技术领域
本申请发明涉及基于借助ALSV载体导入拟南芥FT基因的蔷薇科果 树的开花促进方法。
背景技术
植物由于是固定的生物，所以必须从周围获取多种信息在最适的环境 下发芽、生长。尤其是花芽的形成是由茎顶分裂组织的营养生长转变为生 殖生长这样的意味着发生剧烈变化的程序过程之一，在使基于有性生殖的 繁殖成功方面，决定该变化的时机特别重要。例如苹果中，种子从发芽开 始，经过6～12年这样非常长的营养成长期，直至首次开花。由于这些由 遗传决定，其详细机理尚不明确，对于苹果的品种改良等是非常大的障碍。
花芽形成开始的时机已知的是受到营养状态、昼夜节律或植物的生育 阶段等内因，以及基于温度、光周期等环境的外因控制(非专利文献1)。 近年来，通过利用模型植物的长日植物的Arabidopsis thaliana(以下称为 拟南芥)，进行了深入研究，提出了光周期(photoperiodic)、春化 (vernalization)、赤霉素(GA)以及自律的(autonomous)花芽形成促 进这4个通路决定花芽形成的理论(非专利文献2-4)。由于这些通路的 各信号根据需要互相补充起作用，即使其中哪一个机能丧失，花芽形成也 不会完全受到阻碍。另外，花芽形成的信号受FLOWERING LOCUS T (FT)基因和SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1(SOC1) 基因综合控制，促进诱导花的形态形成的APETALA1(AP1)基因和 LEAFY(LFY)基因的表达，促进开花(非专利文献5-7)。作为通路整 合基因的FT基因是通过光周期花芽促进通路而大量表达的基因，该基因 的转录控制是调节花芽形成方面最重要的步骤。
FT基因是1991年根据花芽形成延迟变异体的解析而阐明的(非专利 文献8)。已知通过昼夜节律(日文：概日時計)和受光体的相互作用感 受日长的变化的位置是叶，在叶的韧皮部组织诱导CONSTANS(CO)基 因的表达(非专利文献6、9)，进而，CO基因的表达促进FT基因的表 达(非专利文献10-14)。已知的是，叶中表达的FT基因以FT蛋白质的 形式转移至茎顶分裂组织(非专利文献15)。另外，确认茎顶中特异性 表达的FD基因对bZIP型转录因子进行编码，FD蛋白质集中在核中(非 专利文献16、17)。FD蛋白质的控制靶标是作为花芽分裂调节基因的AP1 基因，FT蛋白质通过与该FD蛋白质结合来促进AP1基因的转录活性， 促进花芽形成(非专利文献16、18)。
另一方面，已知表现出与FT基因有高相同性的拟南芥的TERMINAL FLOWER 1(TFL1)基因，与FT基因相反，抑制花芽形成(非专利文 献19，20)。TFL1基因由于其高相同性而对FT基因进行拮抗，这是因为 其通过与FD蛋白质结合，而阻碍AP1基因的转录活性(非专利文献21)。 通过制作将TFL1基因失活了的变异体的转化体，已经证实了抑制该TFL1 基因的表达会促进花芽形成(非专利文献22)。另外，最近报告了导入了 苹果的TFL1(MdTFL1)基因的反义链的变异体实际上在苹果中促进花 芽形成的例子，这被推测为是基于TFL1基因的沉默的原因(非专利文献 23)。基于RNA沉默的基因的表达调节也许是今后作为阐明该花芽形成 调节机构的遗传学的研究方法的有效方法。
苹果潜隐球形病毒(Apple latent spherical virus：ALSV)是由2段单 链RNA基因组(RNA1和RNA2)和3种外被蛋白质(Vp25，Vp20，Vp24) 构成的直径25nm的病毒，已知除了对苹果以外，还对5种的茄科植物 [Nicotiana tabacum cv.Xanthi nc(以下称为称烟草)、Nicotiana glutinosa(以 下称为称粘液烟草)，Nicotiana occidentalis(以下称为称西方烟)、烟草本 赛姆氏、矮牵牛]、拟南芥等有潜在感染性(非专利文献24)。ALSV对于 实验植物Chenopodium quinoa(以下称为称黎麦)全身感染，引发叶脉透 过、退绿斑纹的症状(非专利文献25、26)，对于大豆，在感染初期引发 退绿斑纹症状。至今已制作出ALSV-RNA2编码的细胞间转移蛋白质 (MP)和Vp25之间反复有蛋白酶剪切位点且附加了外来基因导入位点 的感染性cDNA克隆(非专利文献27-30)，进而，已经报告了利用其的 感染植物中的外来基因的表达(专利文献2，非专利文献27，31，32)。 ALSV作为对于以苹果为首的大部分宿主具有潜在感染性的病毒载体具 有非常有利的特征，期待能够在各种有用基因的导入和表达、进而利用 VIGS的后基因组解析、基于原宿主的苹果的育种中的多种应用等。
【专利文献1】日本特开2008-211993号公报
【专利文献2】日本特开2004-65009号公报(苹果中外来基因的表 达)
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【非专利文献27】Li C，Sasaki N，I sogai M，Yoshikawa N.2004.Stable expression of foreign proteins in herbaceous and apple plants using Apple latent spherical virus RNA2vectors.Arch Virol 149，1541-1558.
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【非专利文献29】李春江.1999.リンゴから分離された小球形ウイ ルスの分類学的研究(从苹果分离的小球形病毒的分类学的研究).岩手 大学大学院农学研究科修士论文.
【非专利文献30】李春江.2003.リンゴ小球形潜在ウイルス槽造の ゲノムとウイルスベクタ一ヘの改变に関する研究(关于苹果潜隐球形病 毒结构的基因组和对病毒载体的改变的研究).岩手大学大学院连合农学 研究科博士论文.
【非专利文献31】佐佐木伸浩.2003.ALSVベクタ一による抗菌性ペ プチドの植物体での発現(基于ALSV载体的抗菌性肽在植物体中的表达). 岩手大学农学部应用生物学科卒业论文.
【非专利文献32】佐佐木伸浩.2005.GFPでタグしたリンゴ小球形 潜在ウイルスの細胞間および長距離移行の解析(用GFP标记的苹果潜隐 球形病毒的细胞间和长距离转移的解析).岩手大学大学院农学研究科修 士论文.
发明内容
【发明要解决的课题】
我国的主要果树苹果和梨等蔷薇科果树从播种到开花通常要6～12 年，这是苹果和梨的育种(品种改良)困难最大的原因之一。
近年对于苹果也一直在阐明关系花芽形成的基因机构，如上所述，已 经报道了抑制花芽形成的苹果TFL1基因的表达抑制可促进苹果的花芽 形成。即，对于苹果(品种：王林)，使用叶盘法导入TFL1基因的反义 链，进行组织培养和茎叶(shoot)再生后得到的转化苹果的茎叶嫁接于 矮性砧木，随后，相对于在同条件下培养的非转化苹果搬入温室后至开花 需要约6年(69个月)，搬入温室进行培养的转化苹果，在搬入温室后8～ 25个月开花(非专利文献23)。然而，现状是苹果的转化需要很多劳动力， 并且组织培养和茎叶再生需要很长时间，而且转化效率也低(非专利文献 23中的苹果的转化效率为0.15％)，进而，能转化的苹果品种也受到限制。 另外，为了使转化苹果的导入基因能在下一代继承，现在的趋势是对于转 化植物的限制很严，即使得到早期开花的转化苹果，从该转化苹果得到的 下一代个体也不能直接作为育种材料使用。
另一方面，基于病毒载体的对植物进行的外来基因导入，是通过使重 组了外来基因的病毒感染植物并增殖来实现的，因此与转化法比较，富有 简便性和迅速性。作为有效发挥功能的病毒载体的条件，可举出对感染植 物不引起剧烈的病征或在感染植物中稳定增殖等，ALSV载体是满足这些 条件的病毒载体。即，ALSV载体可以不引起苹果发病地进行无病征感染， 稳定地维持全身感染。已知有使用ALSV载体的外来基因的导入技术(例 如，专利文献2)，但是使用了该ALSV载体技术的蔷薇科果树的开花促 进完全是未知的。另外，通常对果树类进行稳定的病毒接种是困难的，对 于ALSV也没有确立对以苹果为主的蔷薇科果树的有效的接种法，这对 于蔷薇科果树中的使用ALSV载体的外来基因导入技术的利用形成巨大 障碍。然而，如上所述，ALSV载体具有作为苹果为主的蔷薇科果树的病 毒载体的优良的特性。另外，ALSV虽然进行种子传染但其种子传染率低， 因此有可能从使用ALSV载体技术进行了开花促进的苹果的下一代选取 没有病毒的个体，该选取的没有病毒个体与未进行基因导入的苹果没有区 别，可以直接用作育种材料。因此，如果能够确立基于ALSV载体技术 的以苹果为主的蔷薇科果树的开花促进法，即可以期待其成为有用的实用 技术。
本申请发明是鉴于以上所述情况而研发的，其课题在于提供用于促进 以苹果为主的蔷薇科果树的开花的新技术。
解决课题的技术
作为为了解决上述的课题的发明，本申请提供一种蔷薇科果树的开花 促进方法，其特征在于，包括使用基因枪法将从被表达拟南芥FT基因的 重组苹果潜隐球形病毒(FT-ALSV)所感染的增殖宿主中浓缩的病毒 RNA，接种于刚扎根的蔷薇科果树实生株的子叶的工序。
本申请还提供利用上述任一种方法实施了开花促进的从蔷薇科果树 的下一代个体分选的没有病毒的个体或其种子。
【发明的效果】
根据本申请发明，可将通常需要6～12年的苹果、梨的开花大幅短缩 为1.5～3个月。由此，可以有效进行苹果、梨等蔷薇科果树的品种改良。
另外，从利用上述任一的方法实施了开花促进的蔷薇科果树的下一代 个体中分选出的没有病毒的个体，与未进行基因导入的苹果个体没有区 别，该分选个体和其种子可以直接作为育种材料使用。
附图说明
图1是FT-ALSV接种后约1.5个月开花的实生株苹果的照片。
图2是从FT-ALSV感染苹果开花个体采取的花粉的发芽的形态。该 个体的花粉发芽率约为80％。
具体实施方式
本申请发明中的蔷薇科果树特指属于蔷薇科梨亚科(Maloideae)的 苹果、梨、枇杷等。
拟南芥FT基因基于公知的序列信息(GenBank/AB027504)，可以通 过以拟南芥的总RNA为模版的RT-PCR、或拟南芥cDNA文库的噬斑杂 交法等公知的方法取得。具体而言，可以通过后记的实施例中所述的顺序 容易地取得。
表达FT基因的重组ALSV载体(FT-ALSV)的制作基本上可以根据 专利文献2公开的方法进行。即，在作为ALSV RNA2的感染性cDNA 克隆的pEALSR2L5R5的外来基因导入位点插入FT基因cDNA，由此构 建pEALSR2L5R5FT，与作为ALSV RNA1的感染性cDNA克隆的 pEALSR1一同在增殖宿主中接种，进行病毒化，由此得到FT-ALSV。
从由此得到的FT-ALSV感染黎麦用浓缩FT-ALSV，将从浓缩试样提 取的RNA用基因枪法接种于蔷薇科果树实生株的子叶，能以大致100％ 的效率制作出FT-ALSV感染实生株苗，可以大幅加速苹果等蔷薇科果树 的开花。本申请发明中的FT-ALSV的基因枪接种可以按照以下的顺序进 行。
工序(1)：将FT-ALSV接种于增殖宿主(例如，黎麦)。
工序(2)：从增殖宿主的感染叶提取FT-ALSV，通过离心分离等处 理进行浓缩。
工序(3)：从该浓缩的FT-ALSV中分离RNA。
工序(4)：用基因枪法对刚扎根后的蔷薇科果树植物实生株的子叶接 种上述RNA。
这些具体的操作，详细地记载于后记实施例中，根据实施例的记载就 可以实施，特别需要说明的是，作为该方法的特征之一是接种上述工序(3) 中从FT-ALSV分离的RNA，以及上述工序(4)中对蔷薇科果树实生株 的子叶进行接种。
另外，工序(4)中的“刚扎根后的蔷薇科果树植物实生株的子叶”如 以下方法制备。首先，将休眠结束后的没有扎根期间的实生株苗的种子的 种皮用手术刀除去，露出子叶。然后，使用基因枪将涂布有RNA的微载 体接种于子叶。这样，接种的FT-ALSV以100％的效率将蔷薇科果树实 生株感染。
接种了RNA的种子在遮光保持湿度的状态静置2～3日之后，慢慢 适应了外部空气，随后移植于培养土中，以通常的生长温度(约25℃) 进行培养。
由此培养的蔷薇科果树，为后记的实施例所示苹果时，约40％的个 体在1.5～3个月开花。
以下，示出实施例，对本申请发明进一步详细且具体地说明，但是本 申请发明并不限于以下的例子。
【实施例1】
1.材料和方法
(1)FT-ALSV的感染性cDNA克隆的构建
将拟南芥FT基因(864bp，accession number：AB027504)的FT蛋 白质表达区域的525bp(碱基编号70～594号)用如下方法扩增。DNA 扩增时，模版使用在pBlue script II SK(+)的XbaI/SacI位点重组了F T mRNA的碱基编号29～709号序列的质粒(pBSAtFT-19)，另外，正链 引物使用了10μM FT-Xho(+)[5’-CCGCTCGAGATGTCTATAAATATA AGAGA-3’](序列编号1)，反链引物使用了10μM FT-Sma(-)[5’-TCC CCCGGGAAGTCTTCTTCCTCCGCAGC-3’](序列编号2)。将模版DNA 溶液(10ng/μl)1μl、正链引物和反链引物各2μl、1.6μl 2.5mM dNTP mixture(TaKaRa)、2μl 10×Ex Taq Buffer(TaKaRa)、11.2l灭菌水、0. 2μl TaKaRa Ex Taq混合，使用GeneAmp PCR System2400(Perkin El mer)，94℃进行5分钟处理后，将[94℃，30秒→55℃，30秒→72℃，6 0秒]的反应重复35个循环，接着在72℃进行7分钟处理后，最后在4℃ 进行5分钟处理，结束PCR。向得到的PCR产物1μl加入Loading Buff er[0.25％溴酚蓝，1mM EDTA(pH8.0)，40％蔗糖]1μl，上样于用琼脂糖 S(Nippongene制)0.15g、TAE[40mM Tris，20mM乙酸，1mM EDTA (pH8.0)]15ml、溴化乙锭(ethidium bromide)0.6μl制备的1％琼脂糖 凝胶的样孔中，进行电泳，确认扩增的DNA为所需要的FT基因的尺寸。
接着，将扩增了的FT基因在XhoI和SmaI中按照以下方式剪切。首 先，将10μl用PCR扩增了的FT基因的溶液、10μl 10×K Buffer(TaKaRa)、 78μl灭菌水、2μl XhoI(TaKaRa)混合，在37℃静置2小时。在该反应 液中依次加入100μl的灭菌水、100μl的TE[10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA(pH8.0)]饱和苯酚、100μl的氯仿，用涡旋振荡器搅拌30秒钟， 以14000rpm进行5分钟(4℃)离心分离。在上清200μl中加入等量的氯 仿，用涡旋振荡器进行30秒钟搅拌后，以14000rpm进行5分钟(4℃) 离心分离，将该上清200μl转移至另外的1.5ml离心管中。在该上清中加 入20μl的3M乙酸钠(pH5.2)、600μl的99％乙醇，充分地搅拌后，在-80℃ 进行30分钟静置。在以14000rpm进行10分钟(4℃)离心分离得到的 沉淀中加入70％乙醇1ml，以14000rpm进行5分钟(4℃)离心分离。舍 去上清，将沉淀减压干燥，混悬于50μl的灭菌水中。接着在该溶液中混 合10μl 10×T Buffer(TaKaRa)、10μl 0.1％BSA(TaKaRa)、28μl灭菌水、 2μl SmaI(TaKaRa)，在25℃进行2小时静置。在实施了限制酶处理的反 应液中加入100μl的灭菌水、100μl的TE饱和苯酚、100μl的氯仿，利用 涡旋振荡器进行30秒钟搅拌，以14000rpm进行5分钟(4℃)离心分离。 在上清200μl中加入等量的氯仿，利用涡旋振荡器进行30秒钟搅拌后， 以14000rpm进行5分钟(4℃)离心分离。离心分离后，在该上清200μl 中加入20μl的3M乙酸钠(pH5.2)和600μl的99％乙醇，充分地搅拌后， 在-80℃进行30分钟静置。在以14000rpm进行10分钟(4℃)离心分离 得到的沉淀中加入70％乙醇1ml，以14000rpm进行5分钟(4℃)离心分 离。舍去上清，将沉淀减压干燥，将其混悬于20μl的灭菌水中。也与上 述相同地对在ALSV-RNA2附加了外来基因导入位点的感染性cDNA克 隆的pEALSR2L5R5(100ng/μl)10μl进行基于XhoI和SmaI的酶处理。
接下来，使用QIA quick Gel Extraction Kit(QIAGEN)回收经限制酶 处理了的FT基因和pEALSR2L5R5。在FT基因的溶液18μl中加入 10×Loading Buffer 2μl，将其上样于1％琼脂糖凝胶的样孔中，进行电泳， 然后用手术刀从琼脂糖凝胶切出目的DNA片断，加入1.5ml离心管中测 定凝胶的重量。在1.5ml离心管中加入凝胶的3倍体积的Buffer QG，加 温至50℃，将凝胶完全溶解，确认溶液的色为黄色。加入与凝胶等量的 异丙醇，在2ml离心管中设置色谱柱，在其中加入溶解有凝胶的溶液， 以10000rpm进行1分钟(室温)离心分离。弃去留在2ml离心管的溶液， 对色谱柱加入750μl的Buffer PE进行清洗，以10000rpm进行1分钟(室 温)离心分离后，再次将留在2ml离心管的溶液舍去。以10000rpm进行 1分钟(室温)离心分离，将色谱柱安放在新的1.5ml离心管中，在色谱 柱的中央加入用于DNA溶出的30μl的Buffer EB[10mM Tris-HCl (pH8.5)]，静置1分钟后，以13000rpm进行1分钟(室温)离心分离。
将凝胶回收后的FT基因作为插入DNA，将pEALSR2L5R5作为质 粒载体，进行连接反应。将插入DNA溶液4μl和质粒载体溶液1μl混合， 加入DNA Ligation Kit Ver.2.1(TaKaRa)的I液5μl，在16℃静置2小时 后，加入1.1μl的III液作为连接反应溶液。
转化是通过热冲击(Heat Shock)法进行的。在-80℃条件下保存的 100μl的感应细胞在冰水中缓慢解冻，向其中加入连接反应溶液5μl，用5 秒钟缓慢混合，在冰水中静置30分钟。接着，使用水浴，在42℃进行45 秒钟加温，结束后在冰中冷却2分钟。在超净台内，将预热了的SOC[2％ 胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.058％NaCl，0.019％KCl，10mM MgCl2， 10mM MgSO4，20mM葡萄糖]900μl加盖用封口膜卷裹，使用震荡培养 器，在37℃进行1小时震荡。将该培养液200μl滴加于LMA板[1％胰蛋 白胨，0.5％酵母提取物，0.058％NaCl，10mM MgSO4，1.5％琼脂，40mg/ml 氨苄西林]上，用刮涂器涂布于培养基的表面，以打开培养皿的盖子的状 态进行10分钟干燥。将剩余培养液800μl以14000rpm进行30秒钟离心 分离，舍去上清600μl，在剩余200μl的溶液中将沉淀混悬。将该溶液中 的100μl同样地滴加在LMA板上，用刮涂器涂布于培养基的表面，进而， 在打开盖子的状态，干燥10分钟。培养基干燥后，将各板移入培养箱， 在37℃进行12～16小时培养。
为了小规模培养转化了的菌落，准备16根加入了2ml的LB培养液 [1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl]的试管，高压反应釜处理后， 在各试管中添加40μl10倍稀释了的氨苄西林[25mg/ml]。用灭菌了的牙签 的尖端挑取菌落，接触于LMA板，由此接种了大肠杆菌的一部分而制成 主板，牙签直接投入装有LB培养液的试管中。主板中，对每个菌落进行 编号来区别，37℃进行一夜静置培养后，用聚乙烯带进行密闭，在4℃保 存。在装入了LB培养液的试管中，标注与主板对应的编号，倾斜在37℃ 进行一夜震荡培养后，将各试管的全部转移至标注相同的编号的16根 1.5ml离心管中，以14000rpm进行1分钟(室温)离心分离。以下，示 出对于16根各1.5ml离心管进行的操作。用吸引器除去上清，加入 STET[0.1M NaCl、10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA(pH8.0)、5％ TritonX-100]350μl并混和，使沉淀悬浮。在10mM Tris-HCl(pH8.0)中 加入配制为10mg/ml的溶菌酶溶液25μl进行3秒钟搅拌，40秒钟煮沸后， 在冰中进行5分钟冷却。以14000rpm进行10分钟(室温)离心分离， 用灭菌的牙签除去沉淀，向剩余上清中加入3M乙酸钠(pH5.2)40μl和 异丙醇420μl，进行搅拌后，室温下静置5分钟。将其以14000rpm进行5 分钟(4℃)离心分离，小心去除上清。在得到的沉淀中加入500μl的70％ 乙醇，以14000rpm进行5分钟(4℃)离心分离后，除去上清，将沉淀 减压干燥。在其中加入50μl调整为RNase20μg/ml的TE添加，使其混悬， 37℃进行30分钟静置，制成质粒溶液。
用限制酶处理来确认通过小规模培养得到的质粒中是否导入了FT基 因。将质粒溶液2μl，10×K Buffer(TaKaRa)1μl，灭菌水6.8μl，XhoI (TaKaRa)0.2μl移入新的1.5ml离心管，进行混合，在37℃进行2小时 静置。随后，按顺序加入90μl的灭菌水、50μl的TE饱和苯酚、50μl的 氯仿，利用涡旋振荡器进行30秒钟搅拌，以14000rpm进行5分钟(4℃) 离心分离。在上清100μl中加入等量的氯仿，利用涡旋振荡器进行30秒 钟搅拌后，以14000rpm进行5分钟(4℃)离心分离，将该上清100μl 移至其他1.5ml离心管中。在该上清中，加入10μl的3M乙酸钠(pH5.2)、 300μl的99％乙醇，充分地搅拌后，-80℃进行30分钟静置。静置后，以 14000rpm进行10分钟(4℃)离心分离，在得到的沉淀中，加入70％乙 醇500μl，以14000rpm进行5分钟(4℃)离心分离。舍去上清，将沉淀 减压干燥，将其在10μl的灭菌水混悬。接着在该溶液中混合10×T Buffer (TaKaRa)2μl、0.1％BSA(TaKaRa)2μl、灭菌水5.6μl、SmaI(TaKaRa) 0.4μl，25℃条件下静置2小时。静置后，在用XhoI和SmaI处理了的质 粒溶液9μl中加入10×Loading buffer 1μl，在1％琼脂糖凝胶的样孔中上样， 进行电泳。泳动的结果，将通过PCR得到的FT基因和相同的尺寸的片 断从质粒切出，记录样品的编号，接下来的大规模培养中使用记录有该编 号的菌落。
在大规模培养中使用加入200μl的氨苄西林的100ml的LB培养液和 QIAGEN Plasmid Midi Kit(100)(QIAGEN)来进行。用牙签从主板采取 单一菌落，将其加入装入有LB培养液的坂口烧瓶中，在37℃振荡培养 12～16小时，培养后在离心试管(FalconTM)中移入培养液50ml，在 7500rpm，进行15分钟(4℃)离心分离。舍去上清，剩余的50ml也同 样地进行离心分离，随后，将片状沉淀物(pellet)在加入了RNase的4ml 的Buffer P1中混悬，添加4ml的Buffer P2后，进行4～6次转倒使其充 分地混和，在室温静置5分钟。添加4ml冷却的Buffer P3，倒转4～6次， 进行混和后，冰上培养15分钟。接着，将溶液移至50ml的离心管，以 13000rpm(日立RPR16离心机)进行30分钟(4℃)离心分离，回收含 有质粒DNA的上清。将该上清再度以13000rpm进行15分钟(4℃)离 心分离。在色谱柱上添加4ml的Buffer QBT，使其自然落下直至色谱柱 变为空白，进行平衡化，将离心分离得到的上清添加于该色谱柱，使其浸 透在树脂中。将色谱柱用10ml的Buffer QC清洗2次，用5ml的Buffer QF， 将DNA溶出于新的离心试管(FalconTM)中。在溶出的DNA溶液中添 加异丙醇3.5mL并混和后，加入COREX管中，直接用11000rpm进行30 分钟(4℃)离心分离(日立RPR16离心机)，迅速倾析除去上清。将沉 淀的DNA用70％乙醇2ml进行清洗，以11000rpm进行10分钟(4℃) 离心分离，除去上清，将沉淀的DNA减压干燥后，溶解于TE100μl中。 使用分光光度计(ND-1000v3.1.2)，调制DNA的浓度至1μg/μl，得到在 pEALSR2L5R5中导入了FT基因的感染性cDNA克隆pEALSR2L5R5FT。
(2)感染性cDNA克隆的病毒化
根据(1)的方法，将作为从大规模培养精制的ALSV RNA1的感染 性cDNA克隆的pEALSR1调制成1μg/μl。在增殖宿主的Chenopodium quinoa(以下称为黎麦)的叶上撒上碳化硅，将pEALSR1(1μg/μl)和 pEALSR2L5R5FT(1μg/μl)等量混合的DNA溶液在这些叶上以每叶8μl 的方式进行接种，进行病毒化，由此得到表达FT基因的ALSV载体 (FT-ALSV)。将通过FT-ALSV感染而表现退绿症状的黎麦叶取样，用 于以后的操作。
(3)病毒的浓缩
连接了FT基因的ALSV(FT-ALSV)的浓缩按照以下的顺序进行。 首先，将FT-ALSV接种Chenopodium quinoa(以下称为黎麦)后，取样 7～10日的接种叶和显现病征的顶叶。对于该感染叶100g，加入300ml 的提取缓冲液[0.1M Tris-HCl(pH7.8)、0.1M NaCl、5mM MgCl2]和3ml 的巯基乙醇，用高速组织捣碎机磨碎。磨碎液用2层纱布过滤，用9000rpm 进行10分钟(4℃)离心分离(日立RPR12-2离心机)。在得到的溶液中， 一边搅拌(40mg/ml)一边慢慢加膨润土溶液，9000rpm进行10分钟(4℃) 离心分离。重复该操作直到上清变为透明黄色为止，进行澄清化。接着， 在上清中加入8％聚乙二醇，在冰中进行1小时搅拌。用9000rpm进行10 分钟(4℃)离心分离后，将沉淀溶解于20ml的提取缓冲液中。接着， 加入10ml的氯仿进行15分钟(4℃)搅拌。用9000rpm进行10分钟(4℃) 离心分离(日立RPR16离心机)后，将上清用45000rpm进行1.5小时(4℃) 离心分离(日立RP65离心机)。在沉淀中加入1ml的提取缓冲液，使其 充分地混悬后，用9000rpm进行10分钟(4℃)离心分离，浓缩该上清 制得FT-ALSV。
(4)RNA的提取
从浓缩FT-ALSV提取RNA，用于微载体的制备。从浓缩FT-ALSV 提取RNA按照以下的顺序进行。在浓缩FT-ALSV 50μl中加入灭菌水 150μl，搅拌后，加入水饱和苯酚和氯仿各100μl，利用涡旋振荡器进行充 分地搅拌。以14000rpm进行5分钟(4℃)离心分离后，将上清200μl 移至新的1.5ml离心管中，加入20μl的3M乙酸钠(pH5.2)，500μl的 99％乙醇，充分地搅拌后，在-80℃进行15分钟静置。以14000rpm进行 15分钟(4℃)离心分离，在得到的沉淀中加入70％乙醇1ml，以14000rpm 进行5分钟(4℃)离心分离。舍去上清，将沉淀在15μl的灭菌水中混悬。 用分光光度计(ND-1000v3.1.2)将得到的溶液配制为1μg/μl，将其作为 RNA溶液。
(5)基因枪接种(Biolistic PDS-1000/He Particle Delively System (Bio-Rad))
微载体(RNA；3μg/金粒子；0.4mg/shot)的制备按照以下的顺序进 行。首先，在1.5ml离心管中量取金粒子(0.6μm)2.4mg，加入灭菌水 100μl，利用涡旋振荡器进行充分地混和。在超声波清洗机中加入离心管， 进行5分钟超声破裂。在涡旋振荡器安装试管，一边搅拌一边慢慢加入 18μl的RNA溶液(1μg/μl)。同样地，加入5M乙酸铵11.8μl，再慢慢加 入异丙醇259.6μl。经过一段时间搅拌后，在-20℃静置1小时以上。去除 上清，利用涡旋振荡器对金粒子的沉淀进行一瞬间的搅拌。在金粒子的沉 淀中加入1ml的100％乙醇，以不崩解沉淀的方式静静振荡，随后去除上 清。重复4次该操作后，在60μl的100％乙醇中混悬金粒子。将混悬液 10μl在微载体的中心涂开约1cm，使其十分干燥，然后，使用基因枪进 行向植物的导入。在使用了基因枪的接种试验中，将刚扎根后的苹果的种 子4～6个体作为1个试验区，进行供试。用手术刀去除种皮，在培养皿 排列为同心圆状，在其子叶上，以氦压1100psi的条件使用Biolistic PDS-1000/He Particle Delively System(Bio-Rad)，对每1个试验区进行4 次射击。
(6)基因枪接种(Helios Gene Gun System(Bio-Rad))
微载体(RNA；3μg/金粒子；0.4mg/shot)的制备如以下的顺序进行。 首先，在1.5ml离心管中量取金粒子(1.0μm)7.2mg，加入灭菌水100μl 利用涡旋振荡器进行充分地混和。在超声波清洗机中加入试管，进行5 分钟超声破裂。在涡旋振荡器中安装试管，一边搅拌一边慢加54μl的RNA 溶液(1μg/μl)。同样地，缓慢加入5M乙酸铵15.4μl，接着缓慢加入异 丙醇338.8μl。搅拌一段时间后，以-20℃进行1小时以上静置。去除上清 利用涡旋振荡器对金粒子的沉淀进行一瞬间搅拌。在金粒子的沉淀中加入 1ml的100％乙醇，以沉淀不崩坏的方式慢慢振荡，随后去除上清。将该 操作重复4次后，在1080μl的100％乙醇中使金粒子混悬，在涂金管的制 备中使用。在制管装置(Tubing Prep Station)(BIO-RAD)中安装涂金管 (BIO-RAD)，通20分钟纯氮气，使涂金管的内部完全干燥。接着，将 金粒子的混悬液均匀地填充于涂金管内，放置5分钟，使金粒子在涂金管 中沉降后，将上清的99.5％乙醇从涂金管内去除。接着使制管装置旋转， 一边使金粒子在涂金管内部均匀扩散，一边向涂金管内通入纯氮气，使金 粒子完全干燥。接着，将涂金管使用切管器(BIO-RAD)裁断为18个， 使用基因枪进行向植物的导入。用手术刀去除刚扎根后的苹果种子的种 皮，对其子叶进行接种。接种在氦压220psi条件下使用Helios Gene Gun System(Bio-Rad)，对每一个体进行4次射击。
(7)接种个体的培养
接种个体在保持湿度，遮光条件下静置2～3日后，慢慢适应外部空 气后，移植于培养土中，在培养室(25℃，明期16小时-暗期8小时)进 行培养。
(8)花粉发芽试验
在含蔗糖17％的1％琼脂培养基上散布花粉，在培养室中进行12小 时以上静置后，对于一朵花在光学显微镜下观察120粒以上花粉，求出花 粉管伸长的花粉的比例，从而求出花粉的发芽率。
2.结果
用基因枪法将从浓缩FT-ALSV中提取的RNA接种于刚扎根后的苹 果实生株的子叶中，由此，在接种的20个体中，有20个个体可以确认 FT-ALSV的全身感染。由此可知，通过使用本法，能以非常高的效率使 苹果被ALSV载体感染。另外，确认FT-ALSV的感染的20个体中8个 体中，在接种后从1.5个月至3个月期间，如图1所示可以确认开花。从 开花的各个体采取花粉进行发芽试验，结果发现，任意个体的花粉都有发 芽能力，在比例高的样品中，如图2所示，发芽率近于80％。即可以认 为，通过利用FT-ALSV，可以将通常需要6年至12年的苹果的开花的时 间大幅短缩，而且可以将通过FT-ALSV感染而早期开花的苹果用于花粉 亲本。
【产业上的利用可能性】
如以上详细说明，通过本申请发明，苹果、梨等蔷薇科果树的开花周 期得以大幅加速。这对于苹果、梨等蔷薇科果树的品种改良大有益处。