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1、(10)申请公布号 CN 102524063 A (43)申请公布日 2012.07.04 CN 102524063 A *CN102524063A* (21)申请号 201110426501.2 (22)申请日 2011.12.19 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人 普罗米绿色能源 （深圳） 有限公司 地址 518000 广东省深圳市南山区高新科技 园朗山路 16 号华瀚创新园 C601 (72)发明人 孙长斌 郭棣 江淑珍 陈方 孟丽娜 张兰英 (74)专利代理机构 深圳市维邦知识产权事务所 44269 代理人 黄莉 (54) 发明名称 高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的。
2、方法 (57) 摘要 本发明涉及一种高效诱导桉树离体茎段不定 芽再生的方法， 包括 ： 培养无菌外植体步骤， 对桉 树杂交品种的带腋芽茎段依次进行消毒子步骤、 腋芽萌发培养子步骤、 丛生芽培养子步骤、 生根苗 培养子步骤及白化苗培养子步骤， 获得白化苗作 为无菌外植体 ； 愈伤组织的诱导步骤， 将无菌外 植体切段后接种到 B5 培养基上进行愈伤诱导， 先 暗培养再弱光照培养， 形成愈伤组织 ； 芽诱导培 养分化不定芽步骤， 将愈伤组织转移到芽诱导分 化培养基上培养， 每隔 14-25 天转移到成分相同 的芽诱导分化培养基上继代培养， 使愈伤组织分 化不定芽。本发明以桉树白化苗茎段为无菌外植 体。
3、， 经愈伤组织诱导和芽诱导分化出不定芽， 可用 于 DH32-29 及其它优良杂交种无性系， 高效稳定， 再生效率高于 70%。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 1/1 页 2 1. 一种高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法， 其特征在于， 包括如下步骤 ： 培养无菌外植体步骤， 以 2-4 年生桉树杂交品种的带腋芽茎段为培养原材料， 依次进 行消毒子步骤、 腋芽萌发培养子步骤、 丛生芽培养子步骤、 生根苗培养子步骤及白化苗培养 子步骤， 获得白化苗作为无菌外植体 ； 愈。
4、伤组织的诱导步骤， 将无菌外植体切段成合适的长度， 接种到含 0.05-2.0mg/L N-(2-氯-4-吡啶基)-N-苯基脲、 0.01-0.1mg/L萘乙酸、 10-500mg/L腐胺和1-50mg/L亚精 胺的 B5 培养基上进行愈伤诱导， 先暗培养 5-15 天， 再弱光照培养 5-20 天， 形成愈伤组织 ； 芽诱导培养分化不定芽步骤， 将愈伤组织转移到芽诱导分化培养基上培养， 且每隔 14-25 天转移到成分相同的芽诱导分化培养基上继代培养 14-100 天， 使愈伤组织分化不定 芽， 所述芽诱导分化培养基是含有 10-40mg/L 腐胺， 0.5-3.0mg/L 亚精胺的 B5 。
5、培养基。 2. 根据权利要求 1 所述的高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法， 其特征在于 ： 培 养无菌外植体步骤中， 所述消毒处理是采用酒精和升汞对培养原材料进行泡洗消毒， 并用 无菌水冲洗。 3. 根据权利要求 1 所述的高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法， 其特征在于 ： 腋 芽萌发培养子步骤中， 采用的培养基是 MS 培养基， 培养条件是 ： 温度 22-30， 无光照。 4. 根据权利要求 1 所述的高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法， 其特征在于 ： 丛 生芽培养子步骤中， 采用的培养基是含0.1-2.0mg/L细胞分裂素和0.01-1.0mg/L生长素的 MS 培养基， 培。
6、养条件是 ： 诱导培养 21-28 天， 光照 12-18 小时 / 天， 光照强度 1500-10000lx， 温度 22-30。 5. 根据权利要求 1 所述的高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法， 其特征在于 ： 生 根苗培养子步骤中， 采用的培养基是含0.1-1.0mg/L生长素的1/2MS培养基， 生根诱导培养 的条件是， 诱导培养15-30天， 光照12-18小时/天， 光照强度1500-10000lx， 温度22-30。 6. 根据权利要求 5 所述的高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法， 其特征在于 ： 所 述生长素为 3- 吲哚丁酸。 7. 根据权利要求 1 所述的高效诱导桉。
7、树离体茎段不定芽再生的方法， 其特征在于 ： 白 化苗培养子步骤中， 采用的培养基是含蔗糖 30-100g/L 的 B5 培养基， 培养条件是 ： 暗培养 14-35 天， 温度 22-30。 8. 根据权利要求 1 所述的高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法， 其特征在于 ： 愈 伤组织的诱导步骤中， 外植体的切段长度为2-10mm， 培养时温度22-30； 弱光照培养时， 光 照 12-18 小时 / 天， 光照强度 20-200lx， 22-30。 9. 根据权利要求 1 所述的高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法， 其特征在于 ： 芽诱导培养分化不定芽步骤中， 所述芽诱导分化培养基还含。
8、有 0.2-2.0mg/L 细胞分裂素， 0.05-0.5mg/L 生长素， 培养条件是 ： 光照 12-18 小时 / 天， 光照强度 500-3000lx， 温度 22-30。 10. 根据权利要求 4 或 9 所述的高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法， 其特征在 于 ： 所述细胞分裂素为 6- 苄基嘌呤， 所述生长素为萘乙酸。 权 利 要 求 书 CN 102524063 A 2 1/5 页 3 高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法 技术领域 0001 本发明涉及生物组织培养育苗技术领域， 尤其涉及一种高效诱导桉树离体茎段不 定芽再生的方法。 背景技术 0002 桉树是桃金娘科 （My。
9、rtaceae） 桉属 （Eucalyptus） 植物的统称。广泛分布于亚洲、 南美洲和欧洲的一些地区， 全球种植面积达二千万多公顷。桉树品种多， 包括杂交品种有 700 多种， 在这些品种当中有些品种具有重要的经济价值， 如可作为纸浆、 木材、 纤维板材以 及提取单宁和精油等原材料。 桉树具有速生， 丰产， 适应性强， 生产周期短， 收获后多发芽再 生等优点。目前已被多个国家和地区广泛种植。桉树人工林面具约占世界人工林总面积的 三分之一。因此桉树具有广泛的开发利用价值。 0003 由于林木生长周期长， 遗传杂合性高， 许多性状属于多基因控制的数量性状， 传统 的常规育种手段难以满足定向培育桉。
10、树新品种的要求。 因此人们希望利用新兴的基因工程 技术来解决桉树常规育种难以解决的问题， 定向地培育出经济价值高的性状。基因工程育 种是以现代分子生物学技术为基础， 将目的基因通过体外重组导入受体细胞， 然后再生出 完整植株以培育出新品种的一种技术手段。它具有高效性和针对性， 可弥补常规育种技术 的不足， 可以加速优质、 高产、 抗逆性强等桉树新品种的选育。 0004 目前， 桉树再生率低， 实验材料主要以种子为基础， 变异较大， 很大程度上制约了 桉树转基因技术的进展， 完善的植物转化受体系统依赖于高效稳定的再生能力和稳定的外 植体来源。对于广泛栽培的 DH32-29 等杂交优良无性系， 实。
11、现转基因育种， 筛选出优良的转 基因株系， 寻求高效稳定的再生率成为急需解决的技术难题。 发明内容 0005 本发明实施例所要解决的技术问题在于， 提供一种高效诱导桉树离体茎段不定芽 再生的方法， 以便快速、 高效、 稳定地繁殖并选育优良品种。 0006 为解决上述技术问题， 本发明提供如下技术方案 ： 一种高效诱导桉树离体茎段不 定芽再生的方法， 包括如下步骤 ： 培养无菌外植体步骤， 以 2-4 年生桉树杂交品种的带腋芽茎段为培养原材料， 依次进 行消毒子步骤、 腋芽萌发培养子步骤、 丛生芽培养子步骤、 生根苗培养子步骤及白化苗培养 子步骤， 获得白化苗作为无菌外植体 ； 愈伤组织的诱导步。
12、骤， 将无菌外植体切段成合适的长度， 接种到含 0.05-2.0mg/L N-(2-氯-4-吡啶基)-N-苯基脲、 0.01-0.1mg/L萘乙酸、 10-500mg/L腐胺和1-50mg/L亚精 胺的 B5 培养基上进行愈伤诱导， 先暗培养 5-15 天， 再弱光照培养 5-20 天， 形成愈伤组织 ； 芽诱导培养分化不定芽步骤， 将愈伤组织转移到芽诱导分化培养基上培养， 且每隔 14-25 天转移到成分相同的芽诱导分化培养基上继代培养 14-100 天， 使愈伤组织分化不定 芽， 所述芽诱导分化培养基是含有 10-40mg/L 腐胺， 0.5-3.0mg/L 亚精胺的 B5 培养基。 说 。
13、明 书 CN 102524063 A 3 2/5 页 4 0007 进一步地， 培养无菌外植体步骤中， 所述消毒处理是采用酒精和升汞对培养原材 料进行泡洗消毒， 并用无菌水冲洗。 0008 进一步地， 腋芽萌发培养子步骤中， 采用的培养基是 MS 培养基， 培养条件是 ： 温度 22-30， 无光照。 0009 进一步地， 丛生芽培养子步骤中， 采用的培养基是含 0.1-2.0mg/L 细胞分裂素和 0.01-1.0mg/L 生长素的 MS 培养基， 培养条件是 ： 诱导培养 21-28 天， 光照 12-18 小时 / 天， 光照强度 1500-10000lx， 温度 22-30。 0010。
14、 进一步地， 生根苗培养子步骤中， 采用的培养基是含 0.1-1.0mg/L 生长素的 1/2MS 培养基， 生根诱导培养的条件是， 诱导培养 15-30 天， 光照 12-18 小时 / 天， 光照强度 1500-10000lx， 温度 22-30。 0011 进一步地， 白化苗培养子步骤中， 采用的培养基是含蔗糖30-100g/L的B5培养基， 培养条件是 ： 暗培养 14-35 天， 温度 22-30。 0012 进一步地， 愈伤组织的诱导步骤中， 外植体的切段长度为 2-10mm， 培养时温度 22-30 ； 弱光照培养时， 光照 12-18 小时 / 天， 光照强度 20-200lx。
15、， 22-30。 0013 进一步地， 芽诱导培养分化不定芽步骤中， 所述芽诱导分化培养基还含有 0.2-2.0mg/L细胞分裂素， 0.05-0.5mg/L生长素， 培养条件是 ： 光照12-18小时/天， 光照强 度 500-3000lx， 温度 22-30。 0014 进一步地， 所述丛生芽培养子步骤以及芽诱导培养分化不定芽步骤中， 所述细胞 分裂素为6-苄基嘌呤， 生长素为萘乙酸 ； 而生根苗培养子步骤中使用的生长素为3-吲哚丁 酸。 0015 通过采用上述技术方案， 本发明至少具有如下有益效果 ： 本发明利用桉树白化苗 的茎段为无菌外植体， 经愈伤组织诱导和芽诱导途径诱导出不定芽， 。
16、可以应用于 DH32-29 及其它优良杂交种无性系， 具有高效稳定的特点， 再生效率可达 70% 以上， 为利用现代分子 育种技术对桉树的遗传改良奠定了良好的基础， 可以用于目的基因导入受体细胞等基因工 程， 具有十分重要的经济价值。 具体实施方式 0016 下面结合实例详述描述本发明的实施方案。 需要说明的是， 下述实例是说明性的， 不是限定性的， 不能以下述实例来限定本发明的保护范围。 0017 本发明提供一种高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法， 包括如下步骤 ： S1、 培养无菌外植体步骤， 以 2-4 年生桉树杂交品种的带腋芽茎段为培养原材料， 依次 进行消毒子步骤、 腋芽萌发培养子。
17、步骤、 丛生芽培养子步骤、 生根苗培养子步骤及白化苗培 养子步骤， 获得白化苗作为无菌外植体 ； S2、 愈伤组织的诱导步骤， 将无菌外植体切段成合适的长度， 接种到含 0.05-2.0mg/L N-(2-氯-4-吡啶基)-N-苯基脲、 0.01-0.1mg/L萘乙酸、 10-500mg/L腐胺和1-50mg/L亚精 胺的 B5 培养基上进行愈伤诱导， 先暗培养 5-15 天， 再弱光照培养 5-20 天， 形成愈伤组织 ； S3、 芽诱导培养分化不定芽步骤， 将愈伤组织转移到芽诱导分化培养基上培养， 且每隔 14-25 天转移到成分相同的芽诱导分化培养基上继代培养 14-100 天， 使愈伤。
18、组织分化不定 芽， 所述芽诱导分化培养基是含有 10-40mg/L 腐胺， 0.5-3.0mg/L 亚精胺的 B5 培养基。 说 明 书 CN 102524063 A 4 3/5 页 5 0018 其中， 培养无菌外植体步骤主要包括如下子步骤 ： S1.1、 消毒子步骤， 所述消毒处理是采用酒精和升汞对培养原材料进行泡洗消毒， 并用 无菌水冲洗， 具体可采用如下处理 ： 先以体积百分比 70% 乙醇浸泡 20 秒， 再以无菌水冲洗 2 次 ； 然后， 以质量百分比 0.1% 升汞浸泡 5 分钟， 再倒出升汞， 用无菌水冲洗 4-6 次 ； 然后， 再 修剪成 0.5-1.0cm 长的带腋芽的茎。
19、段， 以质量百分比 0.1% 升汞浸泡 2 分钟， 倒出升汞， 用无 菌水冲洗 4-6 次。由于， 对培养原材料的消毒处理在本领域中已经是相当成熟的技术手段， 本发明可以直接采用本领域中现有的各种有效消毒处理手段， 对于实施效果并不会产生实 质性的影响。 0019 S1.2、 腋芽萌发培养子步骤中， 采用的培养基是 MS 培养基， 培养条件是 ： 温度 22-30， 无光照。 0020 S1.3、 丛生芽培养子步骤中， 采用的培养基是含 0.1-2.0mg/L 细胞分裂素和 0.01-1.0mg/L 生长素的 MS 培养基， 所述细胞分裂素优选为 6- 苄基嘌呤， 生长素优选为萘 乙酸， 培养。
20、条件是 ： 诱导培养 21-28 天， 光照 12-18 小时 / 天， 光照强度 1500-10000lx， 温度 22-30。 0021 S1.4、 生根苗培养子步骤中， 采用的培养基是含0.1-1.0mg/L生长素的1/2MS培养 基， 本子步骤中， 所述生长素为3-吲哚丁酸， 生根诱导培养的条件是， 诱导培养15-30天， 光 照 12-18 小时 / 天， 光照强度 1500-10000lx， 温度 22-30。 0022 S1.5、 白化苗培养子步骤中， 采用的培养基是含蔗糖30-100g/L的B5培养基， 培养 条件是 ： 暗培养 14-35 天， 温度 22-30。 0023 。
21、而在愈伤组织的诱导步骤中， 外植体的切段长度为 2-10mm， 培养时温度 22-30 ； 弱光照培养时， 光照 12-18 小时 / 天， 光照强度 20-200lx， 22-30。 0024 在芽诱导培养分化不定芽步骤中， 所述芽诱导分化培养基还含有 0.2-2.0mg/L 细 胞分裂素， 0.05-0.5mg/L 生长素， 所述细胞分裂素优选为 6- 苄基嘌呤， 生长素优选为萘乙 酸， 培养条件是 ： 光照 12-18 小时 / 天， 光照强度 500-3000lx， 温度 22-30。 0025 本发明主要利用白化苗的茎段为无菌外植体， 经愈伤组织再生途径和芽诱导途径 分化出芽， 其中。
22、， 再生途径包含由分化的体细胞经脱分化形成愈伤组织和芽诱导分化形成 芽。 该再生途径可以用于将目的基因导入受体细胞， 然后再生长出完整植株， 从而可实现对 桉树， 特别是对杂交品种的桉树， 如 DH32-29 及其它优良无性系， 进行定向的遗传改良。 0026 下面结合实例详述描述本发明的实施方案。 需要说明的是， 下述实例是说明性的， 不是限定性的， 不能以下述实例来限定本发明的保护范围。 0027 实例 1 ： 具体实施时， 本实例包括以下步骤 ： 首先， 选取DH32-29三年生植株， 砍掉树冠部分， 保留1-1.5m高的树桩， 1个月后采集新 生的萌芽条， 切成 2.0cm 长的带腋芽。
23、的茎段， 体积百分比 70% 乙醇中浸泡 20 秒， 无菌水冲洗 2 次， 然后在质量百分比 0.1% 氯化汞中消毒 5 分钟， 无菌水冲洗 4 次， 修剪成 1.0cm 长的带 腋芽的茎段， 再于质量百分比 0.1% 氯化汞中消毒 2 分钟， 无菌水冲洗 6 次， 晾干后备用。 0028 其次， 将晾干的带腋芽的茎段接种在 MS 培养基中， 每瓶接 1-2 颗， 25暗培养 28 天， 得到萌发的腋芽。 0029 第三步， 切取 1.0cm 长的腋芽， 转移到含 0.1mg/L 6- 苄基嘌呤， 0.01mg/L 萘乙酸 说 明 书 CN 102524063 A 5 4/5 页 6 的 MS。
24、 培养基上， 每隔 23 天转移到相同的培养基上继代培养， 光照 16 小时 / 天， 光照强度 3000lx， 温度 25。 0030 第四步， 切取生长至 1.5cm 长的芽， 转移到含 0.5mg/L 3- 吲哚丁酸的 1/2MS 培养 基上进行生根诱导 20 天， 光照 16 小时 / 天， 光照强度 3000lx， 温度 25。 0031 第五步， 将生根苗切掉顶芽， 保留根和基部的 2 个腋芽， 接种在含蔗糖 70g/L 的 B5 培养基上进行白化苗诱导培养， 暗培养 23 天， 温度 25， 从而获得白化苗。 0032 第六步， 以白化苗的 3mm 的茎段切段为外植体， 本实例中。
25、共 535 块外植体， 将外植 体接种在含 0.2mg/L N-(2- 氯 -4- 吡啶基 )-N- 苯基脲， 0.02mg/L 萘乙酸， 80mg/L 腐胺， 15mg/L 亚精胺的 B5 培养基上， 暗培养 5 天， 温度 25。 0033 第七步， 转移到弱光照培养 14 天， 光照 16 小时 / 天， 光照强度 50lx， 温度 25， 从 而获得脱分化的愈伤组织共 535 块。 0034 第八步， 将获得的愈伤组织， 转移到含 0.5mg/L 6- 苄基嘌呤， 0.1mg/L 萘乙酸， 15mg/L 腐胺， 1.5mg/L 亚精胺的 B5 培养基上， 每隔 21 天转移到相同的芽诱。
26、导分化培养基上 继代培养， 光照 16 小时 / 天， 光照强度 1500lx， 温度 25。在芽诱导分化培养基上继代培 养 40 天产生不定芽， 共 454 块。 0035 实例 2 ： 具体实施时， 本实例包括以下步骤 ： 首先， 选取 DH32-29 两年生植株， 砍掉树冠部分， 保留 1-1.5m 高的树桩。1 个月后采集 新生的萌芽条， 切成 2.0cm 长的带腋芽的茎段， 体积百分比 70% 乙醇中浸泡 20 秒， 无菌水冲 洗 2 次， 然后在质量百分比 0.1% 氯化汞中消毒 5 分钟， 无菌水冲洗 4 次， 修剪成 1.0cm 长的 带腋芽的茎段， 再于质量百分比 0.1% 。
27、氯化汞中消毒 2 分钟， 无菌水冲洗 6 次， 晾干后备用。 0036 其次， 晾干的带腋芽的茎段接种在 MS 培养基中， 每瓶接 1-2 颗， 25暗培养 28 天， 得到萌发的腋芽。 0037 第三步， 切取 1.0cm 长的腋芽， 转移到含 0.2mg/L 6- 苄基嘌呤， 0.02mg/L 萘乙酸 的 MS 培养基上， 每隔 23 天转移到相同的培养基上继代培养， 光照 16 小时 / 天， 光照强度 3000lx， 温度 25。 0038 第四步， 切取生长至 1.5cm 长的芽， 转移到含 0.5mg/L 3- 吲哚丁酸的 1/2MS 培养 基上进行生根诱导 20 天， 光照 16。
28、 小时 / 天， 光照强度 3000lx， 温度 25。 0039 第五步， 将生根苗切掉顶芽， 保留根和基部的 2 个腋芽， 接种在含蔗糖 50g/L 的 B5 培养基上进行白化苗诱导培养， 暗培养 23 天， 温度 25， 从而获得白化苗。 0040 第六步， 以白化苗的3mm的茎段切段为外植体， 本实例中共63块外植体， 接种在含 0.5mg/L N-(2- 氯 -4- 吡啶基 )-N- 苯基脲， 0.1mg/L 萘乙酸， 100mg/L 腐胺， 30mg/L 亚精胺 的 B5 培养基上， 暗培养 5 天， 温度 25。 0041 第七步， 转移到弱光照培养 14 天， 光照 16 小时。
29、 / 天， 光照强度 50lx， 温度 25， 从 而获得脱分化的愈伤组织共 63 块。 0042 第八步， 将获得的愈伤组织， 转移到含 0.2mg/L 6- 苄基嘌呤， 0.02mg/L 萘乙酸， 15mg/L 腐胺， 1.5mg/L 亚精胺的 B5 培养基上， 每隔 21 天转移到相同的芽诱导培养基上继代 培养， 光照 16 小时 / 天， 光照强度 1500lx， 温度 25， 最后， 在芽诱导培养基上继代培养 40 天产生不定芽， 共 60 块。 说 明 书 CN 102524063 A 6 5/5 页 7 0043 实例 3 ： 结合表 3 所示愈伤组织分化率， 本例中诱导桉树茎段。
30、产生愈伤组织并分化出芽的方 法， 选取广林九号两年生植株， 除愈伤组织诱导培养基中 N-(2- 氯 -4- 吡啶基 )-N- 苯基脲 的含量改为0.4 mg/L之外， 其余各步骤均和实例1相同。 本例中， 白化苗茎段外植体共110 块， 经脱分化形成愈伤组织 110 块， 然后愈伤组织再分化出不定芽， 共 80 块。 0044 以上三个实例中， 愈伤组织的分化效率分别如下表 1 所示 ： 表 1 实例 13 中的愈伤组织分化率 序号外植体总数 （块）愈伤组织数 （块）分化愈伤组织数 （块）再生效率 （%） 实例 1 53553545484.9 实例 2 63636095.2 实例 3 1101108072.7 由上述实例及表 1 的分化率数据可知， 本发明利用白化苗的茎段， 经愈伤组织诱导和 芽诱导， 再生率在70%以上， 具有很好的稳定性， 为能实现对桉树， 特别是DH32-29及其他杂 交品种进行遗传改造奠定了良好的基础。 说 明 书 CN 102524063 A 7 。