3 8.6。 发生时间一般为每年4月下旬5月中旬， 气温多在1521， 春雨降过或经冰山雪水 浸润之后裂盖马鞍菌就在塔里木河和叶尔羌河流域广袤的林区地面上以单生、 散生或群生 方式破土而出， 其传播途径主要以耳片在水中弹射孢子的方式逐水传播。 不同地域产裂盖 马鞍菌子实体内均有细菌、 放线菌、 真菌三种伴生菌， 与产地根系土壤中微生物类群一致， 但。
11、其数量比土壤中的微生物数量要少。 0004 近年来， 由于对裂盖马鞍菌人为过渡采收加之其生长环境不断恶化等原因其产量 逐年下降， 而人工驯化和栽培至今尚未获实质性突破， 急需深入开展包括人工菌种分离培 养、 栽培技术革新等应用基础研究。 但国内外对裂盖马鞍菌的研究甚少， 近年来只有国内学 说 明 书 1/4 页 3 CN 104521567 B 3 者朱铭莪、 孟庆玲、 胡建伟等对裂盖马鞍菌的营养成分、 免疫功能、 抗氧化及抗肿瘤活性、 孢 子萌发及环境适应性进行了初步研究。 因此， 为了更好的保护野生裂盖马鞍菌种群及生物 遗传多样性和可持续开发利用， 急需对裂盖马鞍菌进行区域普查、 育种技术。
12、及栽培技术的 科技攻关。 0005 本申请的发明人经过近两年深入裂盖马鞍菌发生地对当地物候条件、 发生基质、 发生方式的野外实地考察结合实验室大量细致的研究工作， 设计了一种基于裂盖马鞍菌生 物学特性、 通过对裂盖马鞍菌子实体和基质的原产地采集和收集、 子实体的辐照处理和组 织分离、 菌丝体的平板培养和种瓶培养人工分离培养裂盖马鞍菌菌种的方法， 实验业已证 实该方法是一种简便实用的裂盖马鞍菌人工菌种分离培养方法。 发明内容 0006 本发明提供了一种裂盖马鞍菌人工菌种的分离培养方法， 该方法包括裂盖马鞍菌 子实体和基质的原产地采集和收集、 子实体的辐照处理和组织分离、 菌丝体的平板培养和 种瓶。
13、培养等步骤。 优选地， 在裂盖马鞍菌人工菌种分离培养的步骤中还包括对裂盖马鞍菌 子实体组织分离前进行就地的一次无菌处理和运返实验室的二次无菌处理的步骤， 经过上 述处理可获得裂盖马鞍菌人工纯菌种。 0007 鉴于裂盖马鞍菌急需原产地保护和可持续开发的现实需要， 以野外采集的裂盖马 鞍菌子实体为材料， 融合酒精表层和60Go辐照深层无菌处理的前期步骤， 采用组织分离的方 法人工分离培养裂盖马鞍菌菌种， 可为后续裂盖马鞍菌优良菌种的选育和人工栽培技术的 突破提供种质保证。 0008 其中， 野外采集的时机和方式是影响裂盖马鞍菌人工菌种分离培养成功与否的关 键因素， 因此， 野外采集的时间、 地点以。
14、及采集、 保存方式是裂盖马鞍菌人工菌种分离培养 首先要解决的问题。 基于文献资料报道的每年4月下旬-5月中旬为新疆裂盖马鞍菌的菌丝 体扭结、 子实体发育成熟适宜采集的季节， 结合对裂盖马鞍菌主要发生地南疆叶尔羌流域 的巴楚县和塔里木河流域的轮台县的气候、 水文、 交通等情况的长期跟踪比较， 项目组成员 利用五一长假期间赶赴巴楚县深入夏河和夏玛勒胡杨林场寻找、 观察、 采集了大量裂盖马 鞍菌子实体及生长基质样本， 并通过就地的酒精表层无菌处理及低温保鲜处理后运返实验 室， 以备后续组织分离培养之用。 0009 无菌处理的方法是影响裂盖马鞍菌人工菌种分离培养成功与否的决定性因素， 因 此， 采用什。
15、么样的灭菌方式直接决定了能否获得裂盖马鞍菌纯菌种并对菌种的种性有一定 影响。 基于实验室长期对食用菌辐射诱变育种及保鲜的研究经验， 结合裂盖马鞍菌菌柄的 中空结构及内外均带有细菌、 放线菌及霉菌的双重考虑， 常规的高低温、 紫外线、 化学试剂 等理化杀菌方法都不能对裂盖马鞍菌子实体进行有效的杀菌， 而60Go辐照技术不仅具有杀 菌快捷、 彻底的特点， 而且是一种业已被证实在食用菌辐射诱变育种中功效显著的方法， 因 此， 采用60Go辐照技术既可杀灭杂菌又可对裂盖马鞍菌进行菌种改良， 可谓是一举两得。 0010 营养因子及培养条件是影响裂盖马鞍菌菌丝体生长发育的重要因素， 因此， 营养 及非营养。
16、因子的优化实验显得尤为重要。 基于裂盖马鞍菌原生地生长基质成分检测实验结 果， 通过正交优化实验获得了适合裂盖马鞍菌菌丝体生长发育的培养方式、 最优化培养基 配方。 说 明 书 2/4 页 4 CN 104521567 B 4 0011 该方法已在实验室得到成功实践， 结果表明该方法是是一种简便、 实用的裂盖马 鞍菌人工菌种分离培养方法。 具体实施方式 0012 实施例裂盖马鞍菌人工菌种的分离培养方法 0013 裂盖马鞍菌人工菌种的分离培养方法包括裂盖马鞍菌子实体和生长基质的原产 地采集和收集、 子实体的辐照处理和组织分离、 菌丝体的平板培养和种瓶培养几个阶段。 选 择裂盖马鞍菌大量发生的季节。
17、， 深入裂盖马鞍菌原产地采集发育成熟的子实体、 收集生长 基质， 通过就地的一次无菌处理和运返实验室的二次无菌处理、 组织分离及菌丝体的平板 培养和种瓶培养可获得裂盖马鞍菌纯菌种。 0014 (1)、 裂盖马鞍菌子实体和生长基质的原产地采集和收集 0015 五一期间是新疆裂盖马鞍菌大量发生、 子实体发育成熟的季节， 赶赴距巴楚县城 30余公里的夏河和夏玛勒胡杨林场跟随当地采菇经验丰富的维吾尔族老乡深入林间寻找 发育成熟的裂盖马鞍菌子实体， 用经过121灭过菌的大镊子从沙土中夹取出裂盖马鞍菌 子实体， 用吹风机对附着在子实体上的沙土进行清理， 清理干净后再用医用剪刀将裂盖马 鞍菌带有泥土的须根剪。
18、除， 并将菌盖和菌柄剪开， 将菌柄投入装有80mL 75酒精的150mL 三角瓶中杀菌3min， 然后用镊子将菌柄捞出与菌盖分别放入事先准备好的无菌空白培养皿 中， 并一起放入四周装有冰袋的苯板保鲜箱中， 最后用聚丙烯袋收集子实体发生地周围的 生长基质， 并用标记笔在培养皿、 袋体上做上一一对应的编号、 时间、 采集地、 采集人等信 息， 其它子实体和生长基质的采集和收集方法同上。 0016 (2)、 子实体的辐照处理和组织分离 0017 将上述经过就地无菌处理并于第二天运返实验室装有裂盖马鞍菌菌柄和菌盖的 培养皿置于60Co源辐照室分别用1.0KGy和0.5KGy的剂量进行辐照处理， 然后移。
19、至接种室 静置2h后在超净工作台上对菌柄进行组织分离， 在酒精灯火焰的保护下将装有菌柄的培养 皿盖打开呈45度角并用医用剪刀在裂盖马鞍菌菌柄中部剪取组织块。 0018 (3)、 菌丝体的平板培养 0019 用无菌接种钩分别挑取经医用剪刀分离的裂盖马鞍菌菌柄中部组织块一一接种 于装有优化平板培养基的培养皿中心处， 置于人工气候箱中25恒温培养12h、 20恒温培 养12h， 以此类推培养10d， 挑选菌丝体活力旺盛、 长势良好的平板置于冰柜4低温保藏以 备后续研究之用， 其中， 优化平板培养基的质量体积百分比为： 马铃薯煮汁20、 麸皮煮汁 1.5、 蔗糖2.0、 蛋白胨1.0、 KH2PO4 。
20、0.2、 MgSO4 0.15、 琼脂1.8， 其余为自来水， pH值灭菌前8.5， 121灭菌30min。 0020 (4)、 菌丝体的种瓶培养 0021 用无菌接种钩挑取2朵经辐照处理的裂盖马鞍菌菌盖， 接种到装有350mL种瓶培养 基的500mL广口瓶中， 置于人工气候箱中将1d每隔6h设为一段， 对应的培养温度分别设为27 、 23、 19、 15， 如是仿生变温培养30d， 挑选菌丝体长势旺盛的种瓶置于冰柜4低温 保藏以备后续栽培之用， 其中， 种瓶培养基的质量体积百分比为： 裂盖马鞍菌发生基质 27、 木屑粉10、 麸皮6.7、 白砂糖1.0、 KH2PO4 0.2、 MgSO4 0.1、 ， 其余为自来水， pH值灭菌前8.5， 121灭菌30min。 说 明 书 3/4 页 5 CN 104521567 B 5 0022 通过上述具体的实施例， 更容易理解本发明。 上述实施例只是举例性的描述， 而不 应当被理解为用来限制本发明的范围。 说 明 书 4/4 页 6 CN 104521567 B 6 。