发明背景
甲氨蝶呤(methotrexate，也称为“MTX”)作为组合化学疗法方案的 一部分用于治疗多种癌症。它是包括急性淋巴母细胞性白血病在内的 多种赘生性病症的治疗剂。甲氨蝶呤还用作一些自体免疫性疾病的治 疗剂，所述自体免疫性疾病包括重症肌无力、多肌炎、皮肌炎、包涵 体肌炎、强直性脊柱炎、克罗恩氏病(Crohn′sdisease)、牛皮癣、脓疱 性牛皮癣、牛皮癣性关节炎、类风湿性关节炎、韦格纳氏肉芽肿病 (Wegener′sgranulomatosis)和硬皮病。
10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤(包括“10-炔丙基-10-dAM”、“普拉 曲沙(pralatrexate)”、“外消旋PDX”、“(2S)-2-[[4-[(1RS)-1-[(2,4-二氨基 蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲酰基]氨基]戊二酸”、 “(2RS)-2-[[4-[(1RS)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲酰 基]氨基]戊二酸”和“PDX”)是已经过测试并且发现适用于治疗癌症的 化合物。10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤已得到美国食品药物管理局 (U.S.FoodandDrugAdministration，FDA)批准作为复发性和难治性周 围T细胞淋巴瘤的治疗剂。同时还在对10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶 呤在淋巴瘤、肺癌、膀胱癌和乳癌中的使用进行研究。
10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤最初由DeGraw等,″Synthesisand AntitumorActivityof10-Propargyl-10-deazaaminopterin,″J.Med.Chem. 36:2228-2231(1993)公开并且显示可充当酶二氢叶酸还原酶 (“DHFR”)的抑制剂和充当鼠类L1210淋巴细胞性白血病细胞系的生 长抑制剂。另外，使用鼠类E0771乳腺肿瘤模型也得到关于该化合物 的抗肿瘤性质的一些结果。
美国专利号6,028,071和PCT公布号WO1998/02163公开了高度 纯化的10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤组合物在异种移植物模型中进 行测试时具有对抗人肿瘤的功效。利用10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶 呤进行的后续研究已显示其在单独使用和与其它治疗剂组合时都是 有用的。举例来说，Sirotnak等,ClinicalCancerResearch,第6卷, 3705-3712(2000)报道了共同施用10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤与丙 磺舒(probenecid，cMOAT/MRP样质膜ATP酶的一种抑制剂)会大大 增强10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤对抗人实体肿瘤的功效。已显示， 10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤和10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤与铂 基化学治疗剂的组合对间皮瘤是有效的。(Khokar等,Clin.CancerRes. 7:3199-3205(2001))。与吉西他滨(gemcitabine，Gem)共同施用以治疗 淋巴瘤已公开在WO/2005/117892中。美国专利号6,323,205中公开 了10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤与紫杉酚的组合是有效的。还已显 示，10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤有效用于治疗T细胞淋巴瘤，参见 美国专利号7,622,470。其它研究已显示一种通过测定由样本表达的 还原型叶酸载体-1蛋白(RFC-1)的量来评估淋巴瘤对用10-炔丙基-10- 去氮杂氨基蝶呤治疗的敏感性的方法，其中所表达RFC-1的水平较 高指示对10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤的敏感性较高，公开于PCT 公布号WO2005/117892中。
10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤被称为抗叶酸剂/抗代谢物。叶酸 通路在细胞生长和增殖中起关键作用(Appling,1991；Odin等,2003)。 叶酸(叶酸盐)通过还原型叶酸载体1(RFC-1)进入细胞，由叶酰聚谷氨 酸合成酶(FPGS)聚谷氨酸化，并且被还原成二氢叶酸，二氢叶酸进一 步由二氢叶酸还原酶(DHFR)转化成四氢叶酸(THF)。此通路中所涉及 的不同酶和转运体是一类重要的细胞毒性剂（即抗叶酸剂）的靶标。 甲氨蝶呤是此类别的第一药剂之一并且首先被用于治疗儿童期急性 淋巴母细胞性白血病(Farber等,1948)。从那以后，甲氨蝶呤被广泛地 用于血液系统和实体癌症，并且已合理设计出了多代新型抗叶酸剂以 利用叶酸通路的多个方面(例如，用于结肠直肠癌的雷替曲塞 (raltitrexed)(Cocconi等,1998)和用于恶性胸膜间皮瘤(Vogelzang等, 2003)与非小细胞肺癌(NSCLC)(Hanna等,2004)的培美曲塞 (pemetrexed))。在大多数肿瘤细胞中，RFC-1介导叶酸类似物的内化。 一旦进入细胞，这些类似物就结合二氢叶酸还原酶(DHFR)，由此消 耗嘌呤和胸苷生物合成所需要的细胞内还原型叶酸池，或者这些类似 物将在与DHFR结合之前就被代谢成聚谷氨酸盐。聚谷氨酸化由叶 酰基-聚谷氨酸合成酶(FPGS)催化。叶酰基-聚谷氨酸水解酶(FPGH， 也称为γ-谷氨酰基水解酶[GGH])介导这些细胞内聚谷氨酸化的抗叶 酸剂的裂解并且因此介导其后续清除。胸苷酸合成酶(TS)和甘氨酰胺 核糖核苷酸甲酰基转移酶(GARFT)也在叶酸代谢中涉及作为“再循 环”酶(因此直接影响可用于DNA合成的核苷酸池)。
甲氨蝶呤是一种抗叶酸剂。基于对细胞系的测试，认为10-炔丙 基-10-去氮杂氨基蝶呤与甲氨蝶呤具有类似的细胞毒性型态，10-炔丙 基-10-去氮杂氨基蝶呤的效力经常是甲氨蝶呤的3倍至19倍。
甲氨蝶呤抗性通常因为DHFR基因的突变和扩增而发生。存在 细胞可能获得针对此叶酸拮抗剂的作用的免疫力的三种已知途径。细 胞中甲氨蝶呤的浓度可通过将该药物移进和移出细胞的转运系统的 改变而减少。举例来说，如果细胞借以吸收甲氨蝶呤的转运体的数量 减少，那么将会在细胞中存在较少甲氨蝶呤。此外，细胞中药物的浓 度可以由聚谷氨酸化和代谢作用的速率改变来调控。当药物的聚谷氨 酸化较慢或者代谢较快时，其可能更易于从细胞中除去，从而降低其 在细胞中的浓度和活性。DHFR基因的扩增引起所存在DHFR的量增 加并且已显示与对甲氨蝶呤治疗的反应降低有关。甲氨蝶呤必须与 DHFR结合方能阻止DHFR的活性。如果遗传改变以减少甲氨蝶呤结 合的方式改变DHFR的结合区，那么DHFR可能继续活化叶酸并且 治疗的有效性将降低。所有这些结果都与对甲氨蝶呤的抗性增加有 关。甲氨蝶呤抗性可能快速获得并且可以导致治疗失败。
因此，克服获得性甲氨蝶呤抗性的方法将是有用的。
发明概述
在一个实施方案中，本发明包括一种治疗个体的甲氨蝶呤抗性病 症的方法。此方法可包括向所述个体施用有效量的包含10-炔丙基-10- 去氮杂氨基蝶呤或它的药学上可接受的盐的组合物。
在另一个实施方案中，本发明包括一种治疗需要甲氨蝶呤抗性瘤 形成治疗的个体的方法，其中所述方法包括向所述个体施用有效量的 10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤或它的药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述病症为癌症。在其它实施方案中，所述 病症为炎症性病症。在一个实施方案中，组合物被配制用于静脉内施 用。在另一个实施方案中，组合物被配制用于口服施用。
附图简述
图1示出适用于制备10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤的合成方案；
图2示出10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤和其它叶酸抑制剂对所 测试的15种癌细胞系的敏感性；
图3示出当用10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤或甲氨蝶呤处理时， 未处理、经过10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤适应(DU-PDX)和经过甲 氨蝶呤适应(DU-MTX)的DU-145细胞的IC50；
图4示出当用10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤或甲氨蝶呤处理时， 未处理、经过10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤适应(HEP-PDX)和经过甲 氨蝶呤适应(HEP-MTX)的HEP2细胞的IC50；
图5示出10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤抗性细胞系中叶酸基因 的相对mRNA表达；
图6示出DU145和HEP2敏感性以及DU-PDX、DU-MTX、 HEP-PDX和HEP-MTX10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤和甲氨蝶呤抗 性细胞系中的DHFR蛋白的蛋白质印迹；
图7示出DU145和HEP2敏感性以及DU-PDX、DU-MTX、 HEP-PDX和HEP-MTX10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤和甲氨蝶呤抗 性细胞系中的DHFR的mRNA表达。
发明详述
癌症患者中与疗法有关的一个持续问题是对疗法的反应的个体 差异和肿瘤内导致化学疗法抗性的遗传改变。化学疗法涉及施用通常 靶向快速分裂的细胞的药物。多种化学治疗药物干扰细胞分裂之前的 DNA复制，所述药物包括抗叶酸剂。尽管化学治疗剂已有许多进步， 但癌细胞，尤其是晚期癌症的遗传不稳定性导致了药物抗性癌症的高 发生率。
在本发明中，由DU145(前列腺)和HEP2(头颈部)癌细胞系产生 具有获得性甲氨蝶呤和10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤抗性的细胞系。 对10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤的抗性为亲本细胞的200倍以上的 同时，具有获得性10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤抗性的DU-PDX和 HEP-PDX细胞对甲氨蝶呤展示出交叉抗性；DU-MTX和HEP-MTX 细胞仍对10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤展示出显著的敏感性。
观察到对10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤与对甲氨蝶呤的获得性 抗性的机制不同。获得性10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤抗性在 DU-PDX与HEP-PDX细胞系中与RFC1mRNA表达显著减少有关， 另外，还观察到MDR1mRNA表达少量增加。本发明还显示在10- 炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤抗性细胞中FPGSmRNA表达稍有减少， 表明了聚谷氨酸化在10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤抗性中的作用。 三十年前进行的研究发现，获得性甲氨蝶呤抗性的常见机制是DHFR 基因扩增和由此而引起的酶过度表达(由Assaraf2007；Chen等,1995 评述)。因此，在以逐渐递增浓度的甲氨蝶呤选择所培养的肿瘤细胞 系时，获得性抗叶酸剂抗性经常归因于DHFR基因扩增。实际上， 在本发明中，具有获得性甲氨蝶呤抗性的细胞系HEP-MTX展示出与 它的亲本对应物相比，DHFR蛋白表达显著增加，表明在此模型中可 能有DHFR基因扩增。此种蛋白质增加未在10-炔丙基-10-去氮杂氨 基蝶呤抗性细胞系中观察到。这些发现结果表明在这些细胞系中甲氨 蝶呤抗性与10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤抗性的分子机制不同。
如果癌症的生长速率由于与治疗剂接触而与它在不与治疗剂接 触的情况下的生长相比受到抑制，那么所述癌症对所述治疗剂“有反 应”或对治疗有“良好反应”。癌症的生长可以多种方式测量，例如可 以测量肿瘤的尺寸或适于所述肿瘤类型的肿瘤标记的表达。这些标准 定义了所测量的反应的类型以及疾病进展时间的表征，疾病进展时间 是肿瘤对治疗剂的敏感性的另一个重要的量度。对10-炔丙基-10-去 氮杂氨基蝶呤具有反应性的特性是一种可变的特性，其中不同的癌症 在不同的条件下对给定的治疗剂显示出不同水平的“反应性”。另外， 反应性的量度可以使用除肿瘤生长尺寸以外的其它标准来评估，包括 患者生活品质、转移程度等。此外，临床预后标记和变量可以在适用 情况下进行评估。
如果癌症的生长速率由于与诸如10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤 的治疗剂接触而在与它在不与所述治疗剂接触的情况下的生长相比 时未受到抑制或受到极低程度的抑制，那么所述癌症对于所述治疗剂 “无反应”或具有“较差反应”，或对治疗存在较差反应。如上所述，癌 症的生长可以多种方式测量，例如，可以测量肿瘤的尺寸或适于所述 肿瘤类型的肿瘤标记的表达。对治疗剂无反应的特性是一种高度可变 的特性，其中不同的癌症在不同的条件下对给定的治疗剂显示出不同 水平的“无反应性”。另外，无反应性的量度可以使用除肿瘤生长尺寸 以外的其它标准来评估，包括患者生活品质、转移程度等。此外，临 床预后标记和变量可以在适用情况下进行评估。这种无反应性或较差 反应性癌症可能无反应或最初有反应，但后来获得了抗性。抗性或无 反应性可针对其它更敏感的癌症或肿瘤细胞系或针对相同类型的癌 症或肿瘤细胞系进行测量。这些类型的癌症也可以称为对特定化学治 疗剂具有“抗性”的癌症，如甲氨蝶呤抗性癌症可能最初对甲氨蝶呤具 有抗性，或者可能在用甲氨蝶呤或另一种化学治疗剂进行的一次治疗 过程或多次治疗过程中获得了对甲氨蝶呤的抗性。所述抗性可能是由 叶酸通路蛋白、叶酸输入通路之一中的蛋白质的一处突变或多处突变 所致，或者由与对甲氨蝶呤的反应相关的任何其它蛋白质所致。
因此，在一个实施方案中，本发明包括一种治疗个体的甲氨蝶呤 抗性病症的方法，其中所述方法包括向所述个体施用有效量的10-炔 丙基-10-去氮杂氨基蝶呤和它的药学上可接受的盐。
肿瘤获得对原先对它们具有毒性的药物作用的抗性的能力可以 产生抗性。这种获得性抗性可能由染色体破坏引起。渗透性降低是固 有抗性的常见形式。药物的变更或者失活也许是药物抗性的最常见机 制。药物抗性还可能由其所作用的目标位点改变引起。诸如癌症的病 症获得甲氨蝶呤抗性的情形可通过主治医师或本领域的其他技术人 员进行评价来确定，并且包括治疗时病症消退或静止，接着在一定时 间的治疗期后病症进展。已观察到，在包括癌症在内的许多病症中， 多种病症对治疗表现出获得性抗性。
因此在另一个实施方案中，本发明涉及一种治疗在用甲氨蝶呤治 疗期间获得了甲氨蝶呤抗性的叶酸通路依赖性疾病或恶性肿瘤的方 法，所述方法包括施用治疗有效量的包含10-炔丙基-10-去氮杂氨基 蝶呤或它的药学上可接受的盐的组合物。
“治疗”可以意指使用疗法来预防或抑制进一步肿瘤生长，以及引 起肿瘤收缩，和提供更长的存活时间。治疗还意图包括预防肿瘤转移。 如果癌症或肿瘤的至少一种症状(如由反应性/无反应性、进展时间或 本领域中所已知和本文中所描述的指标所确定)得到减轻、终止、减 缓、最小化或抑制，那么所述肿瘤“受到抑制”或“得到治疗”。如本文 所进一步描述，按照使用治疗方案(例如10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶 呤)进行的治疗肿瘤的任何症状(身体或其它方面)的任何改善都在本 发明的范围内。因此，一般来说，本文所使用的术语“治疗”意指减轻 症状、在暂时或永久的基础上消除癌症或炎症性病症的病因、减缓症 状的出现和/或病症的进展，或者预防疾病(即，防治性治疗)。接受防 治性治疗的受试者一般为由于例如遗传易感性、饮食、暴露于致病原、 暴露于病原体等而有癌症或炎症性病状风险的哺乳动物。
在本发明的一个实施方案中，用于本发明方法的组合物可以包括 10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤，包括“高度纯化”的10-炔丙基-10-去氮 杂氨基蝶呤，和10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤的非对映体。如本发 明说明书和其权利要求书中所用，“高度纯化”的组合物含有大致上不 含会干扰10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤的抗肿瘤活性的其它叶酸衍 生物(尤其是10-去氮杂氨基蝶呤)的10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤。 本发明范围内的组合物可以包括用于将10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶 呤配制成适用于治疗用途的剂量单位形式的载体或赋形剂，以及另外 的非叶酸治疗剂。
10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤在碳10(C10)和碳19(C19)位置含 有不对称中心。在一个实施方案中，10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤包 括C10手性中心R构型与S构型的约1:1外消旋混合物，和≥98.0% 的C19手性中心的S型非对映体。10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤包 括C10非对映体PDX-10a[S构型]化学名称：(2S)-2-[[4-[(1S)-1-[(2,4- 二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁-3-炔基]苯甲酰基]氨基]戊二酸，和PDX-10b [R构型]化学名称：(2S)-2-[[4-[(1R)-1-[(2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基]丁 -3-炔基]苯甲酰基]氨基]戊二酸。
10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤可以使用DeGraw等的美国专利号 5,354,751的实施例7中公开的方法合成，所述美国专利涉及制造10- 炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤并且以引用方式整体并入本文。10-炔丙基 -10-去氮杂氨基蝶呤还可通过美国专利号6,028,071，尤其实施例1中 呈现的方法来合成，所述美国专利以引用方式并入本文。
为了产生10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤的非对映体，可如本文 和其它处所教导合成10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤，并且最终产物 或较早中间产物随后可以被用作起始物质来分离C10非对映体。或 者，可以采用手性合成，其中由多种起始物质中的任一种直接制备大 致上纯的PDX-10a和/或PDX-10b。可以采用本领域中已知的用于分 离对映体或非对映体的手性柱来分离最终10-炔丙基-10-去氮杂氨基 蝶呤或较早中间体的非对映体。适用于分离非对映体的手性柱包括可 从日本的大赛璐化学工业株式会社(DaicelChemicalIndustriesLtd., Japan)获得的手性柱CHIRALPAKAD，使用乙醇作为流动相。
在一些实施方案中，叶酸通路依赖性疾病或病症是癌症。在其它 实施方案中，叶酸通路依赖性疾病或病症是炎症性病症。在一些实施 方案中，癌症或炎症性病症是最初对甲氨蝶呤至少在一定程度上敏 感，然后获得甲氨蝶呤抗性的病症。确定叶酸通路疾病或病症是否对 甲氨蝶呤具有固有或获得性抗性的方法可由本领域的技术人员确定， 并且可以包括诸如培养或获得相关细胞(如来自患者的肿瘤细胞)并 且测定与对甲氨蝶呤的抗性和/或敏感性相关的各种叶酸通路酶的表 达水平的方法。另一所述方法为测定和/或监测患者对甲氨蝶呤治疗 的反应以揭示固有或获得性抗性。可对相关细胞进行基因型分析或表 型分析以测定指示甲氨蝶呤抗性的标记的相对表达。
在一个实施方案中，用于本发明的表型测定包括从患者获得肿瘤 外植体，培养所述外植体的部分，从所述外植体培育出相关细胞的单 层，使所述单层暴露于药物候选物，以及评估药物候选物改变肿瘤细 胞表型的能力。
本发明的基因型分析通过任何已知的方法来完成。优选方法包括 将从患者获得的细胞的基因型或其部分与已知与一般或特定同所评 价的治疗候选物相关的药物抗性有关的基因型进行比较。举例来说， 患者细胞中存在已知或怀疑会赋予对治疗候选物的抗性的多态变体 将会将所述候选物从针对所述细胞的潜在治疗剂中筛选出去。患者细 胞的遗传特征通过下文所述的本领域已知的方法(例如测序、多态现 象)进行测定。患者基因型对药物抗性的影响可通过参考将与抗性相 关的已知突变或多态现象分类的遗传数据库或文库来确定。
虽然不受任何机制束缚，但细胞中与对甲氨蝶呤的抗性或获得性 抗性有关的突变的实例包括但不限于DHFRmRNA和/或蛋白质表达 相对于敏感性细胞或相对于获得抗性之前的细胞有所增加。
在一些实施方案中，癌症或炎症性病症对甲氨蝶呤具有获得性抗 性。欲治疗的癌症包括例如前列腺癌、乳癌、黑色素瘤、肺癌和T 细胞淋巴瘤。对于T细胞淋巴瘤，存在多种适于使用本发明的非对映 体治疗的病状，并且所述病状包括：(a)淋巴母细胞性淋巴瘤，其中恶 性肿瘤在来自胸腺的原始淋巴祖细胞中发生；(b)成熟或周围T细胞 赘生物，包括T细胞前淋巴细胞性白血病、T细胞粒状淋巴细胞性白 血病、侵袭性NK细胞白血病、皮肤T细胞淋巴瘤(蕈样肉芽肿/塞扎 里综合症(Sezarysyndrome))、退行性大细胞淋巴瘤、T细胞型、肠病 型T细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤(包括与HTLV-1相关者) 和血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤，和皮下脂膜炎性T细胞淋巴瘤； 以及(c)最初累及淋巴结副皮质区并且从未生长成真正的滤泡型态的 周围T细胞淋巴瘤。欲治疗的其它癌症包括血液系统恶性肿瘤、头颈 癌、胃肠道癌症、卵巢癌和骨肉瘤。
本文所用的术语“炎症性病症”是指由炎症引起或者症状包括炎 症的任何病症。举例来说，由炎症引起的炎症性病症可以是败血性休 克，并且症状包括炎症的炎症性病症可以是类风湿性关节炎。本发明 的炎症性病症包括但不限于：心血管疾病、类风湿性关节炎、多发性 硬化症、克罗恩氏病、炎症性肠病、全身性红斑狼疮、多肌炎、败血 性休克、移植物抗宿主疾病、哮喘、鼻炎、牛皮癣和湿疹。在一个实 施方案中，欲治疗的炎症性病症包括类风湿性关节炎和青少年类风湿 性关节炎。
本文所用的术语“患者”或“哺乳动物”是指归类为哺乳动物的任 何动物，包括人、家畜和农畜，以及动物园或伴侣动物，如狗、马、 猫、牛等。哺乳动物优选为人。
用于本发明用途的10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤通常将如本领 域中所已知以对正进行治疗的患者提供最有效的治疗(从功效和安全 性的观点来看)的给药方案向患者施用。在进行本发明的治疗方法时， 根据本发明用于甲氨蝶呤抗性病症和/或10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶 呤敏感性癌症的10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤可以本领域中已知的 任何有效方式施用，如通过口服、局部、静脉内、腹膜内、肌肉内、 关节内、皮下、鼻内、眼内、阴道、直肠、颅内或皮内途径，这取决 于所治疗癌症的类型和开处方的医师基于例如公布的临床研究的结 果所作出的医学判断。
根据本发明用于甲氨蝶呤抗性病症和/或10-炔丙基-10-去氮杂氨 基蝶呤敏感性癌症的10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤可以被配制成药 物制剂的一部分。具体剂型将取决于施用方法，但可以包括片剂、胶 囊、口服液和可注射溶液用于口服、静脉内、肌肉内、颅内或腹膜内 施用等。剂量可表示为mg/m2。或者，剂量可通过本领域的技术人员 可接受的任何方式表示为毫克/公斤体重。一种获得以毫克/公斤体重 表示的等同剂量的方法包括应用转换因子0.025mg/kg，对于普通人 来说约等同于1mg/m2。根据此计算，150mg/m2的剂量约等同于约 3.75mg/kg。
适用于治疗甲氨蝶呤抗性病症和/或10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶 呤敏感性癌症的肿瘤学的剂量包括以下给药方案。在一个实施方案 中，这些剂量是静脉内剂量。举例来说，每天每平方米体表面积约 10mg至120mg的剂量(每天每公斤体重约0.25mg至3mg)为适当 的。以下剂量也是适合的：每周一次30mg/m2(约0.75mg/kg)持续3 周接着停药一周、每周一次30mg/m2(约0.75mg/kg)持续6周接着停 药一周，或按每周一次持续6周的时程逐渐递增10-炔丙基-10-去氮 杂氨基蝶呤的剂量。适当时可基于患者耐受性和恶性肿瘤的类型使用 较低剂量。当使用频率较低的施用时可利用较高剂量。因此，在一般 意义上，10mg/m2至275mg/m2(约0.25mg/kg至约6.9mg/kg)的剂量 适用于各种给药时程，例如约100mg/m2至275mg/m2(约2.5mg/kg 至约6.87mg/kg)之间每两周一次的剂量，和约10mg/m2至150mg/m2(约0.25mg/kg至约3.75mg/kg)之间或者更具体来说约10mg/m2与60 mg/m2之间每周一次的剂量。
使用与美国专利号6,323,205中所描述的方案类似的方案来确定 适合剂量在本领域的技能范围内。在一个实施方案中，根据本发明用 于甲氨蝶呤抗性病症和/或10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤敏感性癌症 的10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤可以每剂约10mg/m2至约275 mg/m2(约0.25mg/kg至约6.87mg/kg)的量施用。本发明的方法还包 括按以下施用根据本发明用于甲氨蝶呤抗性病症和/或10-炔丙基-10- 去氮杂氨基蝶呤敏感性癌症的10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤：每周 一次；所施用的剂量为约10mg/m2(0.25mg/kg)或约30mg/m2(0.75 mg/kg)；施用量为每剂约10mg/m2至约150mg/m2(约0.25mg/kg至 约3.75mg/kg)；每两周一次；以及所施用的剂量为约100mg/m2至约 275mg/m2(约2.5mg/kg至约6.9mg/kg)。在一个实施方案中，根据本 发明用于甲氨蝶呤抗性病症和/或10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤敏感 性癌症的10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤可以如下量施用：约0.25 mg/kg与约4mg/kg之间的量；约0.75mg/kg与约3mg/kg之间；约 1.0mg/kg与约2.5mg/kg之间的量；约0.25mg/kg或约0.75mg/kg的 量(或以体表面积(BSA)计的等同量)。
10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤可与其它细胞毒性和抗肿瘤化合 物组合使用，所述化合物包括长春花生物碱，如长春花碱、诺维本 (navelbine)和长春地辛(vindesine)；核苷酸类似物，如吉西他滨、5- 氟尿嘧啶和阿糖胞苷；烷基化剂，如环磷酰胺(cyclophosphamide)或异 环磷酰胺(ifosfamide)；顺铂(cisplatin)或卡铂(carboplatin)；甲酰四氢叶 酸；紫杉烷，如紫杉醇(paclitaxel)或多西紫杉醇(docetaxel)；抗CD20 单克隆抗体，含有或不含放射性同位素；和抗生素，如阿霉素 (doxorubicin)和丝裂霉素(mitomycin)。也可使用10-炔丙基-10-去氮杂 氨基蝶呤与这些其它抗肿瘤剂中的多种或与生长因子抑制剂和抗血 管生成剂的组合。
10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤与其它药剂可同时施用，或者作为 常用治疗方案的一部分组合利用，在所述治疗方案中10-炔丙基-10- 去氮杂氨基蝶呤与一种或多种其它药剂在不同时间施用。举例来说， 其它药剂可在相对于10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤施用之前、之后 立即或之后一段时间(例如24小时)施用。因此，除非另外指定，否 则出于本申请的目的，术语施用一般指同时施用或指药物按平行治疗 方案中的任一顺序在所述药物之间有或无时间间隔的情况下依序施 用。
对于炎症性病症的治疗，10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤可以通过 口服、肌肉内、静脉内、动脉内或鞘内途径给予。对于本领域的技术 人员来说将存在其它途径。对于包括但不限于牛皮癣、类风湿性关节 炎和/或青少年类风湿性关节炎在内的炎症性病症的治疗，剂量可包 括以下。用于成人类风湿性关节炎或多关节型青少年类风湿性关节炎 的本发明方法包括每周一次口服施用约1mg至约30mg；在一个实 施方案中，每周一次施用约7.5mg。其它剂量可包括每周一次给予 10mg/m2。可逐渐调整剂量以达到最佳反应。在较高剂量下，如超过 20mg/m2/wk，或0.65mg/kg/wk至1.0mg/kg/wk，通过肌肉内或皮下 给药可达成更好的吸收。适当的剂量还可包括每周7.5mg，或者约 0.5mg与约10mg之间的分次口服剂量；在一个实施方案中，剂量可 为2.5mg的分次口服剂量，以12小时的时间间隔持续三次给药，按 每周一次的时程给予。剂量在它有效的情况下可以持续，并且包括持 续长达两年和更长时间的疗法。
10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤适合与叶酸以及维生素B12补充 剂组合使用以减少治疗的副作用。举例来说，可以用叶酸(开始一周 每天1mg/m2，随后用10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤治疗，或者在不 以体表面积(BSA)计的情况下每天口服(p.o.)1mg)；和B12(每月1 mg/m2，或者每8-10周肌肉内(I.M.)给予1mg(不以BSA计)，或者每 天口服1mg(不以BSA计))对患者进行治疗。
在一个实施方案中，根据本发明的10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶 呤被配制用于口服施用。在另一个实施方案中，根据本发明的10-炔 丙基-10-去氮杂氨基蝶呤被配制用于静脉内施用。
10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤可以多种不同剂型施用。举例来 说，10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤可以优选口服或胃肠外施用。
10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤可与各种药学上可接受的惰性载 体一起以片剂、胶囊、锭剂、药片、硬糖、粉末剂、喷雾剂、霜剂、 油膏、栓剂、胶冻、凝胶、糊剂、洗剂、软膏、酏剂、糖浆剂等形式 施用。所述剂型的施用可以单次或多次给药进行。载体包括固体稀释 剂或填充剂、无菌水性介质和各种无毒有机溶剂和其它载体。可以对 口服药物组合物适当地进行甜化和/或调味。对于10-炔丙基-10-去氮 杂氨基蝶呤的口服施用，将含有一种或两种活性剂的片剂与各种赋形 剂(如微晶纤维素、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸二钙和甘氨酸)中的任一 种以及各种崩解剂(如淀粉(且优选为玉米淀粉、马铃薯淀粉或木薯淀 粉)、海藻酸和某些复合硅酸盐)连同造粒粘合剂(如聚乙烯吡咯烷酮、 蔗糖、明胶和阿拉伯胶)进行组合。另外，润滑剂诸如硬脂酸镁、月 桂基硫酸钠和滑石粉通常非常适用于压片的目的。还可采用类似类型 的固体组合物作为明胶胶囊中的填充剂；在这方面优选的物质还包括 乳糖(lactose)或乳糖(milksugar)以及高分子量聚乙二醇。当希望含水 混悬液和/或酏剂用于口服施用时，10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤可 与各种甜味剂或调味剂、着色物质或染料，并且必要时与乳化剂和/ 或悬浮剂以及如水、乙醇、丙二醇、甘油和其各种类似组合的稀释剂 进行组合。含有本发明的组合物的片剂可以通过压制或模制，任选地 在一种或多种辅助成分或助剂存在下来制备。压制的片剂可以通过在 适合的机器中压制任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性 剂或分散剂混合的呈自由流动形式(如粉末或颗粒)的活性成分来制 备。模制的片剂可以通过在适合的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿 的粉末状化合物的混合物来制备。各片剂优选含有约0.05mg至约10 g活性成分并且各药囊或胶囊优选含有约0.05mg至约10g活性成分； 片剂同样可适当地含有每粒片剂约2.5mg活性成分或每粒片剂约7.5 mg。
对于10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤的胃肠外施用，可以采用溶 液，以及包含活性剂或其相应水溶性盐的无菌水溶液。所述无菌水溶 液优选经过适当缓冲，并且还优选用例如足量生理盐水或葡萄糖赋予 等渗性。这些特定水溶液尤其适于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内注 射的目的。油性溶液适于关节内、肌肉内和皮下注射的目的。所有这 些溶液在无菌条件下的制备都可通过本领域的技术人员熟知的标准 药学技术容易地完成。
出于兽医学的目的，活性剂可以使用任何形式和通过上文描述的 任何途径单独或一起向动物施用。在一个优选的实施方案中，10-炔 丙基-10-去氮杂氨基蝶呤以胶囊、大丸剂(bolus)、片剂、液体药液形 式、通过注射或作为植入物施用。作为替代方案，10-炔丙基-10-去氮 杂氨基蝶呤可以与动物饲料一起施用，并且出于此目的，可制备浓缩 的饲料添加剂或预混物用于正常动物饲料。根据标准兽医学规范以常 规方式制备所述制剂。
本发明还包括一种治疗需要甲氨蝶呤抗性瘤形成治疗的个体的 方法，其中所述方法包括向所述个体施用有效量的10-炔丙基-10-去 氮杂氨基蝶呤和它的药学上可接受的盐。
术语“药学上可接受的盐”是指由药学上可接受的无毒碱或酸制 备的盐。当本发明的化合物呈酸性时，它的相应盐可以常规地由药学 上可接受的无毒碱(包括无机碱和有机碱)制备。由所述无毒碱产生的 盐包括铝盐、铵盐、钙盐、铜盐(铜盐和亚铜盐)、铁盐、亚铁盐、锂 盐、镁盐、锰盐(锰盐和亚锰盐)、钾盐、钠盐、锌盐以及类似盐。特 别优选者是铵盐、钙盐、镁盐、钾盐和钠盐。在一个实施方案中，盐 是盐酸盐。由药学上可接受的有机无毒碱产生的盐还包括伯胺、仲胺 和叔胺以及环状胺和取代胺(如天然存在的和合成的取代胺)的盐。可 以形成盐的其它药学上可接受的有机无毒碱包括离子交换树脂，如精 氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N′,N′-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二 乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N- 乙基哌啶、还原葡糖胺、葡糖胺、组氨酸、海巴明(hydrabamine)、 异丙胺、赖氨酸、甲基还原葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、 普鲁卡因(procaine)、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、缓血 酸胺等。
除上述常用剂型外，10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤(包括其各组 分的药学上可接受的盐、酯、溶剂合物和多晶型物)还可以通过控制 释放方式和/或递送装置施用。
除非另外指出，否则本发明说明书与权利要求书中所用的表示成 分、尺寸、反应条件等的量的所有数值应理解为在所有情况下都被术 语“约”修饰。
在本申请和权利要求书中，除非另外特别说明，否则单数的使用 包括复数。另外，除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外， 术语“包括(including)”以及其它形式(如“包括(includes)”和“包括 (included)”)的使用不具限制性。同样，除非另外特别说明，否则如“要 素”或“组分”的术语涵盖包含一个单元的要素和组分以及包含超过一 个单元的要素和组分。
本发明在某种程度上基于展示了具有获得性甲氨蝶呤抗性的细 胞将仍保留对普拉曲沙的敏感性，而获得了普拉曲沙抗性的细胞也将 获得甲氨蝶呤抗性的数据。对于普拉曲沙敏感性的预测遗传因素，由 DU145(前列腺)和HEP2(头颈部)癌细胞系产生对所述药物具有获得 性抗性的两个细胞系。在对普拉曲沙的抗性为亲本细胞的200倍以上 的同时，DU-PDX和HEP-PDX对甲氨蝶呤展示出部分交叉抗性。普 拉曲沙获得性抗性与RFC-1表达减少和MDR1表达增加有关。Fotoohi 等(2009)描述了在甲氨蝶呤抗性细胞中RFC-1的mRNA水平下调超 过两倍的抗叶酸剂抗性白血病细胞系，强调了内流转运在抗叶酸剂抗 性中的重要作用。类似的数据在早先由Jansen(1998)、Rothen(2004) 和Ifergan(2003)使用其它甲氨蝶呤抗性细胞模型获得。MDR1表达增 加似乎并未在所观察到的获得性普拉曲沙抗性中起作用，这是因为抑 制MDR1并未恢复普拉曲沙敏感性。已显示，FPGS活性降低在人白 血病CCRF-CEM细胞中与获得性甲氨蝶呤抗性有关(Mauritz,2002)。 在一项研究中，在普拉曲沙抗性细胞中观察到FPGS表达稍有减少， 表明了聚谷氨酸化在普拉曲沙抗性中的作用。三十年前进行的研究发 现，获得性甲氨蝶呤抗性的另一个常见机制是DHFR基因扩增和由 此而引起的酶过度表达(由Assaraf2007；Chen等,1995评述)。在此 研究中，具有获得性甲氨蝶呤抗性的细胞系HEP-MTX展示出DHFR mRNA和蛋白质表达与它的亲本对应物相比显著增加。在普拉曲沙抗 性细胞系中未观察到DHFR表达增加。这些发现结果表明在这些细 胞系中甲氨蝶呤抗性与普拉曲沙抗性的分子机制不同。
因此，本发明显示，令人惊奇的是，对甲氨蝶呤具有抗性的细胞 系对普拉曲沙并不具有抗性和/或对普拉曲沙保留了高得多的原始敏 感性。
本发明的其它目标、优点和新型特征对于本领域的技术人员来说 在研究以下实施例后将变得显而易见，所述实施例不意图具有限制 性。另外，如上所述的和如以下权利要求书部分中所要求的本发明的 各种实施方案和方面各自将在以下实施例中找到实验支持。
实施例
以下实施例仅出于说明的目的而提供并且不意图限制本发明的 范围。
实施例1：
图1示出适用于制备10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤的合成方案。 将60%NaH的油分散液(1.06g，26.5mmol)于18mL过筛脱水的THF 中的混合物冷却到0℃。用升对酞酸二甲酯(5.0g，24mmol.，图1中 的化合物1)于无水THF(7mL)中的溶液处理冷混合物，并且将所述 混合物在0℃下搅拌1小时。添加炔丙基溴(26.4mmol)，并且将混合 物在00℃下再搅拌1小时，然后在室温下搅拌16小时。用2.4mL50% 乙酸处理所得混合物，然后倾倒至240mL水中。用乙醚(2×150mL) 萃取混合物。合并乙醚萃取物，经过Na2SO4干燥，并且浓缩成橙黄 色油状物。进行硅胶(600mL230-400筛目)色谱，用环己烷-EtOAc(8:1) 洗脱，得到呈白色固体状的产物α-炔丙基升对酞酸二甲酯(化合物 2)(4.66)，通过TLC(环己烷-EtOAc，3:1)显示所述产物为均质的。然 而，对此产物获得的质谱数据显示其为想要的产物2与二炔丙基化化 合物的混合物。没有检测到起始物质1。HPLC显示单炔丙基化产物 与二炔丙基化产物的比率为约3:1。因为二炔丙基化产物不同于化合 物1，不会在下一个反应步骤中产生不需要的副产物，所以此物质适 于转化成化合物3。在用于在合成中继续反应的产物中不存在起始化 合物1对于在转化获得最终产物期间避免连续形成10-dAM是非常重 要的，这是因为将10-dAM从10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤中完全 除去是非常困难的。
通过将0.36g60%NaH(9mmol)的油分散液与10mL无水DMF 组合形成混合物并且将所述混合物冷却到0℃-5℃。用第一反应的产 物(化合物2)(2.94g，12mmol)于10mL无水DMF中的溶液逐滴处理 冷混合物，然后在0℃下搅拌30分钟。冷却到-25℃后，逐滴添加2,4, 二氨基-6-(溴甲基)-蝶啶氢溴酸盐-0.22-丙醇(1.00g，2.9mmol)于10 mL无水DMF中的溶液，同时使温度维持在接近-25℃。经过2小时 的时间使搅拌过的混合物的温度上升至-10℃。再在-10℃下持续2小 时后，使温度上升至20℃，在室温下继续搅拌超过2小时。然后通 过添加固体CO2将反应物调节至pH7。在真空中浓缩以除去溶剂后， 将残余物与乙醚一起搅拌并且收集不溶于乙醚的物质，用水洗涤，并 且在真空中干燥，得到1.49g粗产物。将此粗产物溶解于CHCl3-MeOH (10:1)中以便施加至硅胶管柱上。用相同的溶剂系统洗脱，得到10- 炔丙基-10-甲氧羰基-4-脱氧-4-氨基-10-去氮杂蝶酸甲酯(化合物3)，根 据TLC其为均质的，产率为40%(485mg)。
将搅拌过的化合物3(400mg，0.95mmol)于2-甲氧基乙醇(5mL) 中的悬浮液用水(5mL)，然后用10%氢氧化钠溶液(3.9mL)处理。在 室温下搅拌混合物4小时，期间形成溶液。用乙酸将溶液调节至pH8 并且在高真空下浓缩。将所得残余物溶解于15mL水中并且酸化至 pH5.5-5.8，引起沉淀物形成。收集沉淀物，用水洗涤并且在真空中 干燥，回收到340mg化合物4(91%产率)。HPLC分析指示产物纯度 为90%。
通过在15mLDMSO中在115℃-120℃下加热10分钟使化合物4 (330mg)脱去羧基。10分钟后进行HPLC测试，证实了转化基本上完 成。通过在真空中蒸馏(40℃浴槽)除去DMSO。将残余物与0.5N NaOH一起搅拌，得到澄清溶液。用1NHCl酸化至pH5.0，得到呈 黄色固体状的10-炔丙基-4-脱氧-4-氨基-10-去氮杂蝶酸(化合物5)，产 率为70%。HPLC指示此阶段的产物纯度为90%。
使用BOP试剂(六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)鏻(287 mg，0.65mmol，奥德里奇化学公司(AldrichChemicalCo.))在含有三 乙胺(148mg,1.46mmol)的DMF(10mL)中使化合物5(225mg，0.65 mmol)与L-谷氨酸二甲酯盐酸盐(137mg，0.65mmol)偶合。在20℃-25 ℃下搅拌混合物3小时，然后蒸发至干燥。将残余物与水一起搅拌并 且收集水不溶性粗产物，并且在真空中干燥。通过硅胶色谱(用含有 三乙胺(0.25体积%)的CHCl3-MeOH(10:1)洗脱)对粗产物(350mg)进 行纯化，回收到165mg10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤二甲酯(化合物 6，50%产率)，根据TLC(CHCl3-MeOH5:1)其为均质的。
将化合物6(165mg，0.326mmol)悬浮于添加有0.72mL(0.72 meq)1NNaOH的10mL经过搅拌的MeOH中。在室温下持续搅拌 直至在数小时后形成溶液为止。将溶液在20℃-25℃下保持8小时， 然后用10mL水稀释。在减压下蒸发除去甲醇，并且将浓缩了的水溶 液在20℃-25℃下再留置24小时。然后，HPLC显示酯水解完成。用 乙酸将澄清的水溶液酸化至pH4.0，使得10-炔丙基-10-去氮杂氨基 蝶呤以浅黄色固体形式沉淀出，收集、水洗并且在真空中干燥了的产 物重122mg(79%产率)。通过元素分析、质子NMR和质谱进行的测 定与指定的结构完全一致。HPLC分析指示纯度为98%并且确定所述 产物不含10-去氮杂氨基蝶呤。
在此情况下，10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤的量(如通过HPLC 峰面积所测定)接近98%，并且处理软件未检测到对应于10-去氮杂氨 基蝶呤的峰，尽管在此区域中存在少许基线波动。
实施例2：
为探究10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤对不同实体肿瘤类型的活 性，研究了15种人实体肿瘤细胞系对10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤 的细胞毒性活性的敏感性。
材料和方法：细胞系
一组人结肠癌(HT29、HCT116、COLO205、HCC2998)、乳癌 (MCF7、MDA-MB-435)、肺癌(HOP62、HOP92)、卵巢癌(OVCAR3、 IGROV1)、前列腺癌(DU145、PC3)和头颈癌(SCC61、HEP2、SQ20B) 细胞系是购自ATCC(Rockville,MD)和美国国家癌症研究所(National CancerInstitute)保藏中心。在补充有10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、 100单位ml-1青霉素(penicillin)和100μMml-1链霉素(streptomycin)的 RPMI培养基中将细胞培育成单层。
细胞毒性测定
所产生的所有数据都是一式两份进行的三次单独实验的结果。使 用如先前所述进行的MTT测定(Hansen,1989)来测定细胞活力。简单 来说，将细胞以每孔2×103个细胞的密度接种在96孔板中。孵育细 胞120小时，然后在37℃下添加0.4mgml-1的MTT染料(3-[4,5-二甲 基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四唑鎓盐，持续4小时。将单层悬浮于 0.1mlDMSO中并且使用微板读数器测量560nm下的吸光度。阳性 和阴性对照组分别包括具有未处理的细胞或含MTT而无细胞的培养 基的孔。由线粒体脱氢酶催化黄色水溶性四唑鎓盐MTT转化成紫色 不溶性甲臜，并且将所述转化用于估算活细胞的数目。将对应于未处 理细胞的对照值视作100%并且经过处理的样品的活力表示为占对照 组的百分比。IC50值测定为使细胞活力降低50%的浓度。
为了进行单个药剂研究，接种细胞并且静置24小时，之后用递 增浓度的10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤处理72小时。孵育后，将细 胞回收至不含化合物的培养基中持续48小时，之后使用MTT测定来 测定生长抑制作用。
蛋白质印迹分析
在含有50mMHEPES(pH7.6)、150mMNaCl、1%TritonX-100、 2mM钒酸钠、100mMNaF和0.4mg.ml-1苯甲基磺酰氟的缓冲液中 使细胞溶解。用等量的蛋白质(20μg-50μg/泳道)进行SDS-PAGE并且 转移至硝化纤维素膜上。用抗裂解型PARP、抗裂解型胱天蛋白酶3、 抗胱天蛋白酶9(法国SaintQuentinYvelines的赛信通生物试剂有限公 司(CellSignaling,SaintQuentinYvelines,France))、抗DHFR(法国的 艾碧康公司(Abcam,France))、抗β-肌动蛋白(法国Saint-Quentin Fallavier的西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich,Saint-Quentin Fallavier,France))特异性一抗，随后用连接有过氧化物酶的二抗探测 膜并且通过化学发光法进行显影。
图2示出所测试的15种人癌细胞系对10-炔丙基-10-去氮杂氨基 蝶呤的相对敏感性。发现9种细胞系对10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶 呤的细胞毒性活性敏感(IC50<0.1μM)，而发现6种细胞系具有相对抗 性(IC50>9μM)。
单个药剂抗增殖作用。
在如表1所展示的15种癌细胞系中检验普拉曲沙的抗增殖作用。 时程实验显示，当细胞暴露于普拉曲沙72小时之时达到最佳抗增殖 作用(图1A)。普拉曲沙的IC50的范围为0.01±0.002μM(针对前列腺癌 细胞系PC3)至>350μM(针对MDA-MB-435细胞系)。有趣的是，观 察到以下两组细胞系的IC50相差超过100倍：一组包括PC3、SCC61、 DU145、HT29、HOP62、SQ20B、HOP92、HEP2和IGROV1细胞展 示IC50<0.1μM，而Colo205、HCC2998、MCF7、HCT116、OVCAR3 和MDA-MB-435细胞显示IC50值>9μM。
将普拉曲沙的抗增殖作用与甲氨蝶呤和多种常用的抗代谢物(如 培美曲塞、5-FU和5′-DFUR、活性卡培他滨(capecitabine)代谢物)的 作用进行比较(图1B和表1)。普拉曲沙的IC50平均起来为对于甲氨蝶 呤所观察到的IC50的近乎十分之一。这两种抗叶酸剂的细胞毒性特征 在利用相同的两组不同的敏感性和抗性细胞系的情况下为类似的。普 拉曲沙的细胞毒性特征不同于5-FU、5′-DFUR和培美曲塞的细胞毒 性特征，表明普拉曲沙与这些其它抗代谢物之间在代谢、作用机制和 /或抗性方面存在差异。有趣的是，在普拉曲沙与培美曲塞(一种被认 为主要是胸苷酸合成酶(TS)抑制剂的抗叶酸剂)之间观察到有限的交 叉敏感性。
叶酸转运和代谢中所涉及的基因的表达
在该组癌细胞系中分析已知涉及于抗叶酸剂敏感性的基因的表 达。通过qRT-PCR测定DHFR、FPGS、TS/TYMS(胸苷酸合成酶)、 SCL19A1/RFC-1、GARFT(甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰基转移酶)、 SLC25A32(线粒体叶酸转运体/载体)和ABC转运体B1(ABCB1或 MDR1)mRNA表达(图3A)。所述细胞系表达不同水平的这些叶酸通 路基因，但在普拉曲沙敏感性与TS、SCL19A1/RFC-1、GARFT、 SLC25A32和MDR1的mRNA表达之间未发现明显相关性。普拉曲 沙敏感性细胞表达的DHFR(普拉曲沙的一种靶标)水平相对高于“抗 性”组，但并未达到统计显著性(p=0.083，图3A)。普拉曲沙敏感性细 胞表达的FPGSmRNA水平显著高于抗性细胞(t-检验，p=0.002)。总 之，发现FPGSmRNA表达与普拉曲沙敏感性(IC50)之间趋向于正相 关(R2=0.47，p<0.01)，表明聚谷氨酸化在普拉曲沙抗增殖活性中具有 重要作用。
为了确定叶酸转运体在普拉曲沙活性中的潜在作用，我们使9种 普拉曲沙敏感性细胞系在药物暴露72小时后获得的IC50值与 SCL19A1/RFC-1和SLC25A32的mRNA表达水平相关联(图3B)。表 达高水平SCL19A1/RFC-1和SLC25A32mRNA的细胞展示出较高的 普拉曲沙敏感性，表明SCL19A1/RFC-1和SLC25A32在普拉曲沙的 细胞吸收方面具有潜在作用。
表1.一组人癌细胞系在暴露于普拉曲沙、甲氨蝶呤、5-FU、 5′-DFUR或培美曲塞72小时后的细胞毒性(IC50，μM)。
*所使用的细胞系：结肠癌(HT29、HCT116、COLO205、 HCC2998)、乳癌(MCF7)、黑色素瘤(MDA-MB-435，先前被称为乳癌 细胞系)、NSCLC(HOP62、HOP92)、卵巢癌(OVCAR3、IGROV1)、 前列腺癌(DU145、PC3)和头颈癌(SCC61、HEP2、SQ20B)
实施例3：
10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤和甲氨蝶呤抗性细胞系的产生。
为了表征10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤抗增殖作用的预测因子， 分别由亲本DU145和HEP2细胞通过经历6个月的时间暴露于逐步 递增浓度的10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤来产生细胞系DU-PDX和 HEP-PDX。所得的DU-PDX和HEP-PDX细胞对10-炔丙基-10-去氮 杂氨基蝶呤的敏感性为亲本细胞的至多1/200和1/500。在不含药物 的培养基中进行5次传代后，抗性细胞保留了它们的药物抗性，表明 了这些细胞系的稳定性。
为了比较10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤与甲氨蝶呤抗性的机制， 由亲本DU145和HEP2细胞通过暴露于逐步递增浓度的甲氨蝶呤来 产生细胞系DU-MTX和HEP-MTX。与亲本细胞相比，DU-MTX和 HEP-MTX对甲氨蝶呤和10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤展示出抗性。 然而，在DU-MTX和HEP-MTX癌细胞中10-炔丙基-10-去氮杂氨基 蝶呤的活性仍优于甲氨蝶呤的活性(10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤的 IC50为甲氨蝶呤IC50的约1/10)。
图3示出10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤或甲氨蝶呤对DU145细 胞和经过10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤或甲氨蝶呤适应的DU145细 胞的IC50。此数据显示，对于DU-MTX，10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶 呤保留明显功效；10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤对经过甲氨蝶呤适应 的DU-145细胞系的IC50为0.02μM。相比之下，10-炔丙基-10-去氮 杂氨基蝶呤对未处理的DU-145细胞的IC50为0.01μM。经过甲氨蝶 呤适应的DU-145细胞显示，甲氨蝶呤的IC50增至约10倍。总之， 经过10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤适应的DU-145细胞也变得对甲氨 蝶呤不敏感，而经过甲氨蝶呤适应的DU-145细胞对10-炔丙基-10- 去氮杂氨基蝶呤所显示的敏感性仍与未处理的DU-145细胞大致相 同。
图4示出10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤或甲氨蝶呤对HEP2细胞 和经过10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤或甲氨蝶呤适应的HEP2细胞 的IC50。此数据显示，对于HEP-MTX(经过甲氨蝶呤适应)，10-炔丙 基-10-去氮杂氨基蝶呤保留了明显的功效；根据IC50测量结果，10- 炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤的有效性仍高达10倍。
与获得性10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤抗性相关的遗传改变。
RT-PCR。
使用ABIPrism7900序列检测系统(美国加州福斯特城的珀金埃 尔默应用生物系统公司(Perkin-ElmerAppliedBiosystems,FosterCity， CA,USA)进行的定量RT-PCR的理论和实践方面对于本领域的技术 人员来说是已知的。结果表示为目标基因表达相对于TBP基因(一种 内源性RNA对照)和相对于由来自含有最小量的目标基因mRNA的 所测试系列的细胞系样品组成的校准物(1X样品)的n倍差异。一式两 份进行实验。
为了确定抗叶酸剂抗性的可能机制，我们在亲本和抗性细胞中评 价了叶酸代谢中所牵涉到的多种基因的mRNA表达，所述基因包括 DHFR、TS、FPGS、RFC1/SCL19A1、SLC25A32和ABCB1/MDR1。 如图5所示，在10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤抗性细胞中DHFR、 TS和SLC25A32的mRNA表达并未发生明显变化。在DU-PDX和 HEP-PDX细胞中观察到与它们的亲本对应物相比FPGSmRNA表达 稍有减少。相比而言，在两种10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤抗性细 胞系中RFC1/SCL19A1表达减到1/10以下。DU-PDX和HEP-PDX 中ABCB1/MDR1的mRNA水平分别是DU145和HEP2的40倍和2 倍。这些数据表明转运体在10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤抗增殖活 性和获得性抗性中具有重要作用。维拉帕米(verapamil，一种钙通道 阻断剂)通过充当MDR1的竞争性底物来逆转抗性，而与它固有的药 理学功能无关。各种临床研究也显示，诸如维拉帕米的药物能逆转对 抗癌药物的抗性。为了研究MDR1在10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤 抗性中的作用，将DU-PDX和HEP-PDX细胞与30μM维拉帕米和3 μM环孢素A(cyclosporinA)并且同时与10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶 呤一起孵育72小时。在存在和不存在维拉帕米和环孢素A的情况下 未观察到10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤细胞毒性有变化，表明在这 些细胞系中MDR1过度表达在获得性抗性方面没有明显作用(结果未 示)。
对DHFR(10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤和甲氨蝶呤的靶标)的表 达的分析显示，在HEP-MTX细胞中与亲本HEP2细胞相比蛋白质显 著增加，表明可能有基因扩增(图6)并且mRNA明显增加(图7)。DHFR 蛋白质表达在短时间(24小时)暴露于10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤 后，而不是在长时间(6个月)暴露于10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤后 稍有增加，表明HEP-PDX细胞中10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤的获 得性抗性的分子机制不同于HEP-MTX细胞中的甲氨蝶呤抗性。
为了评价普拉曲沙抗性细胞对其它药物的交叉抗性，将DU145、 DU-PDX、HEP2和HEP-PDX细胞暴露于培美曲塞和5-FU持续72 小时。在亲本与PDX抗性细胞之间未观察到5-FU细胞毒性有明显差 异。培美曲塞暴露72小时对DU-PDX和HEP-PDX细胞的细胞毒性 仅略低于对这些细胞的亲本对应物的细胞毒性(数据未示)。这些数据 表明对普拉曲沙的获得性抗性可能不会转变成对培美曲塞和5-FU的 抗性，这可能是归因于这些化合物的作用机制不同。
普拉曲沙是一种对还原型叶酸载体1(RFC-1)蛋白和叶酰聚谷氨 酸合成酶(FPGS)具有高亲和力的抗叶酸剂，从而在肿瘤细胞中得以广 泛内化和积累。同时在各种恶性肿瘤中正将普拉曲沙作为单一药剂和 加以组合进行研究。为了指导进一步临床研发，需要组合治疗时对普 拉曲沙的敏感性与临床前数据的分子相关性。
普拉曲沙在15种人实体肿瘤细胞系中的9种中展示出有效的抗 增殖活性(IC50<0.1μM)。鉴定了以下两组不同的细胞系，其中普拉曲 沙IC50值的差异达>100倍：敏感性和相对抗性细胞系。就IC50值来 说的普拉曲沙的体外抗增殖作用平均起来为用甲氨蝶呤观察到的作 用的近乎10倍。当将这两种类似的抗叶酸剂的细胞毒性活性与包括 5-FU、5′-DFUR和培美曲塞在内的其它抗代谢物相比较时，普拉曲沙 看来在对5-FU和5′-DFUR的敏感性较差的多种细胞(如NSCLC HOP62和HOP92细胞系)中保持活性。类似地，培美曲塞的敏感性特 征不同于普拉曲沙的敏感性特征，这可以用这些化合物的作用的分子 机制不同来解释。
总之，在DU-PDX和HEP-PDX细胞系中对10-炔丙基-10-去氮 杂氨基蝶呤的获得性抗性与RFC-1减少和MDR1表达增加有关。在 这些模型中对MDR1进行药理学抑制并不改变10-炔丙基-10-去氮杂 氨基蝶呤抗性，表明MDR1在所观察到的抗性中的作用有限。在10- 炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤抗性细胞中未发现DHFRmRNA表达有 变化。相反，在HEP-MTX细胞中见到DHFRmRNA和蛋白质表达 显著增加。观察到10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤与甲氨蝶呤的获得 性抗性的机制不同；此数据表明可在甲氨蝶呤敏感性癌症以及在获得 性甲氨蝶呤抗性的背景下进一步研发10-炔丙基-10-去氮杂氨基蝶呤。
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