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1、(10)授权公告号 CN 103431128 B (45)授权公告日 2014.09.24 CN 103431128 B (21)申请号 201310336267.3 (22)申请日 2013.08.05 A23F 3/36(2006.01) (73)专利权人 福建师范大学 地址 350007 福建省福州市仓山区上三路 8 号 (72)发明人 郑永标 黄建忠 林琳 (74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 代理人 林文弘 蔡学俊 (54) 发明名称 一种利用古尼拟青霉生物转化茶咖啡因的方 法 (57) 摘要 本发明涉及食品与饮料营养领域， 具体是一 种利用古尼拟青霉生物。
2、转化茶咖啡因的方法， 其 特征在于 ： 以古尼拟青霉为出发菌株， 采用茶叶、 麸皮、 葡萄糖、 碳酸钙、 水组成发酵培养基， 生物转 化茶咖啡因。 本发明方法以茶叶为主要培养基质， 将茶叶中咖啡因部分转化为茶碱和 1,7 二甲基黄 嘌呤， 丰富了茶叶中的生理活性物质， 可开发茶饮 料新品种。 方法简单， 原料易得， 成本低， 适合大面 积推广， 绿色环保。 (51)Int.Cl. 审查员 周俊清 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 (10)授权公告号 CN 103431128 B CN 。
3、103431128 B 1/1 页 2 1. 一种利用古尼拟青霉生物转化茶咖啡因的方法， 其特征在于 ： 以古尼拟青霉为出发 菌株， 采用茶叶、 麸皮、 葡萄糖、 碳酸钙、 水组成发酵培养基， 生物转化茶咖啡因， 包括以下步 骤 ： （1） 菌种活化 ： 采用古尼拟青霉为出发菌株， 将其划线接种于试管斜面 , 培养成熟， 准 备移种 ； （2） 种子液制备 ： 直接挑取活化后的菌体， 接种于装有150 mL马铃薯葡萄糖培养液的三 角瓶中， 摇瓶培养， 制备古尼拟青霉种子液 ； （3） 生物转化过程 ： 将古尼拟青霉种子液添加到灭菌后的发酵培养基中， 在古尼拟青霉 生长发酵作用下， 茶叶中的咖啡。
4、因部分转化为茶碱和 1,7 二甲基黄嘌呤 ； 所述古尼拟青霉种子液以质量百分比 5% 的接种量， 接入发酵培养基中， 在 25-28 下 恒温培养 20-50d, 自然 pH 值 ； 所述发酵培养基干物质的组成为茶叶 65 85%、 麸皮占 10-35%、 葡萄糖 2 10%、 碳酸 钙 1 5%， 所述水与干物质比重为 100:（55-75） 。 2. 根据权利要求 1 中的一种利用古尼拟青霉生物转化茶咖啡因的方法， 其特征在于 ： 步骤 （3） 所述的灭菌为 121 下， 高压灭菌 30-60min。 权 利 要 求 书 CN 103431128 B 2 1/5 页 3 一种利用古尼拟青霉。
5、生物转化茶咖啡因的方法 技术领域 0001 本发明属于食品与饮料营养领域， 具体涉及一种茶咖啡因生物转化方法。 背景技术 0002 生物碱是一类含氮杂环的碱性天然有机物， 广泛存在于植物体内， 大多数具有重 要的医疗价值。 咖啡因、 茶碱、 1,7二甲基黄嘌呤和可可碱是黄嘌呤甲基衍生物， 它们的母体 结构相同， 只是甲基取代基的数目和位置不同。这些天然甲基黄嘌呤类生物碱具有兴奋中 枢神经系统、 心脏和骨骼肌， 舒张血管， 松弛平滑肌和利尿等生理作用， 普遍存在于茶叶、 咖 啡、 可可、 糖果等各种食品当中。其制品近年来在食品工业中更是得到了日益广泛的应用， 但过量摄入以上四种物质均会产生一定的。
6、毒副作用。乌龙茶等茶叶中咖啡因含量极高， 而 其它黄嘌呤甲基衍生物含量极少， 或没有。 随着生活水平的提高， 人们越来越追求健康的生 活方式， 由于咖啡因对特殊人群 ( 如孕妇、 儿童、 老年人和心脏病、 失眠症、 神经衰弱者 ) 有 一定的危害， 近年来国外市场已有很多低咖啡因或脱咖啡因茶饮料， 让这类人群既能享受 到饮茶的乐趣， 又尽可能减少咖啡因对健康带来的不利影响。 因此， 脱咖啡因技术日益受到 国内外科研人员的重视。 0003 目前， 主要采用直接法去除咖啡因， 即通过有机溶剂萃取、 水浸提和超临界 2 处理等方法。有机溶剂法会改变茶叶的色、 香、 味、 形， 尤其是不可避免地存在有。
7、机溶剂残 留， 对人体健康构成危害。水浸提法咖啡因脱除率较低， 而且茶叶风味受到较大损失。超临 界二氧化碳处理法脱除咖啡因的同时， 也脱除了茶中的芳香和风味物质， 使得所生产的脱 咖啡因茶的品质明显下降， 且过程复杂， 设备成本较高。 国外对微生物降解咖啡因的研究发 现， 细菌类的假单胞菌 (Pseudomonas) 和沙雷氏菌属 (Serratia genus) 以及真菌类的青霉 菌(Penicillium sp)， 曲霉菌(Aspergillus sp)降解咖啡因的效果较好。 Ramarethinam 等人在茶树叶表面喷洒苔状细菌 (Bacillus licheniformis) 悬浮液可。
8、以有效降低茶鲜叶 的咖啡因含量而不影响茶鲜叶其他有效成分的质量。目前， 微生物降解咖啡因的研究还没 有实用性进展， 于是研制一种利用微生物降解茶叶中咖啡因的方法具有十分重要的意义。 发明内容 0004 基于上述现有技术的不足， 本发明的目的在于提供一种利用古尼拟青霉 （Paecilomyces gunnii） 生物转化茶叶中咖啡因的方法。 0005 本发明采取的技术方案如下 ： 0006 一种利用古尼拟青霉生物转化茶咖啡因的方法， 其特征在于 ： 以古尼拟青霉为出 发菌株， 采用茶叶、 麸皮、 葡萄糖、 碳酸钙、 水组成发酵培养基， 生物转化茶咖啡因， 包括以下 步骤 ： 0007 （1） 菌。
9、种活化 ： 采用古尼拟青霉为出发菌株， 将其划线接种于试管斜面 , 培养成 熟， 准备移种 ； 0008 （2） 种子液制备 ： 直接挑取活化后的菌体， 接种于装有150 mL马铃薯葡萄糖培养液 说 明 书 CN 103431128 B 3 2/5 页 4 的三角瓶中， 摇瓶培养， 制备古尼拟青霉种子液 ； 0009 （3） 生物转化过程 ： 将古尼拟青霉种子液添加到灭菌后的发酵培养基中， 在古尼拟 青霉生长发酵作用下， 茶叶中的咖啡因部分转化为茶碱和 1,7 二甲基黄嘌呤 ； 0010 所述古尼拟青霉种子液以质量百分比 5% 的接种量， 接入发酵培养基中， 在 25-28 下恒温培养 20-。
10、50d, 自然 pH 值。 0011 所述发酵培养基干物质的组成为茶叶 60 85%、 麸皮占 10-35%、 葡萄糖 2 10%、 碳酸钙 1 5%， 所述水与干物质比重为 100:（55-75） 。 0012 所述的灭菌为 121 下， 高压灭菌 30-60min。 0013 本发明利用古尼拟青霉生物转化茶咖啡因的方法与现有技术相比， 所产生的有益 效果是 ： 0014 本发明利用古尼拟青霉生物转化茶咖啡因， 不仅降低了茶叶中咖啡因的含量， 也 丰富了茶叶中生理活性物质种类。目前， 主要采用直接法去除咖啡因， 即通过有机溶剂萃 取、 水浸提和超临界 2处理等方法。这些方法有无法避免的缺陷，。
11、 如有机溶剂残留， 过 程复杂， 设备成本较高等。本发明利用古尼拟青霉生物转化茶咖啡因的方法， 易于掌握、 简 单实用、 绿色环保， 适用于规模化的生产， 也适用于食品行业。对比于现有技术中的降低咖 啡因的做法， 本发明方法的优点在于生物转化所具有的的高效性、 安全性与经济性等。 通过 试验证明， 在古尼拟青霉固体发酵作用下， 可以改善茶叶中的生理活性物质种类， 减少咖啡 因在茶叶中的含量， 使其部分转化为茶碱和 1,7 二甲基黄嘌呤。 附图说明 0015 附图 1 为咖啡因的化学分子结构式。 0016 附图 2 为 1,7 二甲基黄嘌呤的晶体结构。 0017 附图 3 为茶碱的晶体结构。 0。
12、018 附图 4 为古尼拟青霉固体发酵茶咖啡因生物转化的 TLC 分析。其中字母 C 代表咖 啡因， 字母 P 代表 1,7 二甲基黄嘌呤， 字母 T 代表茶碱。1 为古尼拟青霉固体发酵茶提取物 的 TLC 展开图谱， 2、 3、 4、 5 依次分别为茶、 菌茶培养基、 古尼拟青霉接种液的菌茶培养基及 古尼拟青霉液体发酵液与菌丝体混合物的提取物的 TLC 展开图谱， 用碘化铋钾试剂显色结 果表明， 茶的咖啡因 （C） 经古尼拟青霉固体发酵后， 一部分咖啡因转化为茶碱 （T） 和 1,7 二 甲基黄嘌呤 （P） 。 0019 附图5为古尼拟青霉固体发酵茶咖啡因生物转化的HPLC分析。 其中字母C。
13、代表咖 啡因， 字母 P 代表 1,7 二甲基黄嘌呤， 字母 T 代表茶碱。1 表示 3 种生物碱的 HPLC 图谱， 咖 啡因、 1,7 二甲基黄嘌呤和茶碱保留时间分别为 21.307min、 12.992 min 和 11.408 min ； 2 4 依次为古尼拟青霉液体发酵液与菌丝体混合物、 茶培养基质及古尼拟青霉固体发酵茶提 取物的 HPLC 图谱。HPLC 分析表明， 茶咖啡因 （C） 经古尼拟青霉发酵后， 转化为茶碱 （T） 和 1,7 二甲基黄嘌呤 （P） 。 具体实施方式 0020 下面结合实施例， 进一步阐述本发明。这些实施举例仅用于说明本发明而不用于 限制本发明的范围。 说。
14、 明 书 CN 103431128 B 4 3/5 页 5 0021 实施例 1 0022 一种利用古尼拟青霉生物转化茶咖啡因的方法， 其特征在于 ： 以古尼拟青霉为出 发菌株， 采用红茶茶叶、 麸皮、 葡萄糖、 碳酸钙、 水组成发酵培养基， 生物转化茶咖啡因， 包括 以下步骤 ： 0023 （1） 菌种活化 ： 采用古尼拟青霉为出发菌株， 将其划线接种于试管斜面 , 培养成 熟， 准备移种 ； 0024 （2） 种子液制备 ： 直接挑取活化后的菌体， 接种于装有150 mL马铃薯葡萄糖培养液 的三角瓶中， 摇瓶培养， 制备古尼拟青霉种子液 ； 0025 （3） 生物转化过程 ： 将古尼拟青霉。
15、种子液添加到灭菌后的发酵培养基中， 在古尼拟 青霉生长发酵作用下， 茶叶中的咖啡因部分转化为茶碱和 1,7 二甲基黄嘌呤 ； 0026 所述古尼拟青霉种子液以质量百分比 5% 的接种量， 接入发酵培养基中， 在 25下 恒温培养 50d, 自然 pH 值。 0027 所述发酵培养基干物质的组成为红茶茶叶60g、 麸皮占10g、 葡萄糖2g、 碳酸钙1g， 所述水与干物质比重为 100:55。 0028 所述的灭菌为 121 下， 高压灭菌 30min。 0029 实施例 2 0030 一种利用古尼拟青霉生物转化茶咖啡因的方法， 其特征在于 ： 以古尼拟青霉为出 发菌株， 采用绿茶茶叶、 麸皮、。
16、 葡萄糖、 碳酸钙、 水组成发酵培养基， 生物转化茶咖啡因， 包括 以下步骤 ： 0031 （1） 菌种活化 ： 采用古尼拟青霉为出发菌株， 将其划线接种于试管斜面 , 培养成 熟， 准备移种 ； 0032 （2） 种子液制备 ： 直接挑取活化后的菌体， 接种于装有150 mL马铃薯葡萄糖培养液 的三角瓶中， 摇瓶培养， 制备古尼拟青霉种子液 ； 0033 （3） 生物转化过程 ： 将古尼拟青霉种子液添加到灭菌后的发酵培养基中， 在古尼拟 青霉生长发酵作用下， 茶叶中的咖啡因部分转化为茶碱和 1,7 二甲基黄嘌呤 ； 0034 所述古尼拟青霉种子液以质量百分比5%的接种量， 接入发酵培养基中，。
17、 在26 下 恒温培养 35d, 自然 pH 值。 0035 所述发酵培养基干物质的组成为绿茶茶叶70g、 麸皮占25g、 葡萄糖6g、 碳酸钙3g， 所述水与干物质比重为 100:60。 0036 所述的灭菌为 121 下， 高压灭菌 45min。 0037 实施例 3 0038 一种利用古尼拟青霉生物转化茶咖啡因的方法， 其特征在于 ： 以古尼拟青霉为出 发菌株， 采用红茶茶叶、 麸皮、 葡萄糖、 碳酸钙、 水组成发酵培养基， 生物转化茶咖啡因， 包括 以下步骤 ： 0039 （1） 菌种活化 ： 采用古尼拟青霉为出发菌株， 将其划线接种于试管斜面 , 培养成 熟， 准备移种 ； 0040。
18、 （2） 种子液制备 ： 直接挑取活化后的菌体， 接种于装有150 mL马铃薯葡萄糖培养液 的三角瓶中， 摇瓶培养， 制备古尼拟青霉种子液 ； 0041 （3） 生物转化过程 ： 将古尼拟青霉种子液添加到灭菌后的发酵培养基中， 在古尼拟 说 明 书 CN 103431128 B 5 4/5 页 6 青霉生长发酵作用下， 茶叶中的咖啡因部分转化为茶碱和 1,7 二甲基黄嘌呤 ； 0042 所述古尼拟青霉种子液以质量百分比5%的接种量， 接入发酵培养基中， 在28 下 恒温培养 50d, 自然 pH 值。 0043 所述发酵培养基干物质的组成为红茶茶叶 85g、 麸皮占 35g、 葡萄糖 10g、。
19、 碳酸钙 5g， 所述水与干物质比重为 100:75。 0044 所述的灭菌为 121 下， 高压灭菌 60min。 0045 实施例 4 0046 一种利用古尼拟青霉生物转化茶咖啡因的方法， 其特征在于 ： 以古尼拟青霉为出 发菌株， 采用乌龙茶茶叶、 麸皮、 葡萄糖、 碳酸钙、 水组成发酵培养基， 生物转化茶咖啡因， 包 括以下步骤 ： 0047 （1） 菌种活化 ： 采用古尼拟青霉为出发菌株， 将其划线接种于试管斜面 , 培养成 熟， 准备移种 ； 0048 （2） 种子液制备 ： 直接挑取活化后的菌体， 接种于装有150 mL马铃薯葡萄糖培养液 的三角瓶中， 摇瓶培养， 制备古尼拟青霉。
20、种子液 ； 0049 （3） 生物转化过程 ： 将古尼拟青霉种子液添加到灭菌后的发酵培养基中， 在古尼拟 青霉生长发酵作用下， 茶叶中的咖啡因部分转化为茶碱和 1,7 二甲基黄嘌呤 ； 0050 所述古尼拟青霉种子液以质量百分比5%的接种量， 接入发酵培养基中， 在28 下 恒温培养 50d, 自然 pH 值。 0051 所述发酵培养基干物质的组成为乌龙茶茶叶 250g、 麸皮占 100g、 葡萄糖 20g、 碳酸 钙 5g， 所述水与干物质比重为 100:75。 0052 所述的灭菌为 121 下， 高压灭菌 60min。 0053 实验 1 茶叶中生物转化前后咖啡因定量对比的实验 0054。
21、 1） 以茶叶为主要培养基质的古尼拟青霉固体发酵 0055 以实施例 4 展开说明， 配制茶基质固体培养基 （配方 ： 250g 乌龙茶、 100g 麸皮、 20g 葡萄糖和 5g 碳酸钙） ， 加水混匀， 分装于 250mL 的三角瓶， 取其中一瓶接种 5mL 已活化好的 古尼拟青霉菌液作为对照， 也在 121 下灭菌 30min。培养基冷却后， 接种 5mL 已活化好的 古尼拟青霉菌液， 于 25 的恒温培养箱中静置培养 35d。 0056 2） 古尼拟青霉固体发酵茶有机粗提物的制备 0057 将静置培养好的古尼拟青霉固体发酵茶取出， 于 50下烘干、 称取 200g， 加入甲 醇浸泡三次。
22、， 获得粗提物 12.12g， 先将粗提物用乙酸乙酯 : 水 （1:1） 萃取后， 往水相中加入 等体积的正丁醇， 正丁醇相用旋转蒸发仪浓缩蒸干， 获得正丁醇提取物 2.53g。 0058 3） 古尼拟青霉固体发酵茶中的咖啡因、 茶碱和 1,7 二甲基黄嘌呤的分离 0059 取 2） 所述的古尼拟青霉固体发酵茶正丁醇相粗提物 1.5g， 用适量甲醇溶解后经 凝胶柱 （120g） 层析， 甲醇洗脱， 流速约为 15-20s/drop， 每管收集 3mL， 后经 TLC 检测分析后 合并得到组分 GN1 (181.4mg) 和 GN2（52.7mg） 。 0060 GN1 经适量甲醇充分溶解后， 。
23、用反相硅胶 （30g） 柱层析， 10%、 20%、 30%、 100% 的甲 醇分别各洗脱 500mL， 流速控制为 12 mL/min， 后经 TLC 检测后， 在 10% 甲醇洗脱出来的组分 GN1.1（112.4mg） 。GN1.1（112.5mg） 13mg， 经正相硅胶 （0.6g） 柱层析， 氯仿 - 甲醇 （100:1） 洗脱 200mL， 每试管大约收集 10mL， 得到的 GN.1.1.1（11.3mg） 。GN1.1.1（11.3mg） 用适量 说 明 书 CN 103431128 B 6 5/5 页 7 甲醇充分溶解后， 经凝胶柱层析甲醇洗脱， 流速约为 15-20s/。
24、drop， 每管收集 3mL， 经 TLC 检 测分析后得到纯化合物 JCN-1（9.3mg） ， 经核磁共振波谱测定， 化合物 JCN-1 的 1H NMR(500 MHz， CD3OD) ： 7.86 (s, 1H, H-8), 3.34(s, N1-CH3), 3.52 (s,1H, N3-CH3), 3.98 (s,1H, N7-CH3)， 化合物JCN-1的 13C NMR(500 MHz, CD 3OD) ： (149.8,C-2), (153.2, C-4), (108.7,C-5), (156.7, C-6), (140.2,C-5), (144.0,C-6), (30.1,N。
25、1-CH3), (33.9, N3-CH3), (28.2, N7-CH3)， 经与文献比较将化合物 JCN-1 确定为咖啡因， 如图 1 所示。 0061 GN2 经适量甲醇充分溶解后， 用反相硅胶 （30g） 柱层析， 30%、 50%、 70%、 100% 的甲醇 分别各洗脱500mL， 流速控制为12mL/min， 经TLC检测后， 在30%甲醇洗脱出来的组分GN2.1 （39.3mg） 。GN2.1（39.3mg） 27mg， 经正相硅胶 （0.7g）柱层析， 石油醚 - 丙酮 （5:1）洗脱 500mL， 每试管大约收集10mL， 经TLC检测分析， 合并得到组分GN2.1.1和G。
26、N2.1.2。 GN2.1.1 经反相硅胶 （10g） 柱层析， 10%甲醇洗脱500mL， 流速控制为12 mL/min， 经TLC检测分析得纯 化合物 JCN-2.1 （2.3mg） ， 经晶体衍射分析鉴定， 化合物 JCN-2.1 为 1,7 二甲基黄嘌呤， 如图 2 所示。GN.2.1.2 经反相硅胶 （30g） 柱层析， 10% 甲醇洗脱 500mL， 流速控制为 12mL/min， 经 TLC 检测分析获得纯化合物 JCN-2.2 （17.1mg） ， 经晶体衍射分析鉴定， 化合物 JCN-2.2 为茶 碱， 如图 3 所示。 0062 4） 古尼拟青霉固体发酵茶咖啡因生物转化的 。
27、TLC 分析 0063 取培养所用的茶 20g、 高压灭活的菌茶培养基 20g、 高压灭活含有古尼拟青霉接种 液的菌茶培养基 20g 及古尼拟青霉液体发酵液与菌丝体混合物 （用 40旋转蒸发仪蒸干） ， 按照 2） 所述的方法制备这 4 种提取物作为对照。将古尼拟青霉固体发酵茶提取物与 4 种 提取物一起作 TLC 分析， 用氯仿 ： 甲醇 （10:1） 为展开剂， 碘化铋钾试剂 （2 mL 的 0.6 mol/L HCl 溶液中加入碘化铋钾 1g， 再加水至 10 mL， 摇匀） 为显色剂， 使用时将薄层板浸于碘化铋 钾试剂溶液中， 水冲洗后观察。结果如图 4 所示， 茶的咖啡因经古尼拟青霉。
28、固体发酵后， 一 部分咖啡因转化为茶碱和 1,7 二甲基黄嘌呤， 丰富了茶叶中生物碱种类， 平衡优化了茶叶 中各生物碱的含量。 0064 同样的， 对实施例 1、 2 和 3 也做了相应实验， 实验结果与实施例 4 的实验结果无明 显差别， 故在此不作复述。 0065 5） 古尼拟青霉固体发酵茶咖啡因生物转化的 HPLC 分析 0066 将菌茶分离到的3个化合物咖啡因、 茶碱和1,7二甲基黄嘌呤分别配成1 mg/mL甲 醇溶液。将 4） 所述的茶、 高压灭活的菌茶培养基、 高压灭活含有古尼拟青霉接种液的菌茶 培养基及古尼拟青霉液体发酵液与菌丝体混合物的 4 种提取物， 分别用甲醇配成 10mg。
29、/mL， 用 0.2 um 有机滤膜过滤后， 进行 HPLC 分析， 用含有 0.1% 甲酸的 20% 甲醇为洗脱剂， 流速为 1 mL/min， 紫外吸收值为 270 nm。化合物咖啡因、 茶碱和 1,7 二甲基黄嘌呤的保留时间分别 为 21.307min、 12.992 min 和 11.408 min。HPLC 分析表明如图 5 所示， 茶咖啡因经古尼拟青 霉发酵后， 转化为茶碱和 1,7 二甲基黄嘌呤。 0067 同样的， 对实施例 1、 2 和 3 也做了相应实验， 实验结果与实施例 4 的实验结果无明 显差别， 故在此不作复述。 说 明 书 CN 103431128 B 7 1/2 页 8 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103431128 B 8 2/2 页 9 图 5 说 明 书 附 图 CN 103431128 B 9 。