技术领域
本发明涉及一种用于向靶细胞或组织递送核酸的核酸递送用组合物 及载体组合物、使用其的药物组合物以及核酸递送方法。
背景技术
目前，在核酸治疗中，作为用于向靶细胞或组织递送核酸的载体，研 究了病毒载体和合成载体(非病毒性载体)。
一般认为，合成载体与现有的医疗中所研究的药物递送系统(DDS)一 样，虽然存在涉及毒性等的风险，但若与病毒载体相比，毒性较低而且对 承载的核酸的尺寸没有限制，以及可对载体进行精密的分子设计，因此， 持续进行大力的开发研究。
作为代表性的合成载体，可以举出：与带负电荷的DNA形成离子络 合物的阳离子脂质体或阳离子聚合物。
对于阳离子脂质体(脂转染物等)，在体外(in vitro)获得一定的成果(例 如参照非专利文献1)，但在体内(in vivo)未必能得到期望的效果。
另一方面，作为阳离子聚合物，研究有聚(L-赖氨酸)、DEAE-葡聚糖、 聚乙烯亚胺(例如参照非专利文献2)、壳聚糖(例如参照非专利文献3)等。 但是，这些阳离子聚合物不仅具有细胞毒性，而且核酸导入效率·基因表 达效率也不充分。
本申请发明人报告了通过使具有在侧链具有特定的胺基的阳离子聚 合物链段和聚乙二醇(PEG)等非荷电亲水性聚合物链段的嵌段共聚物进行 自组装而形成内包核酸的聚离子络合物(PIC)型的高分子胶束，在降低细胞 毒性的同时，可得到一定的核酸导入效率·基因表达效率(参照专利文献1： 日本特开2004-352972号公报)。但是，由这种PIC型高分子胶束构成的核 酸递送系统在核酸导入效率·基因表达效率方面有待改进。
另外，本申请发明人报告了通过将在侧链具有特定的胺基的阳离子均 聚物与核酸进行混合，可以显著地改善核酸导入效率·基因表达效率，同 时，也可以相对地抑制对于动物细胞(特别是哺乳类细胞)的毒性(参照专利 文献2：国际公开第2006/085664号小册子)。但是，对于由这种均聚物构 成的核酸递送系统，要求细胞毒性的进一步降低。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2004-352972号公报
专利文献2：国际公开第2006/085664号小册子
非专利文献
非专利文献1：C.F.Benett et al.，J.Drug Targeting，5，149(1997)
非专利文献2：O.Boussif et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，92，7297 (1995)
非专利文献3：S.C.Richardson et al.，Int.J.Pharm.178，(1999)231
发明内容
发明所要解决的课题
由以上的背景可知，仍然需要提供一种在降低细胞毒性的同时，显示 高核酸导入效率及基因表达效率的优异的核酸递送用组合物及其载体。
用于解决课题的方法
本申请发明人进行了潜心研究，结果发现，在由具有特定的阳离子聚 合物链段和非荷电亲水性聚合物链段的嵌段共聚物构成的聚离子络合物 (PIC)型的高分子胶束中，通过以特定的比例混合特定的阳离子均聚物，可 以得到兼具低细胞毒性和高核酸导入效率这样两种特性的优异的核酸递 送用组合物，直至完成了本发明。
即，本发明涉及一种核酸递送用组合物，其用于向靶细胞或组织递送 核酸，包含具有非荷电亲水性聚合物链段和阳离子聚合物链段的嵌段共聚 物、阳离子聚合物以及核酸，嵌段共聚物所具有的阳离子基团相对于嵌段 共聚物及阳离子聚合物所具有的总阳离子基团的摩尔百分率(B/H比)为 25％～90％。
本发明还涉及一种载体组合物，其用于向靶细胞或组织递送核酸，包 含具有非荷电亲水性聚合物链段和阳离子聚合物链段的嵌段共聚物以及 阳离子聚合物，嵌段共聚物所具有的阳离子基团相对于嵌段共聚物及阳离 子聚合物所具有的总阳离子基团的摩尔百分率(B/H比)为25％～90％。
本发明还涉及一种药物组合物，其用于核酸治疗，其中，所述医药组 合物包含所述核酸递送用组合物或所述载体组合物。
本发明还涉及一种方法，其用于向靶细胞或组织递送核酸，其中，所 述方法包括使所述核酸递送用组合物与靶细胞或组织进行接触。
本发明还涉及一种方法，其用于向靶细胞或组织递送核酸，其中，所 述方法包括使具有非荷电亲水性聚合物链段及阳离子聚合物链段的嵌段 共聚物和核酸组成的核酸递送用组合物以及阳离子聚合物与靶细胞或组 织进行接触，同时，将与靶细胞或组织进行接触时的核酸递送用组合物的 嵌段共聚物所具有的阳离子基团相对于核酸递送用组合物的嵌段共聚物 及阳离子聚合物所具有的总阳离子基团的摩尔百分率(B/H比)设为 25％～90％。
发明的效果
根据本发明的核酸递送用组合物及核酸递送方法，可在降低细胞毒性 的同时发挥优异的核酸导入效率。另外，根据本发明的载体组合物，可以 容易地得到这种优异的核酸递送用组合物。本发明的核酸递送用组合物及 载体组合物优选作为例如核酸治疗用的药物组合物。
附图简述
图1(a)及(b)是表示在各B/H比下的颗粒形状的透射电子显微镜照片；
图2是表示B/H比和Z-电位的关系的图；
图3是表示转染效率和B/H比及N/P比的关系的图；
图4表示细胞毒性和B/H比及N/P比的关系的图；
图5是表示肿瘤体积的经时变化的图；
图6是表示核酸递送用组合物的血中滞留性的图；
图7(a)～(d)均是表示肿瘤组织中的Venus的表达状况的CLSM(共聚焦 激光显微镜)照片，具体而言，图7(a)为对照、图7(b)为B/H比100％、图 7(c)为B/H比70％、图7(d)为B/H比50％的结果；
图8(a)及(b)是表示肿瘤组织的sFlt-1的表达状况的CLSM照片，图8(a) 为对照、图8(b)为B/H比70％的结果；
图9(a)是免疫染色后的肿瘤组织的血管内皮细胞的CLSM照片，图9(b) 是表示通过图9(a)的图像解析求出的血管密度的图；
图10是表示组合物的经肺给药时的转染效率和B/H比的关系的图；
图11(a)～(d)均是表示肺组织的免疫染色照片，具体而言，图11(a)为 B/H比100％、图11(b)为B/H比70％、图11(c)为B/H比50％、图11(d)为 对照的结果；
图12(a)～(d)均为表示mRNA的表达量的图，具体而言，图12(a)为IL-6、 图12(b)为TNF-α、图12(c)为Cox-2、图12(d)为IL-10的mRNA的mRNA 的表达量。
具体实施方式
根据本发明，可提供一种组合物(本发明的核酸递送用组合物)，其用 于向靶细胞或组织递送核酸，包含后述的特定的嵌段共聚物及阳离子聚合 物以及核酸，同时嵌段共聚物和阳离子聚合物的比率在后述的特定的范围 内。
根据本申请发明人的研究，通过以后述的B/H比满足特定范围的比值 的方式使用后述特定的嵌段共聚物和阳离子聚合物，可以与由嵌段共聚物 单独构成的PIC胶束型核酸递送系统(专利文献1等)同等程度地抑制对于 动物细胞(特别是哺乳类细胞)的毒性使其较低，同时可以与阳离子均聚物 单独构成的核酸递送系统(专利文献2等)同等程度地改善核酸导入效率。 即，根据本发明，可提供一种只是兼具现有的嵌段共聚物单独构成的核酸 递送系统及阳离子均聚物单独构成的核酸递送系统两者的优点的核酸递 送用组合物。这种效果无法由涉及现有的核酸递送系统的见解的简单拼凑 进行预测，而是相乘的效果。
另外，根据本发明，也可提供一种组合物(本发明的载体组合物)，其 作为向靶细胞或组织递送核酸的载体，包含后述特定的嵌段共聚物及阳离 子聚合物以及核酸，同时嵌段共聚物和阳离子聚合物的比率在后述特定的 范围内。通过使核酸承载于这种载体组合物，可得到本发明的核酸递送用 组合物。
[嵌段共聚物]
本发明中所使用的嵌段共聚物具有非荷电亲水性聚合物链段和阳离 子聚合物链段。嵌段共聚物可以仅使用1种，也可以以任意的组合和比率 使用2种以上。
(非荷电亲水性聚合物链段)
非荷电亲水性聚合物链段为具有非荷电且亲水性的性质的聚合物链 段。在此所谓“非荷电”是指链段整体为中性。作为例子，可以举出：链 段不具有正·负电荷的情况。另外，即使在链段在分子内具有正·负电荷 的情况下，如果局部的实际电荷密度不高，而且能够将链段整体的电荷中 和至不会妨碍高分子胶束的形成的程度，则仍然符合“非荷电”。另外， 所谓“亲水性”是指对于水性介质显示溶解性。
非荷电亲水性聚合物链段的种类没有限定。可以为由单一的重复单元 构成的链段，也可以为以任意的组合及比率含有二种以上的重复单元的链 段。作为非荷电亲水性聚合物链段的实例，可以举出：聚亚烷基二醇、聚 (2-噁唑啉)、多糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚甲基丙 烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)、 等电点7附近的肽·蛋白质及它们的衍生物等。其中，优选聚亚烷基二醇、 聚(2-噁唑啉)等，特别优选聚亚烷基二醇。作为聚亚烷基二醇，可以举出： 聚乙二醇、聚丙二醇等，但优选聚乙二醇(PEG)。
非荷电亲水性聚合物链段的分子量没有限定，但从有效地制造高分子 胶束的观点考虑，优选具有规定的范围内的分子量。具体的分子量的范围 会根据非荷电亲水性聚合物链段的种类及与阳离子聚合物链段的组合等 而不同，但在使用聚乙二醇作为非荷电亲水性聚合物链段的情况下，其分 子量(Mw)优选为500以上，更优选为1000以上，另外，优选为40000以 下，更优选为30000以下的范围。非荷电亲水性聚合物链段的重复单元数 也没有限制，但通常以非荷电亲水性聚合物链段的分子量能够满足所述的 分子量范围的方式，根据其重复单元的种类而决定。
通过使用满足所述条件的非荷电亲水性聚合物链段，可防止嵌段共聚 物在水性溶液中的聚集·沉淀而使其稳定化，能够有效地构建可作为载体 组合物起作用的高分子胶束。
(阳离子聚合物链段)
阳离子聚合物链段为具有阳离子基团并显示阳离子性(正离子性)的聚 合物链段。但是，阳离子聚合物链段也可以在不妨碍高分子胶束的形成的 范围内具有一些阴离子基团。
阳离子聚合物链段的种类也没有限定。可以为由单一的重复单元构成 的链段，也可以为以任意的组合及比率含有二种以上的重复单元的链段。 作为阳离子聚合物链段，优选聚胺等，特别优选在侧链具有氨基的聚(氨基 酸或其衍生物)。这种聚(氨基酸或其衍生物)可以由1种氨基酸或其衍生物 构成，也可以以任意的组合及比率含有2种以上的氨基酸或其衍生物。作 为构成这种聚(氨基酸或其衍生物)的氨基酸或其衍生物的例子没有限制， 可以举出：含氨基天冬酰胺、含氨基谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸 等。其中，特别优选含氨基天冬酰胺、含氨基谷氨酰胺。
阳离子聚合物链段的分子量没有限定，但从有效地制造高分子胶束的 观点考虑，优选具有规定的范围内的分子量。阳离子聚合物链段的重复单 元数也没有限制，但通常能够以阳离子聚合物链段的分子量满足规定的分 子量范围的方式根据其重复单元的种类而确定。具体而言，在使用聚天冬 氨酸衍生物或聚谷氨酸衍生物作为阳离子聚合物链段的情况下，其重复单 元数优选为5以上，更优选为10以上，另外，优选为300以下，更优选 为200以下的范围。
通过使用满足所述条件的阳离子聚合物链段，可以防止嵌段共聚物在 水性溶液中的聚集·沉淀而使其稳定化，能够有效地构建可作为载体组合 物起作用的高分子胶束。
(非荷电亲水性聚合物链段和阳离子聚合物链段的组合)
非荷电亲水性聚合物链段和阳离子聚合物链段的组合没有限制，可以 组合任意的非荷电亲水性聚合物链段和任意的阳离子聚合物链段。
非荷电亲水性聚合物链段及阳离子聚合物链段的个数也是任意的，可 以分别为1个或2个以上，在2个以上的情况下，个数可以彼此相同也可 以不同。通常优选对于1个非荷电亲水性聚合物链段键合1个阳离子聚合 物链段。但是，从在高分子胶束内保持大量的核酸的观点考虑，也优选对 于1个非荷电亲水性聚合物链段键合2个以上阳离子聚合物链段的形式。
(连接基团)
非荷电亲水性聚合物链段和阳离子聚合物链段的键合形态也没有限 制，可以进行直接键合，也可以经由连接基团进行键合。
作为连接基团的例子，可以举出具有与非荷电亲水性聚合物链段及阳 离子聚合物链段的总个数对应的化合价的烃基。作为连接基团的烃基可以 为脂肪族烃基，也可以为芳香族烃基，还可以为它们连接而成的烃基，在 脂肪族烃基的情况下，可以为饱和烃基，也可以为不饱和烃基，另外，可 以为直链烃基，也可以为支链烃基，还可以为环状烃基。作为连接基团的 烃基的分子量没有限制，但通常为5000以下，优选为1000以下。对作为 连接基团的烃基的例子而言，可以列举为：没食子酸衍生物、3，5-二羟基 苯甲酸衍生物、甘油衍生物、环己烷衍生物、L-赖氨酸等，但优选3，5-二 羟基苯甲酸衍生物等。
作为连接基团的其它的例子，可以举出二硫基。二硫基可用于连接1 个非荷电亲水性聚合物链段和1个阳离子聚合物链段。通过经由二硫基连 接非荷电亲水性聚合物链段和阳离子聚合物链段，利用高分子胶束所放置 的环境或来自外部的作用使二硫基开裂，可以改变高分子胶束的形态及性 质。一般认为，若对其进行利用，则通过在生物体内的特定部位使二硫基 开裂，也可以促进高分子胶束内所内包的药物(对该形式在后文进行描述) 的部位特异性释放。
另外，非荷电亲水性聚合物链段和阳离子聚合物链段的比率也是任意 的，但从有效地制造高分子胶束的观点考虑，优选将高分子胶束中所含的 非荷电亲水性聚合物链段的分子量比率设为规定的范围内。关于具体的比 率，优选同时考虑核酸的量后进行确定，因此，在[核酸]的栏中进行后述。
(嵌段共聚物的实例〕
作为本发明的嵌段共聚物的优选的实例，可以举出具有聚乙二醇(PEG) 链段作为非荷电亲水性聚合物链段以及具有聚(氨基酸或其衍生物)链段作 为阳离子聚合物链段的下列式(I)～(IV)所示的嵌段共聚物。
[化学式1]
(式(I)及(II)中，
R1表示氢原子、或未取代或者取代的直链或者支链的C1-12烷基，
R2表示亚甲基或亚乙基，
R3表示氢原子、保护基、疏水性基团或聚合性基团，
R4与R5相同或为引发剂残基，
R5分别独立地表示羟基、氧基苄基或-NH-(CH2)a-X基，
X分别独立地表示：
pKa值为7.4以下的大体积的胺类化合物残基，
含有伯胺、仲胺、叔胺或者季铵盐中的一种或二种以上的胺类化合物 残基，
或非胺类化合物残基，
L1及L2分别独立地表示连接基团，
a为1～5的整数。
m为5～20,000的整数，
n为2～5,000的整数，
x为0～5,000的整数。
其中，x不大于n。)
[化学式2]
(式(III)及(IV)中，
R1表示氢原子、或未取代或者取代的直链或者支链的C1-12烷基，
R2表示亚甲基或亚乙基，
R3表示氢原子、保护基、疏水性基团或聚合性基团，
R4与R5相同或为引发剂残基，
R5分别独立地表示羟基、氧基苄基或-NH-(CH2)a-X基，
X分别独立地表示：
pKa值为7.4以下的大体积的胺类化合物残基，
含有伯胺、仲胺、叔胺或者季铵盐中的一种或二种以上的胺类化合物 残基，或
非胺类化合物残基，
L1及L2分别独立地表示连接基团，
a为1～5的整数，
R6分别独立地为氢原子或保护基，
m为5～20,000的整数，
n为2～5,000的整数，
y为0～5,000的整数，
z为0～5,000的整数，
其中，y+z不大于n。)
所述式(I)～(IV)中的各基团的详细的定义如下所述。
R1表示氢原子或未取代或者取代的直链或者支链的C1-12烷基，作为 C1-12烷基，可以举出：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、 叔丁基、正戊基、正己基、癸基、十一烷基等。作为取代C1-12烷基时的取 代基，可以举出：缩醛化甲酰基、氰基、甲酰基、羧基、氨基、C1-6烷氧 羰基、C2-7酰胺基、三-C1-6烷基硅氧基(在此，3个烷基可以相同也可以不 同)、硅氧基或甲硅烷基氨基。
在所述取代基为缩醛化甲酰基的情况下，通过在温和的酸性条件下进 行水解，可以转化成作为其它取代基的甲酰基(-CHO：醛基)。在这种甲酰 基、羧基或氨基存在于高分子胶束的外缘部附近的情况下，可以经由这些 基团将其它蛋白质等共价键合于高分子胶束。作为这种蛋白质等的例子， 可以举出：抗体或者具有其特异结合性的片段(F(ab’)2、F(ab)、等)、或可 对高分子胶束赋予其它的功能性或者靶指向性的蛋白质等。作为在一个末 端具有这种官能团的PEG链段的制法，可以列举WO96/32434、 WO96/33233、WO97/06202中记载的嵌段共聚物的PEG链段的制法。
R2表示亚甲基或亚乙基。聚(氨基酸或其衍生物)链段的含有R2的重复 单元在R2为亚甲基的情况下，与天冬氨酸衍生物单元相当，在R2为亚乙 基的情况下，与谷氨酸衍生物单元相当。在聚(氨基酸或其衍生物)链段具 有亚甲基及亚乙基两者作为R2的情况下，天冬氨酸衍生物单元及谷氨酸衍 生物单元可以分别独立地形成嵌段而存在，也可以无规则地混合存在。
R3表示氢原子、保护基、疏水性基团或聚合性基团。作为保护基，可 以举出：C1-6烷基羰基，优选为乙酰基。作为疏水性基团，可以举出：苯、 萘、蒽、芘等衍生物。作为聚合性基团，可以举出：甲基丙烯酰基、丙烯 酰基。在通式(I)或(III)的共聚物具有这种聚合性基团的情况下，其共聚物 可作为所谓大单体(マクロマ一)进行使用。例如形成高分子胶束后，也 可以根据需要使用其它的共聚单体，经由这些聚合性基团进行交联。
R4与R5同样地为羟基、氧基苄基或-NH-(CH2)a-X基，或者引发剂残 基。所谓R4为引发剂残基的情况，是指在通过后述的第二种方法(即，使 用低分子的引发剂使受保护氨基酸的NCA聚合而合成聚(氨基酸或其衍生 物)链段后，与PEG链段进行键合的方法)制造通式(I)～(IV)的嵌段共聚物 的情况下，R4采用来自使用的引发剂的结构的情况。作为引发剂残基的实 例，可以举出：-NH-R9。在此R9为未取代或取代的直链或支链的C1-20烷 基。
R5分别独立地为羟基、氧基苄基、-NH-(CH2)a-X基，但优选其大部分 为(通常为85％以上，优选为95％以上，更优选为98％以上，特别优选为 100％)-NH-(CH2)a-X基。
只要所述嵌段共聚物满足本发明的条件(或按照本发明的目的)，对X 的选择就没有限制，但通常从以下的A组～E组中归类的残基中进行选择。
·A组：pKa值为7.4以下的大体积的胺类化合物残基：
[化学式3]
在A组中，X2为氢原子或C1-6烷基。
·B组：含有伯胺和仲胺、叔胺或季铵盐中的两者的胺类化合物残基：
[化学式4] 或——(NR7(CH2)c)e——NH2
在B组中，X3为氨基C1-6烷基，R7为氢原子或甲基，d及e分别独立 地为1～5的整数。
·C组：仅含有伯胺的胺类化合物残基：
[化学式5]
——(CH2)r——NH2
在C组中，f为0～15的整数。
·D组：仅含有仲胺、叔胺或季铵盐且未包括在A组中的胺化合物残 基：
[化学式6]
——(NR7(CH2)d)e——NHR8——N(CH3)2或——N(CH2CH3)2
在D组中，d及e分别独立地为1～5的整数，R8为Z基、Boc基、乙 酰基、三氟乙酰基等保护基。
·E组：非胺类化合物残基：
[化学式7]
——(CH2)gCH3或
在E组中，g为0～15的整数。
在通式(I)或(II)的嵌段共聚物的情况下，作为X，可以仅含有选自A 组及B组的残基中的任意一种残基，而选择C组的残基时则必须同时含有 选自A组及D组的残基中的至少一种残基，而选择D组的残基时则必须 同时含有选自B组及C组的残基中的至少一种残基。另外，可以为了改变 共聚物的物理性质而含有E组的残基，但除E组以外的部分则必须满足所 述条件。
在通式(III)或(IV)的嵌段共聚物的情况下，若R6中至少有1个以上为 氢原子，可以仅含有选自A组、B组及D组的残基中的任一个残基。C组 及E组与所述条件相同。
R6分别独立地为氢原子或保护基，但优选其大部分(通常为85％以上， 优选为95％以上，更优选为98％以上，特别优选为100％)为氢原子。作为 保护基，可以举出：通常可用作氨基的保护基的Z基、Boc基、乙酰基、 三氟乙酰基等。
L1及L2分别独立地表示连接基团。L1及L2的种类没有限制，但作为 L1，优选以-(CH2)b-NH-所表示的基团(其中，b为1～15的整数)，作为L2， 优选以-(CH2)c-CO-所表示的基团(其中，c为1～15的整数)。
m通常为5以上，优选为10以上，更优选为40以上，另外，通常为 20,000以下，优选为3,000以下、更优选为2,000以下，特别优选为1,000 以下的整数。
n通常为5以上，优选为10以上，更优选为40以上，另外，通常为 5,000以下，更优选为1,000以下，更优选为500以下，特别优选为300以 下的整数。
x通常为0以上，优选为1以上，更优选为10以上，另外，通常为 5,000以下的整数。其中，x≤n。
y及z分别独立地通常为0以上，优选为1以上，另外，通常为5,000 以下的整数。其中，y+z≤n。特别优选为10≤y≤n-10、10≤z≤n-10。
另外，在通式(I)～(IV)中，在聚(氨基酸或其衍生物)链段具有多种重复 单元的情况下，各重复单元可以每种形成嵌段，也可以无规则地混合存在。
另外，在通式(I)～(IV)中，聚(氨基酸或其衍生物)链段所具有的阳离子 基团可以为游离阳离子基团，也可以形成盐。此时，作为形成盐的平衡离 子，没有限制，但可以举出：Cl-、Br-、I-、(1/2SO4)-、NO3-、(1/2CO3)-、(1/3PO4)-、 CH3COO-、CF3COO-、CH3SO3-、CF3SO3-等。
通式(I)～(IV)的嵌段共聚物的制法没有限定，但作为例子可以举出以 下说明的2种方法。
作为第一种方法，可以举出如下方法：使用在末端具有氨基的PEG衍 生物，自所述氨基末端使β-苄基-L-天冬氨酸盐、Nε-Z-L-赖氨酸等受保护 氨基酸的N-羧酸酐(NCA)聚合而合成嵌段共聚物，然后将得到的聚(氨基酸 衍生物)链段的受保护氨基酸侧链转化为所要的氨基酸侧链。此时，得到的 嵌段共聚物的结构为通式(I)或(III)。
作为第二种方法，也可以举出如下方法：合成具有所要的氨基酸侧链 的聚(氨基酸或其衍生物)链段后，使其与PEG链段进行键合。此时，得到 的嵌段共聚物的结构为通式(I)～(IV)中的任一种。
对使用第一种及第二种方法中的任意方法的情况而言，在之后将所要 的氨基酸侧链导入聚(氨基酸或其衍生物)链段的情况下，其手法也是任意 的，可以举出例如在聚天冬氨酸结构的情况下，通过日本专利第2777530 号公报等中记载的聚(β-苄基-L-天冬氨酸盐)部分的氨基分解实现的从酯向 酰胺的转化反应等。作为别的方法，也可以举出如下方法：将苄基酯通过 催化还原、酸、碱等进行水解，转化成聚天冬氨酸或聚谷氨酸后，使用凝 聚剂等使具有这些残基的化合物进行键合。
另外，对使用第一种及第二种方法中的任意方法的情况而言，在之后 将保护基、疏水性基团、聚合性基团等导入嵌段共聚物的末端(R1、R3、R5、 R6)的情况下，其手法也是任意的，可以举出：使用酸卤化物的方法、使用 酸酐的方法、使用活性酯的方法等通常的合成中所使用的手法。
[阳离子聚合物]
阳离子聚合物为具有阳离子基团且显示阳离子性(正离子性)的聚合 物。但是，阳离子聚合物在不妨碍高分子胶束的形成的范围内也可以具有 一些阴离子基团。
阳离子聚合物的种类也没有限定。可以为由单一的重复单元构成的聚 合物，也可以为以任意的组合及比率含有二种以上的重复单元的链段。作 为阳离子聚合物，优选聚胺等，特别优选在侧链具有氨基的聚氨基酸或其 衍生物。作为在侧链具有氨基的聚氨基酸或其衍生物，可以举出：聚天冬 酰胺、聚谷氨酰胺、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸、及这些的衍生物等， 但特别优选聚天冬酰胺衍生物及聚谷氨酰胺衍生物。
阳离子聚合物的分子量没有限定，但从有效地制造均质的高分子胶束 的观点考虑，优选具有规定的范围内的分子量。阳离子聚合物的重复单元 数也没有限制，通常能够以阳离子聚合物的分子量满足规定的分子量范围 的方式根据其重复单元的种类而决定。具体而言，在使用聚天冬氨酸衍生 物或聚谷氨酸衍生物作为阳离子聚合物的情况下，其重复单元数优选为5 以上，更优选为10以上，另外，优选为300以下，更优选为200以下的 范围。
通过使用满足所述条件的阳离子聚合物，可以防止嵌段共聚物在水性 溶液中的聚集·沉淀而使其稳定化，能够有效地构建可作为载体组合物起 作用的高分子胶束。
[阳离子聚合物的实例]
作为本发明的阳离子聚合物的优选的实例，可以举出：下述式(I’)～ (IV’)所示的聚(氨基酸或其衍生物)。
[化学式8]
(式(I’)及(II’)中，R2、R3、R4、R5、n及x表示与式(I)及(II)的同符号的 基团相同的定义。)
[化学式9]
(式(III’)及(IV’)中，R2、R3、R4、R5、R6、n、x、y及z表示与式(III) 及(IV)的同符号的基团相同的定义。)
式(I’)～(IV’)中的各基团的详细情况、式(I’)～(IV’)所示的聚(氨基酸或 其衍生物)的详细情况以及其制造方法的详细情况见上述关于式(I)～(IV) 的嵌段共聚物的聚(氨基酸或其衍生物)链段的情况。
另外，在式(I’)～(IV’)中R5为-NH-(CH2)a-X基的情况下，通常可以从 所述的A组～E组中归类的残基中选择X，其中，优选B组，特别优选以 下的胺类化合物残基。
[化学式10]
——(NR7(CH2)d)e——NH2
(式中，R7为氢原子或甲基，d及e分别独立地为1～5的整数。)
[B/H比]
本发明的核酸递送用组合物及载体组合物所具有的嵌段共聚物和阳 离子聚合物的比率通过嵌段共聚物所具有的阳离子基团相对于嵌段共聚 物及阳离子聚合物所具有的总阳离子基团的摩尔百分率(在本说明书中有 时将其表示为“B/H比”。)来表示。具体而言，由以下的式子表示。
[数学式1]
在本发明中，将所述B/H比通常设为超过25％，优选设为30％以上， 更优选设为40％以上，进一步优选设为50％以上，另外，通常设为90％以 下，优选设为85％以下，更优选设为80％以下的范围。通过将B/H比设定 在所述范围内，可以得到兼具低细胞毒性和高核酸导入效率这样两种特性 的优异的核酸递送用组合物。
在本发明中，通过将B/H比设定在所述范围内得到这样的效果的原因 尚未明确，但通过将B/H比设为所述下限值以上的范围，可以将Z-电子维 持在比较接近0的值，并可以充分地抑制毒性，另一方面，通过将B/H比 设为所述上限值以下的范围，可以将颗粒形状维持在球状或大致球状，并 可以提高培养基中或血中的颗粒的稳定性，进而可以充分发挥核酸导入效 率，结果，推测可同时获得低细胞毒性和高核酸导入效率。
另外，在本发明的核酸递送用组合物及载体组合物含有2种以上的嵌 段共聚物及/或2种以上的阳离子聚合物的情况下，只要这些2种以上的全 体嵌段共聚物及/或2种以上的全体阳离子聚合物的B/H比满足所述范围即 可。
[核酸]
本发明的核酸递送用组合物中所使用的核酸没有限制。即，作为核酸， 可以举出：DNA、RNA、天然或非天然的核酸类似物(例如肽核酸等)、改 变核酸、修饰核酸等，但也可以为任一种。另外，核酸可以为单链，也可 以为双链，对于是否编码蛋白质及是否具有其它的功能也没有限制。
但是，作为核酸，优选为在向生物体内递送时可对生物体、组织、细 胞等起到某些作用的功能性核酸。作为功能性核酸，可以举出：质粒DNA、 siRNA、miRNA(微RNA)、反义RNA、反义DNA、诱饵核酸、核酶、DNA 酶、各种抑制基因(癌抑制基因等)、功能性的改变核酸·修饰核酸(例如核 酸的磷酸部分被改变成硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、磷酸三酯、磷酰胺酯等 而成的核酸或面向高分子胶束稳定化等的用途而键合有胆固醇或维生素E 等疏水性官能团的核酸)等。这些可以根据核酸递送用组合物的用途来选 择。
作为质粒DNA，只要是在靶细胞·组织中可发挥期望的功能的质粒 DNA即可。这种质粒DNA已知有多种，只要是该领域从业人员就可根据 核酸递送用组合物的用途选择期望的质粒DNA。
另外，作为siRNA，只要是可利用RNA干扰(RNAi)抑制靶基因的表 达的siRNA即可。作为RNA干扰的靶基因，可优选举出：癌(肿瘤)基因、 抗凋亡基因、细胞周期相关基因、生长信号基因等。另外，siRNA的碱基 长度没有限定，但通常低于30个碱基，优选为19～21个碱基。
核酸可以单独使用1种，也可以以任意的组合及比率使用2种以上。
另外，由于核酸分子为聚阴离子，因此，可以通过静电的相互作用与 所述嵌段共聚物的聚阳离子部分的侧链进行结合(聚集)。
[N/P比]
核酸相对于嵌段共聚物及阳离子聚合物的比率以[嵌段共聚物及阳离 子聚合物所具有的阳离子基团]相对于[核酸所具有的磷酸基]的摩尔比(在 本说明书中，有时将其表示为“N/P比”。)表示。
[数学式2]
在本发明中，所述N/P比没有限定，但通常为2以上，优选为4以上， 更优选为6以上，另外，通常为200以下，优选为100以下，更优选为50 以下的范围。本发明的核酸递送用组合物与现有的PIC型高分子胶束型的 核酸递送用组合物相比核酸导入效率优异，因此，能够以比现有少的核酸 使用量(即，比现有低的N/P比)有效地递送核酸，并使基因表达。
[其它成分]
在制造本发明的核酸递送用组合物及载体组合物时，除嵌段共聚物、 阳离子聚合物及核酸以外，可以在不妨碍高分子胶束的形成或者不会降低 稳定性的范围内添加其它成分。其它成分没有限制，作为实例，可以举出： 非荷电聚合物或荷电聚合物、荷电纳米颗粒等。
作为非荷电聚合物或荷电聚合物，可以举出：所述嵌段共聚物及阳离 子聚合物以外的任意的非荷电聚合物或荷电聚合物。
作为荷电纳米颗粒，可以举出在表面具有电荷的金属纳米颗粒等。
所述其它成分可以单独使用一种，也可以以任意的组合及比率并用二 种以上。
所述其它成分的使用量也没有限制，优选将其抑制在不妨碍高分子胶 束的形成的程度。具体而言，理想的是，相对于本发明的组合物的总重量， 通常设为30％以下，优选设为20％以下，更优选设为10％以下。
[载体组合物的制备法]
本发明的载体组合物通常通过混合所述嵌段共聚物及所述阳离子聚 合物、以及根据需要使用的其它成分来制备。
具体而言，准备含有所述嵌段共聚物的第一水性溶液和含有所述阳离 子聚合物的第二水性溶液。第一及第二水性溶液可以根据需要进行过滤来 进行精制。
第一水性溶液中的嵌段共聚物的浓度及第二水性溶液中的阳离子聚 合物的浓度没有限定，可以考虑嵌段共聚物和阳离子聚合物的比率、嵌段 共聚物及阳离子聚合物在水性溶液中的溶解度、高分子胶束的形成效率等 条件来酌情决定。
第一及第二水性溶液的溶剂只要为水性溶剂，则其种类没有限定。优 选为水，但也可以在不妨碍高分子胶束的形成的范围内使用在水中混合了 其它成分的溶剂，例如生理盐水、水性缓冲液、水和水溶性有机溶剂的混 合溶剂等。作为水性缓冲液，可以举出：10mM HEPES缓冲液等。
第一及第二水性溶液的pH可以在不妨碍高分子胶束的形成的范围内 适宜调整，但优选为pH5以上，更优选为pH6.5以上，另外，优选为pH9 以下，更优选为pH7.5以下。pH的调整可以通过使用缓冲液作为溶剂而容 易地进行。将第一及第二水性溶液的pH进行调整而使得对于保持嵌段共 聚物及阳离子聚合物的荷电状态并且有效地形成高分子胶束有利。
第一及第二水性溶液的盐浓度可以在不妨碍高分子胶束的形成的范 围内适宜调整，但优选为5mM以上，更优选为10mM以上，另外，优选 为300mM以下，更优选为150mM以下。
第一及第二水性溶液的混合方法也没有限定。可以在第一水性溶液中 加入第二水性溶液，也可以在第二水性溶液中加入第一水性溶液。另外， 还可以在容器中同时加入第一及第二水性溶液进行混合。可以适当搅拌所 得到的第一及第二水性溶液的混合液。
第一及第二水性溶液的混合时的温度只要在不妨碍高分子胶束的形 成的范围内就没有限定，但优选考虑嵌段共聚物及阳离子聚合物的溶解度 而进行设定，嵌段共聚物及阳离子聚合物的溶解度与温度有关。具体而言， 通常为0℃以上，另外，优选为60℃以下，更优选为50℃以下。
在混合后，可以将含有所形成的高分子胶束的载体组合物立即供于期 望的用途，但为了使体系平衡，也可以设置静置混合液的时间。静置混合 液的时间根据高分子胶束的形成效率等条件而不同，但优选为50小时以 下，更优选为30小时以下。但是，在如上所述未使用交联剂的情况下， 由于存在所形成的高分子胶束的直径经时增大的倾向，有时会优选不设置 静置时间。
在使用嵌段共聚物及阳离子聚合物以外的其它成分的情况下，在所述 第一及第二水性溶液混合时或混合后，加入该其它成分进行混合即可。可 以将该其它成分直接加入进行混合，也可以制备含有该其它成分的水性溶 液，将其进行混合。该其它成分的水性溶液制备时的水性溶剂、pH、温度、 离子强度等制备条件与上述关于第一及第二水性溶液的条件相同。
另外，可以进一步适当附加透析、稀释、浓缩、搅拌等操作。
[核酸递送用组合物的制备法]
本发明的核酸递送用组合物通常可以通过将所述核酸与(i)所述嵌段共 聚物及阳离子聚合物以及根据需要使用的其它成分进行混合或者与(ii)预 先制备的本发明的载体组合物进行混合来制备。
在(i)的情况下，在上述载体组合物的制备步骤中，在混合所述第一水 性溶液(嵌段共聚物的水性溶液)和第二水性溶液(日离子聚合物的水性溶 液)时，可以进一步加入核酸进行混合。另外，也可以在第一水性溶液或第 二水性溶液中预先加入核酸进行混合后，混合第一水性溶液和第二水性溶 液。
在(ii)的情况下，在将所述第一水性溶液(嵌段共聚物的水性溶液)和第 二水性溶液(日离子聚合物的水性溶液)进行混合而得到的载体组合物中进 一步加入核酸进行混合即可。利用第一及第二水性溶液的混合制备载体组 合物后，可以立即加入核酸进行混合，但也可以静置混合液使体系平衡后， 进一步加入核酸进行混合。
在(i)及(ii)中的任意情况下，均可以直接加入核酸进行混合，但也可以 制备含有核酸的水性溶液(第三水性溶液)并将其加入进行混合。制备第三 水性溶液时的水性溶剂、pH、温度、离子强度等制备条件与上述关于第一 及第二水性溶液的制备条件相同。
另外，也可以进一步适当附加透析、稀释、浓缩、搅拌等操作。
[核酸递送用组合物及载体组合物的结构]
本发明的核酸递送用组合物及载体组合物的形状没有限定，但通常为 球状或大致球状。
本发明的核酸递送用组合物及载体组合物的粒径根据嵌段共聚物及 阳离子聚合物的种类及量比、其它成分的有无、核酸递送用组合物及载体 组合物的周边环境(水性介质的种类)等而不同，但优选为10nm以上，更优 选为50nm以上，另外，优选为200nm以下，更优选为150nm以下。
另外，虽然在生理环境或生理盐水中等盐存在的条件下，核酸递送用 组合物及载体组合物的粒径存在经时增大的倾向，但可以通过导入交联剂 来防止粒径的增大。
本发明的核酸递送用组合物及载体组合物的颗粒内结构尚未明确，但 如果考虑后述的Z-电位接近于0，则可如下进行推测。
关于载体组合物，一般认为是嵌段共聚物的亲水性链段密集存在于颗 粒外壳周边，同时嵌段共聚物的阳离子聚合物链段及阳离子聚合物主要存 在于颗粒内部的具有PIC型高分子胶束的结构的物质。
另外，关于核酸递送用组合物也同样地一般认为是嵌段共聚物的亲水 性链段密集存在于颗粒外壳周边，另一方面，嵌段共聚物的阳离子聚合物 链段及阳离子聚合物与核酸静电结合且主要在颗粒内侧以被内包·承载的 状态下存在的具有PIC型高分子胶束的结构的物质。
[核酸递送用组合物及载体组合物的用途]
本发明的核酸递送用组合物可以用于在体外或体内将核酸向靶细胞 或组织进行递送。利用本发明的核酸递送用组合物，可以将难以在稳定的 状态下向靶细胞内进行递送的核酸容易地在稳定的状态下进行递送，同时 可以抑制细胞毒性。另外，可以作为如下方法使用：利用细胞内外的pH 的变化，将内包·承载于核酸递送用组合物的颗粒内部承载的核酸有效地 导入靶细胞内。进而，在使用编码蛋白质的基因作为核酸并将其向细胞或 组织递送而使其表达的情况下，通过使用本发明的核酸递送用组合物，可 以得到高基因表达效率。
使用本发明的核酸递送用组合物向靶细胞或组织递送核酸时，核酸递 送用组合物处于能够与靶细胞或组织进行接触的状态即可。
在体外实现本发明的核酸递送用组合物与靶细胞或组织的接触时，在 本发明的核酸递送用组合物的存在下对靶细胞或组织进行培养，或在靶细 胞或组织的培养物中添加核酸递送用组合物即可。
在体内实现本发明的核酸递送用组合物与靶细胞或组织的接触时，通 过遗传疗法等该技术领域中所常用的给药方法，对需要导入该核酸的个体 (或应治疗的个体)给药本发明的核酸递送用组合物即可。作为这样的个体， 没有限定，可以举出：人、小鼠、大鼠、兔子、狗、猫、猴、牛、马、猪、 鸟类等。作为给药方法，可以举出：向靶细胞或组织的附近或组织内直接 导入或移植，静脉注射、动脉注射、肌肉注射、经口给药、经肺给药等。 给药量、给药次数及给药周期等各条件可以根据受试动物的种类及状态等 酌情设定。
另外，特别是肺对于外来异物的敏感性较高，使用现有的DDS的药 物递送有时会引起炎症，经肺给药存在极大困难，但根据本发明的核酸递 送用组合物，可以在抑制毒性使其较低的同时得到高基因表达效率，因此， 也可适用于经肺给药。
另外，本发明的载体组合物通过承载核酸而作为本发明的核酸递送用 组合物，可用于与所述核酸递送用组合物同样的用途。关于承载核酸的手 法如[核酸递送用组合物的制备法]中所述。
[药物组合物]
根据本发明，还可以提供一种包含本发明的核酸递送用组合物或载体 组合物的药物组合物(本发明的药物组合物)。本发明的药物组合物例如可 以用于将成为各种病因的细胞或组织作为靶，递送·导入所要的核酸的治 疗(基因治疗)。
作为本发明的药物组合物的给药对象的个体，与所述核酸递送用组合 物的个体相同。作为通过本发明的药物组合物而成为治疗对象的疾病，没 有限制，可以举出：癌(例如肺癌、胰腺癌、脑瘤、肝癌、乳腺癌、大肠癌、 成神经细胞瘤及膀胱癌等)、循环器官疾病、运动器官疾病、及中枢系统疾 病等。
本发明的药物组合物除本发明的核酸递送用组合物或载体组合物以 外，也可以含有药剂制造上一般所使用的其它成分。作为其它成分的例子， 可以举出：赋形剂、增量剂、填充剂、增量剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、 润滑剂、表面活性剂、分散剂、缓冲剂、保存剂、溶解辅助剂、防腐剂、 矫味矫臭剂、无痛剂、稳定剂及等渗剂等。这样的其它成分可以单独使用 1种，也可以以任意的组合及比率使用2种以上。这些其它成分的种类及 使用量等的详细情况，只要为该领域从业人员，就可根据药物组合物的目 的、用途、使用方法等酌情决定。
本发明的药物组合物的形式也是任意的，但通常采用静脉注射剂(包含 点滴)，例如以单位给药量安瓿或多给药量容器的状态等进行提供。
本发明的药物组合物的使用方法也是任意的。只要是含有核酸递送用 组合物的药物组合物就可以直接给药。在含有载体组合物且不含有核酸的 药物组合物的情况下，使用前与核酸混合，在载体组合物中承载核酸后， 供于给药即可。
[核酸递送方法]
另外，根据本发明，可以提供一种在体外或体内向靶细胞或组织递送 核酸的方法(本发明的核酸递送方法)。在本发明的核酸递送方法中包含以 下的(1)(2)的方法。
(1)使用本发明的核酸递送用组合物或药物组合物的方法
在本方法中，使用之前说明的本发明的核酸递送用组合物或药物组合 物，使其在体外或体内与靶细胞或组织进行接触，由此向靶细胞或组织递 送核酸。关于核酸递送用组合物及药物组合物的详细情况、与靶细胞或组 织的接触方法等如上所述。根据本方法，可以抑制细胞毒性使其较低并可 以以高效率进行核酸导入，如上所述。
(2)使含有嵌段共聚物和核酸的组合物在原位(in situ)与阳离子聚合物 共存的方法
本方法为如下方法：使用从本发明的核酸递送用组合物或药物组合物 中除去了阳离子聚合物的组合物(即，含有嵌段共聚物和核酸的组合物。在 以后的记载中，有时称为“基于嵌段共聚物的核酸组合物”。)，使其在体 外或体内与靶细胞或组织进行接触，同时另外使阳离子聚合物与靶细胞或 组织进行接触，在原位(in situ)与基于嵌段共聚物的核酸组合物共存。进而， 将靶细胞或组织中的基于嵌段共聚物的核酸组合物的嵌段共聚物和阳离 子聚合物的共存比调整成满足所述特定范围的B/H比。根据本方法(2)，也 可以与所述方法(1)(使用本发明的核酸递送用组合物进行核酸递送的方法) 同样地在抑制细胞毒性使其较低的同时以高效率进行核酸导入。
本方法(2)的详细情况如下所述。
关于构成基于嵌段共聚物的核酸组合物的嵌段共聚物及核酸的详细 情况，如之前关于本发明的核酸递送用组合物所述。嵌段共聚物和核酸的 使用比率也是任意的，根据核酸递送的目的及条件等酌情选择即可，但优 选考虑在原位共存的阳离子聚合物的共存比率，以满足所述N/P比的范围 的比率使用。关于基于嵌段共聚物的核酸组合物的制备，也可以通过基于 本发明的核酸递送用组合物的制备，混合各成分来进行。
关于阳离子聚合物的详细情况，也如之前关于本发明的核酸递送用组 合物所述。
作为使基于嵌段共聚物的核酸组合物及阳离子聚合物与靶细胞或组 织进行接触的方法，可以使用前述使本发明的核酸递送用组合物与靶细胞 或组织进行接触的方法。但是，为了在原位实现所要的N/P比，优选使用 可将原位下的基于嵌段共聚物的核酸组合物及阳离子聚合物中的每一个 的浓度精确地控制在某种程度的方法。作为在体外实现这种浓度控制的优 选的接触方法，可以举出：在培养前的培养基中预先添加的方法、在培养 中的培养基或培养物中之后进行添加的方法。另外，作为在体内实现这种 控制的优选的接触方法，可以举出：局部给药、血中给药等。另外，特别 是关于阳离子聚合物，为了提高与细胞或组织的接触效率，也优选在与公 知的阴离子聚合物混合的状态下进行给药。
另外，使基于嵌段共聚物的核酸组合物及阳离子聚合物与靶细胞或组 织进行接触的顺序也没有限制，是任意的。即，可以同时使基于嵌段共聚 物的核酸组合物及阳离子聚合物与靶细胞或组织进行接触，也可以首先使 任一方与靶细胞或组织进行接触，接下来使另一方与靶细胞或组织进行接 触。在使这些同时与靶细胞或组织进行接触的情况下，可以使两者分别与 靶细胞或组织进行接触，也可以将两者进行混合后与靶细胞或组织进行接 触。在使这些分别与靶细胞或组织进行接触的情况下，其接触手法可以相 同也可以不同。
本发明的核酸递送方法可以用于各种用途，其中，可优选用于在体外 或体内将成为各种病因的细胞或组织作为靶，递送·导入所要的核酸的治 疗(基因治疗)。
实施例
下面，参照实施例更具体地说明本发明。另外，以下的实施例仅以例 示为目的，本发明并不受其任何限定。
[实施例组I：核酸递送用组合物的物理性质及体外(in vitro)特性的研 究]
(嵌段共聚物)
<PEG-PAsp(DET)的结构>
作为嵌段共聚物，使用具有聚乙二醇(在之后的记载中，表示为“PEG”) 链段和聚(天冬氨酸-二亚乙基三胺衍生物)(在之后的记载中，表示为 “PAsp(DET)”)链段的如下所示的嵌段共聚物(在之后的记载中，表示为 “PEG-PAsp(DET)”)。
[化学式11]
(式中，
m表示PEG的聚合度，约为270。
n表示PAsp(DET)的聚合度，约为61。
a、b均为大于0且小于1的数。其中，a+b＝1。
c表示作为连接基团的亚乙基的重复数，约为3。)
PEG-PAsp(DET)的PEG链段的分子量约为12000，PAsp(DET)链段的 分子量约为14000。
<PEG-PAsp(DET)的制法>
PEG-PAsp(DET)通过以下的(1)(2)的步骤制作。
(1)PEG-聚苄基-L-天冬氨酸盐(PEG-PBLA)的合成：
将NCA(氨基酸酐)化合物溶解于少量的DMF(二甲基甲酰胺)，在其中 加入二氯甲烷。作为聚合引发剂，加入溶解于二氯甲烷的在一个末端具有 伯氨基的PEG，在35℃下搅拌2天。这些操作在干燥氩气氛下进行。将生 成的PEG-PBLA滴加于正己烷/乙酸乙酯(6/4)的混合溶液中并使其沉淀， 通过过滤后进行减压干燥来回收。使用PEG标准品的标准曲线对生成的 PEG-PBLA的分子量分布进行凝胶过滤色谱(GPC)解析，结果，Mw(重均 分子量)/Mn(数均分子量)为1.05。另外，通过1H NMR测定求出聚合度， 结果为65。
(2)PEG-PAsp(DET)的合成：
PEG-PAsp(DET)利用PEG-PBLA的氨解反应来合成。使干燥的 PEG-PBLA 50mg溶解在NMP(N-甲基吡咯烷酮)2mL中，分别冷却至5℃ 及0℃。在另一容器中制备将相对于PEG-PBLA的苄基酯基为50倍摩尔 量的DET以等量的NMP进行稀释而成的溶液，冷却至与所述PEG-PBLA 溶液相同的温度。在其中慢慢地滴加所述PEG-PBLA溶液，反应1小时后， 在充分冷却的5N HCl(优选1N左右的稀酸)中滴加反应溶液并同时控制溶 液温度在5℃以下。然后，在保持4℃的状态下对0.01N左右的HCl水溶 液进行透析(pH2)，进一步对纯水进行透析，由此除去过剩的酸。将最终得 到的聚合物水溶液进行冷冻干燥，将PEG-PAsp(DET)作为盐进行回收。定 量的氨解反应通过1H NMR测定来确认。
(日离子聚合物)
<Homo-PAsp(DET)的结构>
作为阳离子聚合物，使用以下所示的聚(天冬氨酸-二亚乙基三胺衍生 物)均聚物(在之后的记载中，表示为“Homo-PAsp(DET)”)。
[化学式12]
(式中，
n表示PAsp(DET)的聚合度，约为54。
a、b均为大于0且小于1的数。其中，a+b＝1。)
另外，所述Homo-PAsp(DET)的分子量约为10000。
<Homo-PAsp(DET)的制法>
Homo-PAsp(DET)基于所述<PEG-PAsp(DET)的制法>进行制备。
即，在所述<PEG-PAsp(DET)的制法>的工序(1)中，除使用正丁基胺代 替PEG外，通过进行同样的操作来制作聚苄基-L-天冬氨酸盐(PBLA)。利 用GPC测得的Mw/Mn为1.06，通过1H NMR测定得到的聚合度为65。
接着，在所述<PEG-PAsp(DET)的制法>的工序(1)中，除使用上述得到 的PBLA50mg代替PEG-PBLA外，通过进行同样的操作来制备 Homo-PAsp(DET)。
(核酸)
作为核酸，使用编码萤光素酶的质粒(Luc pDNA)。该质粒从理研Cell Bank获得，将其导入大肠杆菌中通过培养进行扩增，在使用NucleoBond Xtra Maxi(日本ジエネテイクス公司制)进行纯化后使用。
(核酸递送用组合物的制备)
使用上述嵌段共聚物(PEG-PAsp(DET))、阳离子聚合物 (Homo-PAsp(DET))及核酸(Luc pDNA)，通过以下的步骤制备组合物(核酸 递送用组合物)。另外，在以下的记载中只表示为“溶液”的情况下，是指 10mM HEPES缓冲液中的溶液。
将1mg/mL嵌段共聚物溶液和1mg/mL阳离子聚合物溶液以B/H比满 足后述的各种值的方式进行混合后，通过在10mM HEPES缓冲液中以N/P 比满足后述的各种值的方式与指定量的pDNA进行混合，得到组合物(核 酸递送用组合物)。
(形状观察)
使用将B/H比设为100％(仅含嵌段共聚物)、75％、50％、25％或0％(仅 含阳离子聚合物)，将N/P比设为3，并通过上述步骤制备的组合物(核酸递 送用组合物)。对于各组合物(核酸递送用组合物)，使用乙酸双氧铀水溶液 对核酸进行染色后，用透射电子显微镜观察颗粒形状。
将各组合物得到的透射电子显微镜照片示于图1(a)及(b)。图1(b)的各 照片为对应于图1(a)的照片中的代表性颗粒的放大照片。可知在B/H比为 100％的组合物中，粒径较大，颗粒形状为较细长状，相对于此，伴随B/H 比降低粒径慢慢变小，颗粒形状接近球状。
(Z-电位的测定)
使用将B/H比设为100％(仅含嵌段共聚物)、75％、50％、25％或0％(仅 含阳离子聚合物)，将N/P比设为3，并通过上述步骤制备的组合物(核酸递 送用组合物)。通过以下步骤测定各组合物(核酸递送用组合物)的Z-电位。
将各组合物(核酸递送用组合物)注入到折叠式毛细管样品池(folded capillary cells)(Malvern Instruments，Ltd.)，使用Nano ZS(Malvern Instruments，Ltd.制)进行测定。由得到的结果利用以下的斯莫卢霍夫斯基 (Smoluchowski)方程式算出Z-电位。
ζ＝4πηυ/e ···斯莫卢霍夫斯基(Smoluchowski)方程式
(式中，ζ表示Z-电位，η表示溶剂的粘度，υ表示电泳泳动度，e表示 溶剂的介电常数。)
将得到的Z-电位和B/H比的值的关系示于图2的图。B/H比为25％以 上的范围时，Z-电位为接近0mV的值，与此相对，B/H比低于25％时， Z-电位急剧上升。由此，可推测在B/H比为25％以上的范围时，形成了这 样的PIC型高分子胶束颗粒：其嵌段共聚物的非荷电亲水性聚合物链段存 在于颗粒的外侧，而其嵌段共聚物的阳离子聚合物链段与核酸静电结合而 存在于颗粒的内侧。
(转染效率及细胞毒性的测定)
使用将B/H比设为100％(仅含嵌段共聚物)、80％、70％、60％、50％、 25％或0％(仅含阳离子聚合物)，将N/P比设为4、6、8、12、16，并通过 上述步骤制备的组合物(核酸递送用组合物)。通过以下步骤测定各组合物 (核酸递送用组合物)的转染效率及细胞毒性。
将HUVEC(正常人脐静脉内皮细胞)在24孔板上以每孔20,000个细胞 的细胞密度与400μL EBM-2一起进行接种，培养24小时。然后，将各组 合物(核酸递送用组合物)在各孔中各加入30μL，再培养24小时。用PBS 清洗细胞，并在各孔中各加入400μL新的EBM-2，再培养24小时。然后， 使用活细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8：同仁化学研究所制)，按照使 用说明书，通过对各孔内的活细胞数进行统计，作为细胞毒性的指标。
接下来，除去培养基，用PBS温和地清洗细胞。各加入200μL/孔的细 胞裂解液(Cell Culture Lysis Buffer：Promega公司制)，使用萤光素酶检测 试剂盒(Luciferase Assay System Kit：Promega公司制)及LB940仪器(Mithras 公司制)测定光致发光强度，由此确定萤光素酶活性，作为转染效率的指标。 另外，细胞裂解液中的蛋白质含量通过MicroBCA(注册商标)蛋白质检测试 剂盒(MicroBCA(注册商标)Protein Assay Reagent Kit：Thermo Scientific公司制) 来确定。
将表示各组合物(核酸递送用组合物)得到的转染效率和B/H比及N/P 比的关系的图示于图3。发现在B/H比为100％的组合物中转染效率非常 低，与此相对，在B/H比为80％或其以上的组合物中转染效率明显提高。 另外，即使在任意B/H比下，随着N/P比的增加，也仍然发现转染效率提 高。
另外，将表示各组合物(核酸递送用组合物)得到的细胞毒性和B/H比 及N/P比的关系的图示于图4。发现在B/H比为25％以下的组合物中，活 细胞数极少，细胞毒性较高，与此相对，在B/H比超过25％的组合物中， 活细胞数增加，细胞毒性明显降低。另外，即使在任意B/H比下，随着 N/P比的增加，也仍然发现细胞毒性降低。
[实施例组II：核酸递送用组合物的体内(in vivo)特性的研究]
(嵌段共聚物)
作为嵌段共聚物，在实施例组I的式子所示的PEG-PAsp(DET)中，使 用了c＝3或c＝6的物质(在之后的记载中，分别表示为 “PEG-C3-PAsp(DET)”及“PEG-C6-PAsp(DET)”。另外，在图5中，分别 表示为“C3”及“C6”。)。各聚合物基于实施例组I的<PEG-PAsp(DET) 的制法>中记载的手法进行合成。
(阳离子聚合物)
作为阳离子聚合物，使用与实施例组I相同的Homo-PAsp(DET)。
(核酸)
作为核酸，使用以下任一种。
·编码sFlt-1的质粒(sFlt-1 pDNA)
sFlt-1为从pVL1393杆状病毒载体(pDNA)中切取的Human sFlt-1 cDNA(2.4kb)，由东京医科齿科大学的涩谷教授提供。用琼脂糖凝胶电泳 纯化后，使用Rapid DNA Ligation Kit(Roche公司制)插入pCAcc载体中， 通过大肠杆菌(DH5α)培养进行扩增，将培养板上所形成的10个左右的菌 落分开进一步培养，用琼脂糖电泳等对各个pDNA进行检查，挑选插入有 所要序列的pDNA，使用NucleoBond(注册商标)Xtra(日本ジエネテイクス公司 制)对扩增之后的质粒进行纯化而使用。
·编码荧光蛋白质(Venus)的质粒(Venus pDNA)
Venus pDNA从理研Cell Bank获得，在导入大肠杆菌后通过培养进行 扩增，在使用NucleoBond Xtra Maxi(日本ジエネテイクス公司制)进行纯化 后使用。
·编码萤光素酶的质粒(Luc pDNA)
该质粒与实施例组I同样地获得·制备。
·编码萤光素酶的Cy5标记质粒(Cy5-pDNA)
是对上述Luc pDNA添加了Cy5标记的质粒。使用从Mirus公司购入 的Label IT Nucleic Acid Labeling Kit按照操作说明书中记载的步骤进行 Cy5标记。
(动物)
直接使用8周龄小鼠Balb/c(雌，从Charles River Laboratories公司获 得)(以后，有时表示为“Balb/c小鼠”)，或对5周龄裸鼠Balb/c(雌，从 Charles River Laboratories公司获得)皮下接种人胰腺癌BxPC3，饲养2～3 周至肿瘤体积生长至约45mm3之后使用(以下，有时表示为“BxPC3皮下 接种小鼠”)。
(制备法)
使用所述嵌段共聚物(PEG-C3-PAsp(DET)或PEG-C6-PAsp(DET))、阳 离子聚合物(Homo-PAsp(DET))及核酸((sFlt-)pDNA、Cy5-pDNA、Venus pDNA或Luc pDNA)，将B/H比依据以下的各项目中记载的值进行各种更 改，并将N/P比设为8，按照实施例组I的(核酸递送用组合物的制备)中记 载的步骤制备组合物(核酸递送用组合物)。
(通过血中给药进行的肿瘤体积的经时变化测定)
使用PEG-C3-PAsp(DET)或PEG-C6-PAsp(DET)作为嵌段共聚物，使用 sFlt-1pDNA作为核酸，将B/H比设为100％(仅含嵌段共聚物)、70％、或 50％而得到各组合物(核酸递送用组合物)(2OD、200μL)，将所述各组合物 通过静脉注射对所述BxPC3皮下接种小鼠(每种组合物各6只)全身给药。 对各只动物的给药在实验开始后第0天、第4天及第8天进行。1次的给 药量确定为每只小鼠的核酸给药量为20μg。对实验开始后的肿瘤体积进行 经时测定，由此检查核酸递送带来的肿瘤抑制效果。
另外，作为对照实验，使用10mM HEPES缓冲液，通过与上述同样的 手法进行给药及肿瘤体积测定。
将表示各B/H比得到的肿瘤体积的经时变化的图示于图5。使用 PEG-C3-PAsp(DET)(图中，表示为“C3”。)及PEG-C6-PAsp(DET)(图中， 表示为“C6”。)中的任一种的情况，与对照(HEPES缓冲液)的情况相比， 都发现了肿瘤抑制效果。与B/H比为100％的组合物相比，B/H比为50％ 或70％的组合物的效果优异，特别是在B/H比为70％的组合物中发现了显 著的肿瘤抑制效果。
(通过血中给药进行的核酸递送用组合物的血中滞留性测定)
使用PEG-C3-PAsp(DET)作为嵌段共聚物，使用Cy5-pDNA作为核酸， 将B/H比设为100％(仅含嵌段共聚物)、70％、或50％而得到各组合物(核 酸递送用组合物)(2OD、200μL)，将所述各组合物通过静脉注射对所述 BxPC3皮下接种小鼠(每种组合物各8只)全身给药。给药量确定为每只小 鼠的核酸给药量为20μg。在给药后经时地进行采血，用IVIS(注册商标)成 像系统(Caliper公司(Xenogen公司)制)对采集到的血液样品中的荧光强度 进行测定。将给药20分钟后的血液样品中的荧光强度相对于刚给药后的 血液样品中的荧光强度的比率作为血中滞留性的指标求出。
将表示各B/H比得到的血中滞留性的指标(给药20分钟后的荧光强度 相对于刚给药后的荧光强度的比率)的图示于图6。在B/H比为70％的组合 物中，即使从给药开始至20分钟后的时刻，源自核酸的荧光强度也维持 在与B/H比为100％的组合物同等程度。另一方面，在B/H比为50％的组 合物中，源自核酸的荧光强度有所降低。
(通过血中给药进行的肿瘤中的核酸表达观察1)
使用PEG-C3-PAsp(DET)作为嵌段共聚物，使用Venus pDNA作为核 酸，将B/H比设为100％(仅含嵌段共聚物)、70％、或50％而得到各组合物 (核酸递送用组合物)(2OD、200μL)，将所述各组合物通过静脉注射对所述 BxPC3皮下接种小鼠(每种组合物各1只)全身给药。给药量确定为每只小 鼠的核酸给药量为20μg。从给药开始2天后切除肿瘤，制作10μm厚的切 片。用共聚焦激光显微镜(CLSM)对该切片进行观察，对Venus的表达量及 表达部位进行检查，由此，作为核酸递送带来的核酸表达有效性的指标。 另外，作为Venus的表达部位的基准，对同切片的细胞核及血管内皮细胞 进行免疫染色，并且也观察其部位。
另外，作为对照实验，使用10mM HEPES缓冲液，通过与上述同样的 手法进行给药及CLSM观察。
将各B/H比得到的肿瘤组织切片的CLSM照片示于图7(a)～(d)。在本 CLSM照片中，蓝色表示细胞核，红色表示血管内皮细胞，绿色表示Venus 表达部位。在对照(HEPES缓冲液)(图7(a))或B/H比为100％(图7(b))及 50％(图7(c))的组合物中几乎未发现Venus表达，与此相对，在B/H比为 70％的组合物(图7(d))中，即使在离开血管的细胞中也发现了Venus的表达。
(通过血中给药进行的肿瘤中的核酸表达观察2)
使用PEG-C3-PAsp(DET)作为嵌段共聚物，使用sFlt-1pDNA作为核 酸，将B/H比设为70％而得到各组合物(核酸递送用组合物)(2OD、200μL)， 将所述各组合物通过静脉注射对所述BxPC3皮下接种小鼠(每种组合物各 1只)全身给药。给药量确定为每只小鼠的核酸给药量为20μg。从给药开始 2天后切除肿瘤，制作10μm厚的切片，对血管内皮细胞进行免疫染色。 免疫染色使用作为血管内皮细胞标志物的PECAM-1和荧光标记的二次抗 体。另外，作为sFlt-1的表达部位的基准，也对同切片的细胞核及血管内 皮细胞进行免疫染色。用共聚焦激光显微镜(CLSM)对染色后的切片进行观 察，并且对sFlt-1的表达量及表达部位进行检查，由此作为核酸递送带来 的核酸表达有效性的指标。
另外，作为对照实验，使用10mM HEPES缓冲液代替核酸递送用组合 物，通过与上述同样的手法进行给药、免疫染色及CLSM观察。
将对照(HEPES缓冲液)得到的肿瘤组织切片的CLSM照片示于图 8(a)，将B/H比为70％的核酸递送用组合物得到的肿瘤组织切片的CLSM 照片示于图8(b)。在本CLSM照片中，蓝色表示细胞核，红色表示血管内 皮细胞，绿色表示sFlt-1表达部位。在对照(HEPES缓冲液)中几乎未发现 sFlt-1表达，与此相对，在B/H比为70％的核酸递送用组合物中，即使在 离开血管的细胞中也发现了sFlt-1的显著的表达。
(利用血中给药进行的肿瘤中的血管密度测定)
使用PEG-C3-PAsp(DET)作为嵌段共聚物，使用sFlt-1pDNA作为核 酸，将B/H比设为100％(仅含嵌段共聚物)、70％、或50％而得到各组合物 (核酸递送用组合物)(2OD、200μL)，将所述各组合物通过静脉注射对所述 BxPC3皮下接种小鼠(每种组合物各3只)全身给药。对每只动物给药2次， 在实验开始后第0天及第4天进行。给药量确定为每只小鼠的核酸给药量 为20μg。从给药开始6天后切除肿瘤，制作10μm厚的切片，对血管内皮 细胞进行免疫染色。免疫染色使用作为血管内皮细胞标志物的PECAM-1 和荧光标记的二次抗体。用共聚焦激光显微镜(CLSM)对染色后的切片进行 观察，每张切片拍摄7张CLSM照片。通过LSM510(Carl Zeiss公司制)对 得到的CLSM照片进行图像解析、测量绿色发光像素比率(相当于血管内 皮细胞比率)，将每张切片的平均值作为血管密度求出，作为核酸递送带来 的血管新生的抑制效果的指标。
另外，作为比较实验，使用PEG-C3-PAsp(DET)作为嵌段共聚物，使 用Luc pDNA作为核酸，将B/H比设为70％而得到组合物(核酸递送用组 合物)。使用所述组合物，通过与上述同样的手法进行给药、免疫染色及 CLSM观察。
进而，作为对照实验，使用10mM HEPES缓冲液，通过与上述同样的 手法进行给药、免疫染色及CLSM观察。
将各B/H比得到的肿瘤组织的免疫染色CLSM照片的例子示于图 9(a)，将表示通过免疫染色CLSM照片的图像解析而求出的血管密度的图 示于图9(b)。与对照实验(HEPES缓冲液)相比，在使用了Luc pDNA的组 合物(B/H比70％)中，未发现血管密度的增减，与此相对，在使用了sFlt-1 pDNA的组合物中，特别是在B/H比为70％的组合物中，血管密度显著降 低，确认到显著的血管新生的抑制效果。
(通过经肺给药进行的转染效率的评价)
使用PEG-PAsp(DET)作为嵌段共聚物，使用Luc pDNA作为核酸， 将B/H比设为100％(仅含嵌段共聚物)、75％、50％、25％或0％(仅含阳离 子聚合物)而得到各组合物(4OD、50μL)，将所述各组合物对所述Balb/c小 鼠(每种组合物各5只)经肺给药。经肺给药通过使用微型喷雾器 (microsprayer Model IA-1C-R，Penn Century公司制)，将所述各组合物直接 喷射于小鼠的支气管内来进行。
从给药开始24小时后，提取肺内的细胞30mg，用PBS对细胞进行温 和地清洗。各加入200μL的细胞裂解液(Cell Culture Lysis Buffer：Promega 公司制)，使用萤光素酶检测试剂盒(Luciferase Assay System Kit：Promega 公司制)及LB940仪器(Mithras社制)测定光致发光强度，由此确定萤光素 酶活性，作为转染效率的指标。另外，细胞裂解液中的蛋白质含量通过 MicroBCA(注册商标)蛋白质检测试剂盒(MicroBCA(注册商标)Protein Assay Reagent Kit：Thermo Scientific公司制)来确定。
另外，对市售的作为基因导入试剂的线性聚乙烯亚胺(Linear Polyethylenimine：LPEI，Exgen 500，Fermentas公司制)也通过同样的步骤进 行给药、肺细胞提取、萤光素酶活性的确定(图10中“LPEI”)。
另外，作为对照，对将Luc pDNA 10mg溶解于10mM HEPES缓冲液 溶剂50μl而成的溶液也通过同样的步骤进行给药、肺细胞提取、萤光素酶 活性的确定(图10中“仅含核酸”)。
将表示各组合物的转染效率的图示于图10。与B/H比为100％(仅含嵌 段共聚物)及B/H比为0％(仅含阳离子聚合物)的组合物相比，在B/H比为 75％及50％的各组合物中，发现转染效率明显提高。
(通过经肺给药的细胞毒性的评价)
使用PEG-PAsp(DET)作为嵌段共聚物，使用Luc pDNA作为核酸， 将B/H比设为100％(仅含嵌段共聚物)、50％或0％(仅含阳离子聚合物)而 得到各组合物(4OD、50μL)，将所述各组合物用于与上述同样地进行了各 组合物的肺内给药的Balb/c小鼠(每种组合物各1只)，从给药开始4小时 后提取肺组织，通过苏木精和曙红进行组织染色，并通过光学(明视野？) 显微镜照片观察炎症的有无。
另外，作为对照，对未进行肺内给药的Balb/c小鼠也通过同样的步骤 观察炎症的有无。
将各组合物得到的光学显微镜照片示于图11(a)～(d)。在给药了B/H比 为0％(仅含阳离子聚合物)的组合物的个体(图11(a))中，在肺组织中引起了 炎症(图中圆圈划出的部分)，与此相对，在给药了B/H比50％的组合物的 个体(图11(b))及给药了B/H比100％(仅含嵌段共聚物)的组合物的个体(图 11(c))的肺组织中，与对照个体(图11(d))的肺组织相比，没有大的变化，几 乎未发现炎症。
(通过经肺给药的炎性细胞因子表达的评价)
使用PEG-PAsp(DET)作为嵌段共聚物，使用Luc pDNA作为核酸，将 B/H比设为100％(仅含嵌段共聚物)、50％或0％(仅含阳离子聚合物)而得到 各组合物(4OD、50μL)，将所述各组合物用于与上述同样地进行了各组合 物的肺内给药的Balb/c小鼠(每种组合物各5只)，在给药开始4小时后提 取肺内的细胞30mg，测定炎性细胞因子即IL-6、TNF-α、Cox-2及IL-10 的mRNA的表达量。各mRNA的表达量的测定使用TaqMan Gene Expression Assays及ABI Prism 7500Sequence Detector(Applied Biosystems 公司)通过定量PCR来进行。另外，测定后的mRNA表达量表示为相对于 在非给药组中所测得的值的比值(相对表达量)。
另外，作为对照，使用10mM HEPES缓冲液50μl，通过与上述同样 的手法进行肺内给药及各炎性细胞因子的mRNA表达量的测定。
将得到的IL-6、TNF-α、Cox-2及IL-10的mRNA的相对表达量分别 示于图12(a)～(d)。在给药了B/H比为0％(仅含阳离子聚合物)的组合物的个 体中，对于任一炎性细胞因子，与对照组相比，表达量大幅增加，与此相 对，在给药了B/H比为50％的组合物及B/H比为100％(仅含嵌段共聚物) 的组合物的个体中，对于任一炎性细胞因子，其表达量也保持在较低的水 平。
工业上的可利用性
根据本发明，可提供一种显示高核酸导入效率，同时细胞毒性得到显 著抑制的优异的核酸递送用组合物及核酸递送方法、以及其载体组合物。 这种核酸递送用组合物及载体组合物可优选用作例如核酸治疗用的药物 组合物，其工业上的价值极高。