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1、10申请公布号CN104213238A43申请公布日20141217CN104213238A21申请号201410392802122申请日20140811D01F4/00200601C08J3/24200601C08L89/00200601C08K5/0720060171申请人武汉轻工大学地址430023湖北省武汉市常青花园学府南路68号武汉轻工大学化环学院72发明人汪海波赵燕汪海婴74专利代理机构武汉开元知识产权代理有限公司42104代理人杜传青54发明名称提高胶原纤维材料抗拉强度的方法57摘要本发明公开了一种提高胶原纤维材料抗拉强度的方法，包括以下步骤1用醋酸溶液溶解天然胶原蛋白，并对磷酸。
2、盐缓冲溶液透析，得到胶原浓度为120MG/ML、PH为6090的胶原溶液；2将胶原溶液转入置于离心机中的离心管内，离心5120分钟；所述离心机的转子为水平转子；3将离心管垂直置于水浴或恒温培养箱中，静置248小时得到胶原胶；4将胶原胶置于0510的戊二醛水溶液中交联124H，随后用蒸馏水反复漂洗；5自然干燥1236小时后，置于鼓风干燥箱中，继续干燥1236小时，得到胶原纤维材料。本发明方法制备的胶原纤维材料中胶原纤维具有一致的排列方向趋势，材料的抗拉强度得以明显提升。51INTCL权利要求书1页说明书4页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图1页1。
3、0申请公布号CN104213238ACN104213238A1/1页21一种提高胶原纤维材料抗拉强度的方法，包括在冰浴条件下用醋酸水溶液溶解天然胶原制备胶原溶液的步骤、对磷酸盐缓冲溶液透析以调节胶原溶液PH的步骤，其特征在于经以上步骤处理后，所得胶原溶液浓度为120MG/ML、PH为6090；然后再进行以下步骤1将胶原溶液转入置于离心机中的离心管内，在1545条件下，控制相对离心力为130G，离心5120分钟；所述离心机的转子为水平转子；2将步骤1处理后的离心管垂直置于2545水浴或恒温培养箱中，静置248小时得到胶原胶；3在室温条件下，将步骤2得到的胶原胶置于0510的戊二醛水溶液中交联12。
4、4H，随后用蒸馏水反复漂洗；4在室温条件下，将步骤3得到的交联胶原胶自然干燥1236小时后，置于鼓风干燥箱中，在2545条件下继续干燥1236小时，得到胶原纤维材料。2根据权利要求1所述的提高胶原纤维材料抗拉强度的方法，其特征在于所述步骤4在自然干燥过程中，将胶原胶的一端垂直向下固定，向另一端持续施加0110N的垂直拉力。3根据权利要求1或2所述的提高胶原纤维材料抗拉强度的方法，其特征在于所述天然胶原是从哺乳动物、鱼类、两栖动物的皮肤、跟腱组织中提取并分离纯化的具有完整三螺旋分子结构的天然胶原。4根据权利要求1或2所述的提高胶原纤维材料抗拉强度的方法，其特征在于所述步骤1的离心条件为温度为20。
5、30，相对离心力为310G，离心时间为520分钟。5根据权利要求3所述的提高胶原纤维材料抗拉强度的方法，其特征在于所述步骤1的离心条件为温度为2030，相对离心力为310G，离心时间为520分钟。6根据权利要求1或2所述的提高胶原纤维材料抗拉强度的方法，其特征在于所述步骤2中，水浴或恒温培养箱的温度为2545，静置时间为1236小时。7根据权利要求3所述的提高胶原纤维材料抗拉强度的方法，其特征在于所述步骤2中，水浴或恒温培养箱的温度为2545，静置时间为1236小时。8根据权利要求1或2所述的提高胶原纤维材料抗拉强度的方法，其特征在于所述步骤3中，戊二醛水溶液的浓度为053，交联时间为1224。
6、H。9根据权利要求3所述的提高胶原纤维材料抗拉强度的方法，其特征在于所述步骤3中，戊二醛水溶液的浓度为053，交联时间为1224H。10根据权利要求1或2所述的提高胶原纤维材料抗拉强度的方法，其特征在于所述步骤1中，所述醋酸水溶液的浓度为0110MOL/L，对磷酸盐缓冲溶液透析的温度为010。权利要求书CN104213238A1/4页3提高胶原纤维材料抗拉强度的方法技术领域0001本发明属于医学生物材料技术领域，具体涉及一种提高胶原纤维材料抗拉强度的方法。背景技术0002近年来，天然胶原特别是型胶原在生物医学材料、医学组织工程、医学美容等领域得到了越来越广泛的应用。如胶原海绵在创伤修复、快速止。
7、血中的应用；胶原胶在面部皮肤除皱、靶向药物制备及药物缓释中的应用；胶原复合材料在人造血管、人造皮肤和骨骼、人工眼角膜移植以及人造跟腱和肌腱/韧带等医学组织工程中的应用。0003良好的抗拉强度是医学组织工程材料要求的一项重要指标。如人造跟腱、人造肌腱材料在植入跟腱或肌腱/韧带的缺损部位后，不仅要求材料具有良好的诱导细胞生长功能，同时要求材料具有较好的抗拉强度以承受人体运动应力并确保材料在机体自身组织修复完整之前保持良好的材料形态和力学性能。但是，现有的胶原基生物材料抗拉伸强度往往不能满足医学组装工程应用的实际需求。0004自组装胶原纤维重组是天然胶原的重要分子行为特征。研究发现，生物体内以自组装。
8、模式形成的胶原纤维在热稳定性、耐酶降解性和生物力学性能等方面均显著优于胶原单体分子的体外性能表现。因此，利用纤维重组的方法制备胶原基生物材料成为提升胶原材料各项性能的一种有效手段。如，中国授权发明专利CN100372579C提供了一种含有自体组织化磷灰石胶原复合体的交联磷灰石胶原多孔体及其制备方法，该方法利用纤维重组技术制备哺乳动物胶原和磷灰石的复合材料，可用于骨组织工程；中国授权发明专利CN101323670B公开了一种医用级重建胶原交联改性的方法，该方法利用纤维重组技术改进胶原的性能并应用于医用生物材料。0005胶原的体外纤维重组分为成核、纤维成长和平衡三个阶段。其中，成核阶段是数个胶原单。
9、分子有序聚集形成胶原微纤维的过程，该过程中胶原微纤维的形态、分布决定了最终胶原纤维的形态分布。在正常情况下，胶原微纤维的分布和取向是完全随机的，因此最终获得的重组胶原纤维材料中胶原纤维的分布方向也是各向同性的。为了满足医学组织工程领域的需求，特别是对材料抗拉强度的要求，有学者尝试制备具有相同取向分布的胶原纤维材料。如，利用电场、磁场或流体力学诱导的方法在胶原纤维重组过程中驱使胶原纤维分布方向趋于一致。中国发明专利CN102341436A公开了一种取向胶原凝胶的制备方法，该方法利用纤维重组技术结合流体力学作用制备具有高度取向的胶原凝胶。这种具有一致纤维取向的材料的优势在于由于胶原纤维分布方向一致。
10、，从而极大地提高了材料的抗拉伸强度，同时，在医学组织工程领域中，这种材料能诱导细胞沿纤维取向方向迁移和增殖，从而能更快地修复跟腱、肌腱/韧带组织。但是，这种利用电场、磁场或流体力学诱导的制备方法亦存在不足，如操作条件要求高、所需仪器设备复杂、不能实现大规模样品的制备等。本发明提供了一种简便方法以制备具有相同纤维取向趋势的胶原纤维材料。说明书CN104213238A2/4页4发明内容0006本发明所要解决的技术问题是提供一种简便且能有效增强胶原纤维材料抗拉强度的方法，以满足人工跟腱、肌腱等医用材料对材料抗拉性能的要求。0007为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案00081在冰浴条件下，用。
11、醋酸水溶液溶解天然胶原蛋白，并对磷酸盐缓冲溶液即PBS透析以调节胶原溶液PH，得到胶原浓度为120MG/ML、PH为6090的胶原溶液；00092将胶原溶液转入置于离心机中的离心管内，在1545条件下，控制相对离心力为130G，离心5120分钟；所述离心机的转子为水平转子SWINGOUTROTOR；00103将步骤2处理后的离心管垂直置于2545水浴或恒温培养箱中，静置248小时得到胶原胶；00114在室温条件下，将步骤3得到的胶原胶置于0510的戊二醛水溶液中交联124H，随后用蒸馏水反复漂洗；00125在室温条件下，将步骤4得到的交联胶原胶自然干燥1236小时后，置于鼓风干燥箱中，在254。
12、5条件下继续干燥1236小时，得到胶原纤维材料。0013进一步地，所述步骤5在自然干燥过程中，将胶原胶的一端垂直向下固定，向另一端持续施加0110N的垂直拉力。0014进一步地，所述步骤1中，所述天然胶原是从哺乳动物、鱼类、两栖动物的皮肤、跟腱组织中提取并分离纯化的具有完整三螺旋分子结构的天然胶原。0015进一步地，所述步骤1中，所述醋酸水溶液的浓度为0110MOL/L，对磷酸盐缓冲溶液透析的温度为010。0016进一步地，所述步骤2的离心条件为温度为2030，相对离心力为310G，离心时间为520分钟。0017进一步地，所述步骤3中，水浴或恒温培养箱的温度为2545，静置时间为1236小时。。
13、0018进一步地，所述步骤4中，戊二醛水溶液的浓度为053，交联时间为1224H。0019本发明具有以下优点0020由于胶原的体外纤维重组分为成核、纤维成长和平衡三个阶段，其中，成核阶段胶原纤维核的排列方向直接决定了最终胶原纤维的排列取向。发明人发现，在胶原组装的成核阶段对组装体系进行离心处理，在离心力的作用下，胶原纤维核能沿离心力方向排布，并在后续组装的纤维成长阶段保持这种排列趋势。在此基础上，在干燥过程中针对胶原胶进一步施加与离心力方向相同的拉伸力，可以使胶原纤维取向更进一步的趋于一致，从而得到具有更高抗拉强度的胶原纤维材料。该方法与现有的具有一致性取向胶原纤维材料的制备方法相比，更加简便。
14、易行，且能够开展较大规模的材料制备。附图说明0021图1为实施例1制备得到的胶原纤维材料用扫描电镜观察胶原纤维的电镜图谱。箭头标注为离心力方向0022图2为实施例2制备得到的胶原纤维材料用扫描电镜观察胶原纤维的电镜图谱。说明书CN104213238A3/4页5箭头标注为离心力方向0023图3为对比例制备得到的胶原纤维材料用扫描电镜观察胶原纤维的电镜图谱。0024图4为实施例1、实施例2和对比例制备得到的胶原纤维材料的拉伸强度对比图每组测定材料样品数N10。具体实施方式0025以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。0026本发明所设计的提高胶原纤维材料抗拉强度的方法包括以下步骤0。
15、0271在冰浴条件下，用醋酸水溶液溶解天然胶原蛋白，并对磷酸盐缓冲溶液即PBS透析以调节胶原溶液PH，得到胶原浓度为120MG/ML、PH为6090的胶原溶液；醋酸水溶液的浓度为0110MOL/L，对磷酸盐缓冲溶液透析的温度为010；00282将胶原溶液转入置于离心机中的离心管内，在1545条件下，控制相对离心力为130G，离心5120分钟；所述离心机的转子为水平转子；00293将步骤2处理后的离心管垂直置于2545水浴或恒温培养箱中，静置248小时得到胶原胶；00304在室温条件下，将步骤3得到的胶原胶置于0510的戊二醛水溶液中交联124H，随后用蒸馏水反复漂洗；00315在室温条件下，将。
16、步骤4得到的交联胶原胶自然干燥1236小时后，置于鼓风干燥箱中，在2545条件下继续干燥1236小时，得到胶原纤维材料。0032实施例10033在冰浴条件下，用05MOL/L的醋酸水溶液溶解提取自草鱼鱼皮的型胶原蛋白。在4条件下对磷酸盐缓冲溶液透析使胶原溶液的PH调整为70，得到浓度为3MG/ML的胶原溶液。将胶原溶液转移至10ML离心管中，在25、相对离心力3G条件下离心5分钟。随后将离心管小心、垂直的取出并垂直转移至恒温箱中，30条件下继续静置24小时。从离心管中取出胶原胶，转移至1的戊二醛溶液中交联24H，随后取出胶原胶并用蒸馏水反复洗涤；然后在室温条件下，将胶原胶的一端垂直固定，向另一。
17、端持续施加07牛的垂直向下拉力，自然干燥24小时之后将胶原胶转移至鼓风干燥箱中30条件下继续干燥24小时后得到胶原纤维材料。0034实施例20035在冰浴条件下，用05MOL/L的醋酸水溶液溶解提取自草鱼鱼皮的型胶原蛋白。在4条件下对磷酸盐缓冲溶液透析使胶原溶液的PH调整为70，得到浓度为3MG/ML的胶原酸溶液。将胶原溶液转移至10ML离心管中，在25、离心力3G条件下离心5分钟。随后将离心管小心、垂直的取出并垂直转移至恒温箱中，30条件下继续静置24小时。从离心管中取出胶原胶，转移至1的戊二醛溶液中交联24H，随后取出胶原胶并用蒸馏水反复洗涤；然后在室温条件下自然干燥24小时之后将胶原胶转。
18、移至鼓风干燥箱中30条件下继续干燥24小时后得到胶原纤维材料。0036对比例0037在冰浴条件下，用05MOL/L的醋酸水溶液溶解提取自草鱼鱼皮的型胶原蛋白。在4条件下对磷酸盐缓冲溶液透析使胶原溶液的PH调整为70，得到浓度为3MG/ML的说明书CN104213238A4/4页6胶原酸溶液。将胶原溶液转移至10ML离心管中，垂直转移至恒温箱中，30条件下静置24小时。从离心管中取出胶原胶，转移至1的戊二醛溶液中交联24H，随后取出胶原胶并用蒸馏水反复洗涤；然后在室温条件下自然干燥24小时之后将胶原胶转移至鼓风干燥箱中30条件下继续干燥24小时后得到胶原纤维材料。0038从图13的扫描电镜的图谱可以发现，相较于对比例中胶原纤维完全随机的排列方式，实施例2中胶原纤维出现了明显的沿离心力方向排列的趋势。而在干燥阶段施加垂直拉力后，实施例1中胶原纤维的这种取向性排列趋势更加明显。0039从图4中可以观察到，实施例2胶原材料的拉伸强度与对比例方法制备得到的材料差异极显著P001，说明采用本发明方法后，胶原材料的抗拉伸力学性能得以显著提升。同时，与实施例2胶原材料相比，实施例1胶原材料的拉伸强度又有了进一步提高，说明在干燥阶段施加垂直拉力可以进一步增强本发明的有益效果。说明书CN104213238A1/1页7图1图2图3图4说明书附图CN104213238A。