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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410032646.8 (22)申请日 2014.01.23 (73)专利权人 中国人民解放军第三军医大学第 一附属医院 地址 400038 重庆市沙坪坝区高滩岩正街 30号 (72)发明人 钱程 刘丽梅 刘春刚 沈俊杰 单娟娟 (74)专利代理机构 北京同恒源知识产权代理有 限公司 11275 代理人 赵荣之 (51)Int.Cl. A61K 48/00(2006.01) A61K 31/17(2006.01) A61K 31/44(2006.01) A61P 35/00(2。
2、006.01) (56)对比文件 US 20110172184 A1,2011.07.14, CN 102274220 A,2011.12.14, WO 2013007708 A1,2013.01.17, 刘瑞环等.SIRT1抑制剂的研究进展. 中南 药学 .2012,第10卷(第8期),第617-622页. Tao Liu等.The Critical Role of the Class III Histone Deacetylase SIRT1 in Cancer. Cancer Res .2009,第69卷(第5期),第 1702-1705页. 刘丽梅.去乙酰化酶SIRT1在肝癌干细胞自 。
3、我更新中的作用及其机制研究. 中国博士学位 论文全文数据库医药卫生科技辑 .2014, (第5 期),第E072-82页. Chungang Liu等.Histone deacetylase 3 participates in self-renewal of liver cancer stem cells through histone modification. Cancer Letters .2013,第339 卷(第1期),第65页右栏第18行至第66页左栏第5 行， 图6. 张璇.SIRT1的表达在肝癌发生发展中的作 用. 中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫 生科技辑 .2013, 。
4、(第6期),摘要第I页第5段至第 II页第1段、 正文部分第20-21页以及第七章结论 部分第5条. Sonia Lain等.Discovery, in vivo activity, and mechanism of action of a small-molecule p53 activator. Cancer cell .2008,第13卷(第5期),第454-463页. 审查员 刘应梅 (54)发明名称 SIRT1抑制剂联合索拉菲尼在制备治疗肝癌 的药物中的应用 (57)摘要 本发明属于化学领域， 具体涉及SIRT1抑制 剂联合索拉菲尼在制备治疗肝癌的药物中的应 用， 利用本发明的方法能。
5、够抑制肝癌干细胞的增 殖、 分化和克隆形成， 提高肝癌干细胞对索拉菲 尼的敏感性和降低肝癌干细胞对索拉菲尼的耐 药性， 同时还能增强索拉菲尼对肝癌干细胞的损 伤， 从源头上杀死肿瘤干细胞， 为彻底根除肿瘤 带来新希望。 权利要求书1页 说明书7页 附图3页 CN 103751221 B 2016.08.17 CN 103751221 B 1.SIRT1抑制剂联合索拉菲尼在制备抑制肝癌干细胞自我更新的药物中的应用。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于： 所述肝癌干细胞自我更新为肝癌干细胞的 增殖、 分化和克隆形成。 3.根据权利要求1-2任一项所述的应用， 其特征在于： 所述SIRT1抑。
6、制剂为Tenovin-6或 干扰SIRT1表达的慢病毒。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于： 所述干扰SIRT1表达的慢病毒含有Lv-sh- SIRT1质粒。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于： 所述干扰SIRT1表达的慢病毒由Lv-sh- SIRT1质粒转染293T细胞后经包装、 纯化而得。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 103751221 B 2 SIRT1抑制剂联合索拉菲尼在制备治疗肝癌的药物中的应用 技术领域 0001 本发明属于化学领域， 特别涉及SIRT1抑制剂联合索拉菲尼在制备治疗肝癌的药 物中的应用。 背景技术 0002 肝癌是排名世界第五位的恶。
7、性肿瘤， 主要分布亚洲和东南亚国家， 发病率和死亡 率居高不下， 手术、 放疗、 化疗等传统疗法难以彻底根除， 对肝癌的治疗缺乏有效的药物， 究 其原因是药物容易产生内在的耐药性。 0003 肝癌的发病机制具有复杂性的， 其癌细胞的发生发展以及癌细胞的转移与细胞内 的各种细胞信号传导通路以及生长因子等是密切相关的， 其中细胞信号传导通路中由于存 在着多个关键性基因或是信号分子， 如Ras/Raf/MAPK,PI3K/AKT/mTOR,WNT/ -catenin, Hedgehog等信号通路58,59。 其中， Ras/Raf/MAPK,PI3K/AKT/mTOR信号通路在肝癌的发病机 制中占据。
8、着重要角色。 Ras/Raf/MAPK信号通路既能在肝癌中激活上游的生长因子也能活化 肿瘤抑制基因， 而PI3K/AKT/mTOR信号转导通路在肝癌中也起着重要作用， 能够增殖和激活 30-50%的肝癌细胞60。 小分子靶向药物多美吉， 又称索拉菲尼 （sorafenib） ， 可以抑制肿瘤 细胞的增殖， 是一种口服的多靶点多激酶抑制剂， 可以靶向作用于肿瘤细胞的丝氨酸/苏氨 酸激酶及受体酪氨酸激酶及肿瘤血管上的生长因子。 国内外研究报道， 索拉非尼能够延缓 肝癌的进展并且能够延长晚期患者生存期。 目前， 索拉非尼除了在肝癌患者的治疗外， 还在 乳腺癌、 胃癌病人中使用。 但是癌症患者在使用索。
9、拉非尼时容易产生赖药性， 经研究发现肿 瘤细胞中含有微量的肿瘤干细胞， 这类细胞对常规放疗、 化疗具有耐受、 不敏感等特点， 是 肿瘤赖药性、 复发、 转移的根源。 因此， 急需研究开发出能够对肿瘤干细胞的靶向药物， 从源 头杀死肿瘤干细胞， 将为彻底根除肿瘤带来新希望。 发明内容 0004 有鉴于此， 本发明的目的在于提供SIRT1抑制剂联合索拉菲尼在制备治疗肝癌的 药物中的应用， 通过抑制肿瘤干细胞增殖、 分化， 并从源头上杀死肿瘤干细胞， 最终获得达 到治疗肝癌的目的。 0005 为实现上述发明目的， 本发明提供如下技术方案： 0006 SIRT1抑制剂联合索拉菲尼在制备治疗肝癌的药物中。
10、的应用。 0007 优选的， SIRT1抑制剂联合索拉菲尼在制备抑制肝癌干细胞自我更新的药物中的 应用。 0008 更优选的， 所述肝癌干细胞自我更新为肝癌干细胞的增殖、 分化和克隆形成。 0009 优选的， 所述SIRT1抑制剂为Tenovin-6或干扰SIRT1表达的慢病毒， 也可以为其他 的SIRT1抑制剂。 0010 优选的， 所述干扰SIRT1表达的慢病毒含有Lv-sh-SIRT1质粒。 0011 更优选的， 所述干扰SIRT1表达的慢病毒由Lv-sh-SIRT1质粒由Lv-sh-SIRT1质粒 说 明 书 1/7 页 3 CN 103751221 B 3 转染293T细胞后经包装、。
11、 纯化而得。 0012 本发明的有益效果在于： 本发明公开了SIRT1抑制剂联合索拉菲尼在制备治疗肝 癌的药物中的应用， 利用SIRT1抑制剂干扰或抑制SIRT1表达抑制肝癌干细胞的增殖、 分化 和克隆形成， 同时提高肝癌干细胞对索拉菲尼敏感性和增强索拉菲尼对肝癌干细胞的损 伤， 利用本发明的方法还能降低肝癌干细胞对索拉菲尼的耐药性， 杀死肝癌干细胞， 从源头 上杀死肿瘤干细胞， 为彻底根除肿瘤带来新希望。 附图说明 0013 为了使本发明的目的、 技术方案和有益效果更加清楚， 本发明提供如下附图： 0014 图1为临床肝组织样本中检测SIRT1的表达 （A： 免疫组化检测SIRT1在肝癌肿瘤。
12、组 织及癌旁组织的表达定位； B： SIRT1在肝癌肿瘤组织及癌旁组织表达的统计结果； C： Kaplan-Meier方法分析SIRT1的表达与肝癌患者预后的关系） 。 0015 图2为肝癌干细胞对索拉菲尼的耐药性 （A:肝癌干细胞中干扰SIRT1的表达后， 检 测索拉菲尼处理对细胞克隆形成力的影响； B:肝癌干细胞中抑制SIRT1的表达后， 检测索拉 菲尼处理对细胞克隆形成力的影响； C:免疫荧光检测干扰SIRT1表达后， 检测索拉菲尼处理 对细胞损伤的影响） 。 0016 图3为肝癌干细胞中抑制SIRT1的表达联合索拉菲尼处理对细胞其耐药性的影响。 0017 图4为肝癌干细胞中干扰SIRT。
13、1的表达联合索拉菲尼处理移植瘤对移植瘤重量或 体积的影响。 0018 图5为肝癌干细胞中干扰SIRT1的表达联合索拉菲尼处理对移植瘤形态和移植瘤 损伤的影响。 0019 图6为肝癌患者联合索拉菲尼治疗的组织标本检测SIRT1的表达 （A:Kaplan-Meier 方法分析肝癌患者术后SIRT1表达与生存时间的关系； B： Kaplan-Meier方法分析肝癌患者 联合 索拉非尼治疗后SIRT1表达与生存时间的关系） 。 具体实施方式 0020 下面将结合附图， 对本发明的优选实施例进行详细的描述。 实施例中未注明具体 条件的实验方法， 通常按照常规条件， 例如分子克隆实验指南 （第三版， J.。
14、萨姆布鲁克等著） 中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 0021 本发明使用的肝癌干细胞模型肝癌干细胞T1224由本实验室构建， 该模型含有 Nanog启动子调控GFP报告基因构建的慢病毒表达载体 （Nanog/GFP报告系统） ， 其构建方法 参见Shan et al.2012， hepatology， 56： 1014-1014； Lv-sh-Scramble质粒和Lv-sh-SIRT1质 粒由本实验室构建， 其构建过程具体见Shan et al.2012， hepatology， 56： 1014-1014； HEK293细胞由本实验室保存。 0022 本发明使用的Envisio。
15、nTM和DAB显色液购自丹麦DAKO公司； EDTA （pH8） 抗原修复液 购自福州迈新生物技术开发公司。 索拉菲尼 （sorafenib） 片剂购自德国Bayer Schering pharma AG公司； TV-6 （Tenovin6） 购自美国Santa Cruz公司； 鼠抗人-H2AX抗体购自美国 Millipore公司。 0023 一、 SIRT1的表达对肝癌患者临床病理学特征以及病人预后的影响 说 明 书 2/7 页 4 CN 103751221 B 4 0024 已有的研究表明， SIRT1可通过调节p53的活性发挥 “癌基因” 作用， 又可通过抑制 一些肿瘤癌基因的表达发挥 。
16、“抑癌基因” 的功能， SIRT1到底是 “癌基因” 亦或是 “抑癌基因” ， 一直是研究的热点。 因此， 本发明通过收集第三军医大学西南医院2000年1月至2005年12月 手术切除的肝细胞肝癌石蜡标本癌组织以及相配对的肝癌癌旁组织各148例， 并对患者进 行随访5-10年， 所有标本经西南医院肝胆外科手术后， 所有标本经10%福尔马林溶液固定， 石蜡包埋， 45 m连续切片， 然后利用免疫组织化学方法检测SIRT1在148例肝癌患者的表 达情况， 再分析SIRT1表达情况与临床预后、 病理学指标的相关性。 免疫组织化学的具体方 法为： 将148例肝癌患者的癌组织和癌旁组织用组织芯片仪 （孔。
17、径0.6 m） 采取癌组织及癌旁 各两个点， 经H&E染色后观察， 结果如图1中A所示。 0025 免疫组织化学结果判读： SIRT1染色阳性信号定位于细胞核， 呈深浅不等的棕、 黄 色颗粒。 采用半定量计分方式对染色结果进行评分， 每张切片均在不同时间观察3次， 记平 均值， 计分由细胞染色百分比和染色强度分两部分组成： 0026 细胞染色百分比得分： 75%细胞阳性为4分； 0027 细胞染色强度计分： 淡黄色为1分， 棕黄色为2分， 棕黑色为3分； 0028 两分相乘为总分： 01分为阴性 （-） ， 24分为弱阳性 （+） ， 58分为中阳性 （+） ， 9 12分为强阳性 （+） 。。
18、 0029 所有计算数据均以均值标准差 （xs） 表示， 采用SPSS16.0数理统计分析软件进 行独立样本t检验 （两组间均值比较） ， P0.05为统计学差异显著， P0.01和P0.001为统计 学差异非常显著。 0030 统计结果表明， SIRT1在67% （99/148） 的癌组织中表达， 而在癌旁中的阳性率为31% （48/148） ， 并且SIRT1在癌组织与癌旁组织的表达阳性率差异非常显著 （图1中B）（p 0.0001） ， 采用Kaplan-Meier方法分析SIRT1的表达与肝癌患者术后预后的关系， 如图1中C 所示， 癌组织SIRT1表达阴性的患者生存时间显著长于SIR。
19、T1表达阳性的患者(p0.031)。 通 过分析SIRT1表达与临床病理学相关性， 结果见表1。 0031 表1在肝癌患者SIRT1的表达与临床病理指标的相关性 说 明 书 3/7 页 5 CN 103751221 B 5 0032 0033 0034 Note:(1)*p0.05, *p0.01差异显著. (2)x2test. 0035 由表1可知， SIRT1与组织学分级、 包膜浸润、 血管癌栓， 具有显著性的差异 （p= 0.003、 p=0.015、 p=0.005） 。 这可能与SIRT1在肝癌的发生、 发展的发挥的作用有关。 0036 二、 SIRT1的表达对肝癌临床治疗作用靶点的。
20、研究 0037 索拉菲尼 （sorafenib） 溶液的配置： 先将索拉菲尼片剂碾磨成粉末， 接着用体积分 数为1%的DMSO配置成100mg/mL的储存液， 使用时用完全培养基配置成所需的浓度。 0038 -H2AX抗体： -H2AX抗体按体积比为1:500稀释。 说 明 书 4/7 页 6 CN 103751221 B 6 0039 （1） 慢病毒Lv-sh-SIRT1和Lv-sh-Scramble的包装 0040 在10cm的培养皿中铺25106个293T细胞 （最好是20代之前的， 细胞的状态必需 良好， 生长速度较快， 否则对病毒产量影响很大） ， 培养液含10%FBS的DMEM （。
21、v/v） ， 待细胞汇 合至70%时， 换新鲜的含10%FBS的DMEM （v/v） 培养液， 3-4h后用于转染。 0041 取15-20 g的Lv-sh-SIRT1或Lv-sh-Scramble慢病毒表达质粒， 向混合液中分别滴 加50 L2.5M的CaCl2， 再分别加入无菌水至总体积500 L， 混匀后加入500 L2HBS缓冲液 （2 HBS缓冲液使用前于涡旋振荡器上震荡） ， 然后置于涡旋振荡器上震荡10s以上， 滴加结束 后， 继续震荡， 室温放置5分钟后， 将液体加入培养的293T中， 加完后前后左右晃动混匀， 加 入后6-12小时换新鲜的10%FBS的DMEM （v/v） 培。
22、养液。 0042 （2） 慢病毒Lv-sh-SIRT1和Lv-sh-Scramble的收集和纯化 0043 自转染开始后48小时、 72小时各收集一次细胞培液， 48小时收集后， 再补充15mL的 培液， 将收集的病毒在1000rpm条件下离心10min去除细胞碎片， 收集上清， 并用0.45 m的滤 膜过滤， 滤液转移入Millopore的浓缩柱， 在5000rpm离心至上层凹槽内的液体体积浓缩至 1mL （可分多次加入） 。 将浓缩液分装， 置于-80低温冰箱保存。 0044 （3） 将肝癌细胞T1224用流式细胞仪分选Nanog阳性肝癌干细胞 （记为NanogPos） ， 然 后将分选的。
23、NanogPos种植在6孔板内， 待细胞长至1106时， 通过计数将细胞种植在24孔， 每 孔细胞为200个， 每个样品3个重复， 次日分别加0 M与2.5 M浓度的索拉菲尼， 每隔3d吸出培 养液， 再加相同的浓度， 连续处理4次， 即12天后用质量分数为4%的多聚甲醛固 定， 结晶紫 染色， 观察并计数每孔细胞的克隆形成率， 结果如图2中A和B所示。 由图2中A可知， 使用浓度 为2.5 M的索拉菲尼对肝癌干细胞克隆形成能力没有影响， 差异不显著， 可能是长期使用索 拉菲尼后肝癌干细胞对索拉菲尼产生了耐药性。 0045 按照与上述相同的方法分选的NanogPos， 然后种植在6孔板内， 待。
24、细胞长至1106 时， 加入慢病毒Lv-sh-SIRT1颗粒， 72小时后流式计数种植在24孔， 每孔细胞为200个， 每个 样品3个重复。 次日分别加0 M与2.5 M浓度的索拉菲尼， 每隔3d吸出培养液， 再加相同的浓 度， 连续处理4次， 即12天后用质量分数为4%的多聚甲醛固定， 结晶紫染色， 观察并计数每孔 细胞的克隆形成率， 结果如图2中A所示。 由图2中A可知， NanogPos干扰SIRT1表达后， 用加入 2.0 M索拉菲尼处理12天后， 肝癌干细胞的克隆形成力显著低于干扰SIRT1表达的肝癌干细 胞。 因此， 降低SIRT1的表达量能够降低肝癌干细胞对索拉菲尼的耐受性。 0。
25、046 按照与上述相同的方法分选NanogPos， 然后种植在6孔板内， 待细胞长至1106时， 通过计数将细胞种植在24孔， 每孔细胞为200个， 每个样品3个重复， 次日加入浓度为2 M的 TV-6处理48小时， 然后用质量分数为4%的多聚甲醛固定， 结晶紫染色， 观察并计数每孔细胞 的克隆形成率。 然后按照相同的方法， 用浓度为2 M的SIRT1的抑制剂TV-6处理细胞48小时 后， 再加入浓度为2.5 M索拉菲尼处理12天， 然后观察克隆形成率， 其结果如图2中B所示。 0047 由图2中B可知， 长时间用2.5 M的索拉菲尼处理对肝癌干细胞克隆形成没有影响， 用浓度为2 M的TV-6。
26、处理后肝癌干细胞克隆形成能力显著降低。 并且干扰SIRT1表达后， 再 加入2.5 M索拉菲尼处理12天后， 肝癌干细胞的克隆形成显著低于未干扰SIRT1表达的对照 组 （p0.001） 。 用SIRT1的抑制剂TV-6处理细胞， 再加入2.5 M索拉菲尼， 12天后其肝癌干细 胞克隆形成同样显著低于未经TV-6处理的对照组 （p0.001） 。 结果表明， SIRT1的高表达是 肝癌治疗药物-索拉菲尼治疗肝癌产生耐药的根源。 说 明 书 5/7 页 7 CN 103751221 B 7 0048 按照上述相同的方法， 分别用0 M、 1 M、 5 M和10 M的索拉菲尼处理NanogPos干。
27、扰 SIRT1表达后的NanogPos， 12天后用EnvisionTM免疫组化技术检测DNA损伤指标-H2AX的表 达， 免疫荧光染色后， 经激光共聚焦显微镜观察， 结果如图2中C所示。 由图2中C可知， 随着索 拉菲尼浓度的增加， 肝癌干细胞的损伤显著增加， 干扰SIRT1表达后， 肝癌干细胞的损伤显 著高于未干扰SIRT1表达的肝癌干细胞。 结果表明， 抑制SIRT1的表达， 能增加对肝癌干细胞 对索拉菲尼治疗的敏感性。 0049 为进一步明确SIRT1能否联合索拉菲尼对化疗药物的敏感性， 从而为治疗肝癌提 供有效的临床方案， 将分选的NanogPos细胞用分别做如下处理， 2.0 M 。
28、TV-6处理15天； 2.5 M 索 拉菲尼处理15天； 先用2.5 M索拉菲尼处理9天后， 再用2.0 M TV-6处理6天； 先用2.0 MTV-6处理9天， 再用2.5 M索拉菲尼处理6天； 用2.0 M TV-6和2.5 M索拉菲尼联合处理， 然 后统计克隆形成情况， 结果如图3所示。 由图3可知， 单独用2.5 M索拉菲尼处理肝癌干细胞 对其克隆形成影响较小， 而单独用2.0 M TV-6处理肝癌干细胞对其克隆形成影响大于2.5 M索拉菲尼处理的肝癌干细胞； 同时用2.0 M TV-6和2.5 M索拉菲尼处理肝癌干细胞的结果 显示， 先用2.5 M索拉菲尼处理细胞9天， 再用2.5 。
29、M TV-6处理的细胞6天， 对肝癌干细胞克 隆形成影响较小， 而先用2.0 M TV-6处理细胞9天， 再用2.5 M索拉菲尼处理的细胞6天， 对 肝癌干细胞的克隆形成影响较大， 但是将2.0 M TV-6和2.5 M索拉菲尼联合处理， 对肝癌干 细胞的克隆形成影响最大。 以上结果表明， 抑制SIRT1的表达并联合索拉非尼能够增强对肝 癌化疗药物的敏感性， 为根除肝癌干细胞带来了希望。 0050 三、 在免疫缺陷小鼠体内干扰SIRT1联合索拉菲尼对皮下移植瘤的影响 0051 根据前述研究结果表明， 干扰SIRT1表达或SIRT1抑制剂联合索拉菲尼能显著降低 肝癌干细胞的克隆形成能力。 为进一。
30、步验证上述结论， 在NOD/SCID小鼠体内验证在干扰 SIRT1表达或SIRT1抑制剂联合索拉菲尼能显著降低肝癌干细胞的克隆形成能力， 具体方法 为： 用流式细胞仪分选NanogPos， 然后将其种植在6孔板内， 待细胞长至1106时， 感染慢病 毒Lv-sh-SIRT1和慢病毒Lv-sh-scramble， 72小时后分别注射到NOD/SCID鼠皮下， 细胞数量 为1106/只， 各注射20个点。 待皮下肿瘤长至50mm3时， 将实验NOD/SCID鼠分为4个组：（1） 空 白对照组， 接种感染慢病毒Lv-sh-scramble的肝癌干细胞实验鼠， 不做处理；（2） 阴性对照 组1， 接种。
31、感染慢病毒Lv-sh-scramble的肝癌干细胞组实验小鼠， 按100mg/Kg灌胃索拉菲 尼；（3） 阴性对照组2， 接种感染慢病毒Lv-sh-SIRT1的肝癌干细胞实验小鼠， 不做处理；（4） 实验组， 接种感染慢病毒Lv-sh-SIRT1的肝癌干细胞实验小鼠， 按100mg/Kg灌胃索拉菲尼； 实验过程中灌胃组每隔3d灌胃索拉菲尼， 连续处理21天后处死小鼠， 剥出肿瘤， 测量肿瘤体 积以及肿瘤重量， 结果如图4所示。 由图4可知， 灌胃索拉菲尼能够降低移植瘤的重量和体 积， 仅干扰SIRT1表达未灌胃索拉菲尼也能降低移植瘤的重量和体积， 但是干扰SIRT1表达 同时联合索拉非尼处理降。
32、低移植瘤的重量和体积效果最好， 与空白对照组和对照组相比差 异显著。 结果表明， 干扰SIRT1表达同时联合索拉非尼处理能够抑制肿瘤的生长， 可能是干 扰SIRT1表达后降低了肝癌干细胞对索拉非尼耐药性， 利用索拉非尼杀死肝癌干细胞， 最终 降低了移植瘤的重量和体积。 0052 移植瘤免疫组化： 将剥出肿瘤用质量分数为4%的多聚甲醛固定， 石蜡包埋， 45 m 连续切片， 经H&E染色后在显微镜下观察移植瘤病理学形态， 再用EnvisionTM免疫组化技术 检 测-H2AX的表达， 镜下观察并拍照， 结果如图5所示。 由图5可知， H&E染色结果表明， 与 说 明 书 6/7 页 8 CN 1。
33、03751221 B 8 对照组1相比， 干扰SIRT1表达联合索拉非尼处理组的移植瘤， 其肿瘤细胞形态未发生改变； 检测-H2AX发现干扰SIRT1表达联合索拉非尼处理组的移植瘤与对照组1和对照组2相比 移植瘤损伤更为明显。 上述研究结果进一步证实了SIRT1与肝癌干细胞的对索拉非尼耐药 机制有关。 0053 四、 SIRT1的表达联索拉非尼的作用对临床肝癌治疗的研究意义 0054 为进一步研究SIRT1联合索拉非尼指导临床肝癌患者治疗的意义， 统计第三军医 大学西南医院肝胆外科肝癌患者自2008年到2010年术后用多吉美治疗的患者资料， 并进行 随访， 同时找出相应患者的的临床病理组织标本。
34、进行切片， 并用免疫组化染色检测SIRT1的 表达。 统计结果表明， 有53例肝癌患者既用索拉非尼治疗又有临床病理组织样本， 但其中只 有31例有随访资料。 然后采用免疫组织化学方法检测这31例肝癌患者石蜡标本中SIRT1的 表达， 检测方法与前述相同。 结果显示： 在肿瘤中SIRT1表达的阳性率为64.5%(20/31)， 阴性 率为36.5 （11/31） ； 采用Kaplan-Meier方法分析SIRT1的表达与肝癌患者术后的生存时间的 关系， 结果如图6中A所示。 由图6中A可知， 在肝癌患者术后癌组织SIRT1表达阳性生存时间 显著低于SIRT1表达阴性的患者， 这与我们前面在148。
35、例肝癌患者组织芯片检测SIRT1的表 达统计结果相一致。 进一步采用Kaplan-Meier方法分析31例肝癌患者SIRT1的表达与术后 用索拉菲尼进行治疗和预后的关系， 结果如图6中B所示。 结果显示， 在癌组织中SIRT1表达 阳性， 用索拉菲尼治疗的患者其生存时间短， 而在癌组织中SIRT1表达阴性用索拉菲尼治疗 患者， 其生存时间显著高于癌组织SIRT1表达阳性用索拉菲尼治疗的患者。 上述结果表明了 SIRT1表达阳性的肝癌患者， 预后差， 用索拉菲尼治疗不敏感； SIRT1表达阴性的肝癌患者用 索拉菲尼治疗效果明显， 病人预后好， 生存期长。 综上所述， SIRT1在肝癌中可作为预测。
36、患者 预后的一个指标， 并且能够联合索拉菲尼指导临床医生对肝癌患者的治疗， 从而为治疗肝 癌提供更有力的理论基础以及为研发新的药物靶点提供确实的证据。 0055 最后说明的是， 以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制， 尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述， 但本领域技术人员应当理解， 可以在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变， 而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。 说 明 书 7/7 页 9 CN 103751221 B 9 图1 说 明 书 附 图 1/3 页 10 CN 103751221 B 10 图2 图3 说 明 书 附 图 2/3 页 11 CN 103751221 B 11 图4 图5 图6 说 明 书 附 图 3/3 页 12 CN 103751221 B 12 。