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1、(10)授权公告号 CN 102017946 B (45)授权公告日 2014.04.02 CN 102017946 B (21)申请号 200910018526.1 (22)申请日 2009.09.11 CGMCC No.3161 2009.07.03 A01N 37/46(2006.01) A01P 1/00(2006.01) A01P 3/00(2006.01) C12P 13/02(2006.01) C12R 1/465(2006.01) (73)专利权人 中国科学院海洋研究所 地址 266071 山东省青岛市南海路 7 号 (72)发明人 李富超 秦松 姜鹏 王佩圣 冯明祥 陈振德 。
2、(74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 21002 代理人 许宗富 周秀梅 CN 1626507 A,2005.06.15, 说明书第 3 页、 第 4 页第 23-24 行 . Fuchao Li et al.Chinikomycins A and B: Isolation, Structure Elucidation, and Biological Activity of Novel Antibiotics from a Marine Streptomyces sp. Isolate M045.Journal of Natural Products .2005, 第 68 卷。
3、 ( 第 3 期 ),349-353. (54) 发明名称 中尼霉素作为农用抗生素的应用 (57) 摘要 本发明属生物农药技术领域， 具体涉及一种 新碳骨架中尼霉素作为农用抗生素的应用。具体 为新碳骨架中尼霉素作为农用抗生素的应用。所 述新碳骨架中尼霉素作为农用抗生素， 其抗生素 可加工成用于防治农业病害的乳油、 微乳剂及可 湿性粉剂。本发明新碳骨架中尼霉素作为农用抗 生素对多种农作物的细菌、 真菌病害及虫害， 防效 显著， 性能稳定， 对环境友好安全。本发明能对开 发利用我国丰富的海洋微生物资源提供可借鉴的 模式。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 刘南。
4、岑 权利要求书 2 页 说明书 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书2页 说明书7页 (10)授权公告号 CN 102017946 B CN 102017946 B 1/2 页 2 1. 一种中尼霉素作为农用抗生素的应用 ； 所述中尼霉素作为农用抗生素， 其抗生素可 加工成用于防治农业病害的乳油、 微乳剂及可湿性粉剂 ； 所述中尼霉素按下列步骤所得 ： 1)固体培养基培养 ： 将灰橙链霉菌Streptomyces griseoaurantiacus M045接种于M2+ 固体培养基， 28培养 3-4 天， 直至长出白色的孢子 ； M2+固体培养基为 ： 。
5、麦芽提取物 1g， 葡 萄糖 0.4g， 酵母提取物 0.4g， 琼脂粉 1.8g， 人工海水 50ml， 去离子水 50ml ； 2) 摇床培养 ： 将步骤 1) 所得的白色孢子丝接种到 M2+液体培养基中， 并在每升液体培 养基中添加前体物质对氨基苯甲酸50500mg， 同时于28摇床培养， 转速为110rpm， 培养 3-4 天后， 收获发酵液 ； 3) 萃取 ： 发酵液用乙酸乙酯浸提 3-4 次， 浓缩蒸干， 得到膏状粗提物 ； 4) 纯化 ： 粗提物用环己烷浸提， 溶解部分为提取物 I， 不溶解部分为提取物 II ； 然后分 别进行如下操作 ： 1)提取物I经硅胶层析柱， 用环己烷和。
6、乙酸乙酯梯度洗脱， 得到含有化合物中尼霉素A 的组分， 再用环己烷洗 2-3 次， 获得黄色活性化合物中尼霉素 A ； 2) 提取物 II 经硅胶柱层析， 二氯甲烷和甲醇梯度洗脱， 得到含有活性化合物的组分， 再用环己烷和二氯甲烷洗涤 2-3 次， 得到黄色粉末状不溶物质， 经过制备型薄层层析， 于 Rf 0.58 处得到红色化合物中尼霉素 B， 并回收 Rf 0.34 处黄色化合物中尼霉素 A ； 所述灰橙链霉菌 Streptomyces griseoaurantiacus M045 于 2009 年 7 月 3 日保藏于 “中国生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心” ， 其保藏登记号为 ：。
7、 CGMCC3161 ； 所述M2+固体培养基为 ： 麦芽提取物1g， 葡萄糖0.4g， 酵母提取物0.4g， 琼脂粉1.8g， 人 工海水 50ml， 去离子水 50ml ； 所述M2+液体培养基为 ： 麦芽提取物1g， 葡萄糖0.4g， 酵母提取物0.4g， 人工海水50ml， 去离子水 50ml。 2. 按权利要求 1 所述的中尼霉素作为农用抗生素的应用， 其特征在于 ： 所述中尼霉素 为中尼霉素 A 或中尼霉素 B ； 中尼霉素 A 如结构式 1 所示 ； 中尼霉素 B 如结构式 2 所示 ； 结构式 1 权 利 要 求 书 CN 102017946 B 2 2/2 页 3 3. 按权。
8、利要求 2 所述的中尼霉素作为农用抗生素的应用， 其特征在于 ： 所述得到的中 尼霉素为中尼霉素 A 或中尼霉素 B， 先用丙酮将中尼霉素溶解， 再加入乳化剂进行乳化处 理， 乳化剂的加入量为中尼霉素 A 或中尼霉素 B 重量的 0.2， 然后加水稀释成所需浓度。 权 利 要 求 书 CN 102017946 B 3 1/7 页 4 中尼霉素作为农用抗生素的应用 技术领域 0001 本发明属生物农药技术领域， 具体涉及一种新碳骨架中尼霉素作为农用抗生素的 应用。 背景技术 0002 微生物农药是目前农药工业的新产业， 代表着植物保护的方向， 其最大的优势在 于能克服化学农药对生态环境的污染和减。
9、少在农副产品中农药残留量， 同时在示范推广微 生物农药应用的过程中， 农副产品的品质和附加值将大幅提升， 有利于农村经济增长和农 民增收， 社会效益显著。 0003 在国际上， 20世纪80年代发现最有影响力的新的杀虫抗生素Avermectin， 已被美 国默克等公司成功开发成良好的杀虫剂， 除草剂 Phthoxazollin， 被作为先导化合物合成出 目前最好的除草剂 - 草甘膦系列 ； 90 年代发现的新的杀虫抗生素 Spinosad 和杀菌抗生素 Strobilurin 正在开发中， 有望成为很好的生物杀虫剂和杀菌剂。 0004 我国农用抗生素的研究早期主要以仿制国外产品为主， 相继研究。
10、出灭瘟素、 春雷 霉素、 多氧霉素等， 为我国农用抗生素的发展应用奠定了基础。20 世纪 70 80 年代， 国内 逐步开始建立自己的筛选模型， 同时相继研究开发成功井冈霉素、 多效霉素、 公主岭霉素、 农抗 120、 武夷菌素、 中生菌素等。我国农用抗生素占生物农药总产量的 90， 是生产农用 抗生素的大国， 但具有自主知识产权实用化的新农抗品种较少。宁南霉素发酵工艺尚需进 一步完善 ； 中生菌素对水稻白叶枯等多种细菌性病害防效显著， 目前尚只有水剂和可湿性 粉剂两种， 还不能满足不同作物和不同生态环境应用需要。 0005 国内科研人员已经获得井冈霉素和南昌霉素等农用抗生素的生物合成基因簇，。
11、 通 过代谢工程显著提高农用抗生素的产量， 使井冈霉素产生菌的产量超过现有工业生产菌 株 ； 通过基因敲除技术获得只产生南昌霉素或只产生梅岭霉素的工程菌。正在利用丰富的 抗生素基因资源， 通过组合生物合成定向获得新活性新结构的农用抗生素。 0006 近年来， 从陆地微生物中发现新结构抗生素的几率越来越低， 得到有价值的新菌 株或新活性物质的难度越来越大， 例如目前通常从两万多株土壤微生物中才能筛选到 1 株 能产生新结构活性化合物的菌株。 目前的研究现状是， 在90的有生物活性的链霉菌中， 人 们很难找到新的化合物， 尤其是新骨架化合物。 海洋拥有丰富的生物资源， 海洋生物约占地 球生物种群总。
12、数的 80， 它们是生理活性物质和新陈代谢产物的庞大资源。从海洋生物尤 其是海洋微生物中寻找特殊的先导化合物， 筛选具有杀虫、 杀菌、 除草的农用抗生素， 是农 药开发的新方向。 发明内容 0007 本发明目的在于提供一种新碳骨架中尼霉素作为农用抗生素的应用。 0008 为了实现上述目的， 本发明的技术方案如下 ： 0009 新碳骨架中尼霉素作为农用抗生素的应用。 说 明 书 CN 102017946 B 4 2/7 页 5 0010 所述新碳骨架中尼霉素作为农用抗生素， 其抗生素可加工成用于防治农业病害的 乳油、 微乳剂及可湿性粉剂。 0011 所述新碳骨架中尼霉素为中尼霉素 A 或中尼霉素。
13、 B ； 中尼霉素 A 如结构式 1 所示 ； 中尼霉素 B 如结构式 2 所示 ； 0012 结构式 1 0013 0014 结构式 2 0015 0016 所述新碳骨架中尼霉素按下列步骤所得 ： 0017 1) 固体培养基培养 ： 将灰橙链霉菌 (Streptomyces griseoaurantiacus M045) 接 种于M2+固体培养基， 28培养34天， 直至长出白色的孢子 ； M2+固体培养基为 ： 麦芽提取 物 1g， 葡萄糖 0.4g， 酵母提取物 0.4g， 琼脂粉 1.8g， 人工海水 50ml， 去离子水 50ml ； 0018 2) 摇床培养 ： 将步骤 1) 所得。
14、的白色孢子丝接种到 M2+液体培养基中， 并在每升液 体培养中添加前体物质对氨基苯甲酸50500mg， 同时于28摇床培养， 转速为110rpm， 培 养 3 4 天后， 收获发酵液 ； 0019 3) 萃取 ： 发酵液用乙酸乙酯浸提 3 4 次， 浓缩蒸干， 得到膏状粗提物 ； 0020 4) 纯化 ： 粗提物用环己烷浸提， 溶解部分为提取物 I， 不溶解部分为提取物 II ； 然 后分别进行如下操作 ： 0021 1) 提取物 I 经硅胶层析柱， 用环己烷和乙酸乙酯梯度洗脱， 得到含有化合物中尼 霉素 A 的组分， 再用环己烷洗 2 3 次， 获得黄色活性化合物中尼霉素 A ； 0022 。
15、2) 提取物 II 经硅胶柱层析， 二氯甲烷和甲醇梯度洗脱， 得到含有活性化合物的组 分， 再用环己烷和二氯甲烷洗涤23次， 得到黄色粉末状不溶物质， 经过制备型薄层层析， 于 Rf 0.58 处得到红色化合物中尼霉素 B， 并回收 Rf 0.34 处黄色化合物中尼霉素 A ； 0023 所述灰橙链霉菌 (Streptomyces griseoaurantiacus M045) 于 2009 年 7 月 3 日 保藏于 “中国生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心” ， 其保藏登记号为 ： CGMCC3161。 0024 所述得到的新碳骨架中尼霉素为中尼霉素 A 或中尼霉素 B， 先用丙酮将中尼。
16、霉 素溶解， 再加入乳化剂进行乳化处理， 乳化剂的加入量为中尼霉素 A 或中尼霉素 B 重量的 说 明 书 CN 102017946 B 5 3/7 页 6 0.2进行添加， 然后加水稀释成所需浓度。 0025 所述乳化剂可为富华 901( 黑龙江富华公司 )、 京 9 号乳化剂 ( 北京齐民生物有限 公司 )、 农药乳化剂 500 号、 农药乳化剂 700 号等各种农药乳化剂。 0026 本发明具有如下优点 ： 0027 1. 本发明作为农用抗生素的中尼霉素， 其原药和制剂的生产原料易得， 通过发酵 可大量积累， 工艺相对简单， 成本低廉， 适合作为农药的用途。 0028 2. 本发明的农用。
17、抗生素具有广谱的抗菌及杀虫活性， 对多种农业病原真菌、 细菌 及虫害都有效。 0029 3. 本发明作为农用抗生素的中尼霉素在保证原料稳定的同时， 可以通过严格控制 发酵过程的各项参数， 来控制成品的质量， 容易建立完整的质量体系。 0030 4. 本发明作为农用抗生素的中尼霉素其对多种农作物病害具有防治作用， 优于部 分商品化农药 具体实施方式 0031 下面结合具体实施例详述本发明。 0032 实施例 1 ： 0033 新碳骨架中尼霉素作为农用抗生素的应用。所述新碳骨架中尼霉素为中尼霉素 A 或中尼霉素 B ； 中尼霉素 A 如结构式 1 所示 ； 中尼霉素 B 如结构式 2 所示 ； 0。
18、034 结构式 1 0035 0036 结构式 2 0037 0038 并且所述新碳骨架中尼霉素作为农用抗生素， 其抗生素可按照常规方法加工成用 于防治农业病害的乳油、 微乳剂及可湿性粉剂。 0039 所述新碳骨架中尼霉素中尼霉素 A 和中尼霉素 B 的制备方法 ： 0040 (1) 固体培养基培养 ： 将灰橙链霉菌 (Streptomyces griseoaurantiacus M045) 说 明 书 CN 102017946 B 6 4/7 页 7 接种于M2+固体培养基， 28培养34天， 直至长出白色的孢子 ； 所述M2+固体培养基为 ： 麦 芽提取物 1g， 葡萄糖 0.4g， 酵母。
19、提取物 0.4g， 琼脂粉 1.8g， 人工海水 50ml， 去离子水 50ml。 所述灰橙链霉菌 (Streptomyces griseoaurantiacus M045) 于 2009 年 7 月 3 日保藏于 “中 国生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心” ， 其保藏登记号为 ： CGMCC3161。 0041 (2) 摇床培养 ： 接种所述白色孢子丝到 M2+液体培养基 25 升， 培养基中添加前体物 质一对氨基苯甲酸， 添加量 50 500mg/L， 28摇床培养， 转速为 110rpm， 培养 3 4 天后， 收获发酵液 ； 0042 所述 M2+液体培养基为 ： 麦芽提取物 1g。
20、， 葡萄糖 0.4g， 酵母提取物 0.4g， 人工海水 50ml， 去离子水 50ml。 0043 (3) 萃取 ： 发酵液用乙酸乙酯浸提 4 次， 旋转蒸发仪旋转浓缩蒸干， 得到膏状粗提 物， 即为该农用抗生素的原药。 0044 (4)分离纯化 ： 用250ml环己烷浸提粗提物， 溶解部分为提取物I， 不溶解部分为提 取物 II ； 然后分别作如下操作 ： 0045 1)提取物I经硅胶柱层析， 用环己烷和乙酸乙酯梯度(100/00/100)洗脱， 在环 己烷与乙酸乙酯 (50/50 0/100) 梯度下， 得到含有化合物中尼霉素 A 的组分， 用 50ml 环 己烷洗涤两次， 获得产物中尼。
21、霉素 A ； 0046 2) 提取物 II 经硅胶柱层析， 二氯甲烷与甲醇梯度 (100/0 0/100) 洗脱， 100 二氯甲烷洗脱得到组分 a， 二氯甲烷与甲醇 (99.5/0.5 98/2) 梯度下得到组分 b， 二氯 甲烷与甲醇 (95/5 90/10) 梯度下得到组分 c， 取所述组分 b 用含有 25二氯甲烷的 环己烷 25ml 洗涤两次， 得到黄色粉末状不溶物质， 经过制备型薄层层析 (PTLC， 层析板为 2020cm， 展开剂为 95二氯甲烷与 5甲醇 )， 于 Rf 0.34 处得到产物中尼霉素 A， 于 Rf 0.58 处得到红色化合物中尼霉素 B。 0047 所述灰橙。
22、链霉菌 (Streptomyces griseoaurantiacus M045)， 于 2009 年 7 月 3 日 保藏于 “中国生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心” ， 其保藏登记号为 ： CGMCC3161。该 菌株在高氏一号培养基上， 生长形成红色的营养菌丝体和白色的气生菌丝体， 基内菌丝没 有横隔和断裂， 气生菌丝有较多分支， 没有可溶性色素， 孢子链直或弯曲， 表面光滑的球形 或椭圆形孢子 ； 具有明胶、 淀粉酶、 过氧化氢酶等水解活性， 不产生黑色素和硫化氢 ； 可利 用葡萄糖、 果糖、 鼠李糖等碳源 ； 细胞壁化学组分， 糖型 C， 无特征性糖， 含有 L， L-DAP( 。
23、左消 旋二氨基庚二酸 ) ； 该菌 16SrDNA 序列的 GenBank 登录号为 AY644669。 0048 实施例 2 ： 中尼霉素杀菌活性测定 0049 (1) 乳化剂制备 ： 将上述得到的新碳骨架中尼霉素的原药， 其由中尼霉素 A 和中尼 霉素 B 组成， 将原药加入乳化剂进行乳化处理， 乳化剂的加入量为原药重量百分比的 0.2 进行添加， 然后加水稀释成所需浓度。在本实施例中加入京 9 号乳化剂 ( 北京齐民生物有 限公司生产 )， 还可采用富华 901( 黑龙江富华公司 )、 农药乳化剂 500 号或农药乳化剂 700 号。 0050 (2) 室内活性测定 ： 采用生长速率法测。
24、定本发明中尼霉素的杀菌毒力， 按倍稀释 法， 设7个浓度梯度， 在无菌操作条件下， 将1ml上述不同浓度梯度的中尼霉素， 分别与49ml PDA 培养基 ( 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 ) 均匀混合， 倒入 4 个直径为 9cm 的无菌培养皿中， 凝固后， 每皿接种 1 块直径 0.5cm 的受试菌饼 ( 纯培养 )， 在 251恒温条件下培养 72 小 说 明 书 CN 102017946 B 7 5/7 页 8 时， 量取菌落直径， 以加无菌水的作为对照， 计算抑菌率 ( 参见表 1-8)。 0051 0052 统计方法， 以杀菌剂浓度 (mg/kg) 的对数值为自变量， 抑菌率的机率值为因变。
25、量， 建立毒力回归方程， 计算出有效浓度 (EC50) 和 (EC90)。 0053 表 1 中尼霉素对黄瓜炭疽病菌室内活性测定结果 0054 0055 表 2 中尼霉素对黄瓜枯萎病菌室内活性测定结果 0056 0057 表 3 中尼霉素对茶树炭疽病菌室内活性测定结果 0058 0059 表 4 中尼霉素对茶树叶枯病菌室内活性测定结果 0060 0061 表 5 中尼霉素对芦笋茎枯病菌室内活性测定结果 0062 说 明 书 CN 102017946 B 8 6/7 页 9 0063 表 6 中尼霉素对桃褐腐病菌室内活性测定结果 0064 0065 表 7 中尼霉素对大葱紫斑病菌室内活性测定结果。
26、 0066 0067 0068 表 8 中尼霉素对杏疮痂病菌室内活性测定结果 0069 0070 (3) 采用生长速率法测定本发明中尼霉素与市场售农药的杀菌毒力的差异， 以番 茄早疫病菌和番茄枯萎病菌为受试菌， 对照药为 ： 3克菌康 WP( 中生菌素， 中国农科院环 发所微生物农药研制中心 )， 10宝丽安 WP( 多抗霉素， 南通丸宏农用化工有限公司 )， 1 武夷菌素 WP( 潍坊万胜生物农药有限公司 )， 75百菌清 WP( 青岛奥迪斯生物科技有限公 司 )。实验结果如下 ： 0071 表 9 对番茄早疫病菌室内活性测定结果 ( 菌落直径 ： cm) 0072 说 明 书 CN 102。
27、017946 B 9 7/7 页 10 0073 表 10 对番茄枯萎病菌室内活性测定结果 ( 菌落直径 ： cm) 0074 0075 表中浓度均为有效成分浓度， 表 9 中结果表明， 在均为 1mg/kg 浓度下， 1本发明 中尼霉素的菌落直径 ( 番茄早疫病菌 ) 最小， 为 3.1cm， 抑菌效果最好， 其次是 1武夷菌素 水剂， 菌落直径为 3.7cm。表 10 同样显示类似结果， 因此在相同有效成分浓度下， 1中尼 霉素对番茄早疫病菌和番茄枯萎病菌的抑菌效果， 优于 1武夷菌素水剂、 3克菌康 WP、 10宝丽安 WP 及化学农药 75百菌清 WP。 说 明 书 CN 102017946 B 10 。