靶向肿瘤多功能聚苹果酸载体药物.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102716495 B (45)授权公告日 2014.04.23 CN 102716495 B (21)申请号 201210205097.0 (22)申请日 2012.06.20 A61K 47/48(2006.01) A61K 45/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C08G 81/00(2006.01) C08G 63/91(2006.01) C08G 65/48(2006.01) (73)专利权人 中国人民解放军第四军医大学 地址 710032 陕西省西安市长乐西路 17 号 (72)发明人 吴红 李飞 李伟 陶阳春 乔友备 范黎 。

2、(74)专利代理机构 西安西达专利代理有限责任 公司 61202 代理人 谢钢 CN 101879315 A,2010.11.10, 说明书第 0006-0013,0020-0021 段， 说明书实施 例 3. (54) 发明名称 靶向肿瘤多功能聚苹果酸载体药物 (57) 摘要 本发明公开了一种聚苹果酸载体药物， 是将 药物固定在聚苹果酸载体上， 所述药物为含有氨 基或可引入氨基的抗肿瘤药物及其衍生物， 聚苹 果酸载体上连接有穿膜肽， 靶向基团 Ligand 或柔 性链修饰的靶向基团通过易断裂键连接在聚苹果 酸载体上。本发明充分利用聚苹果酸结构特点， 将不同生物特性的活性分子依次连接在聚苹果 。

3、酸上， 通过屏蔽 - 去屏蔽效应， 构建了兼有肿瘤靶 向、 高效入胞释药特性的聚合物药物体系。 该体系 通过配体 - 受体、 抗体 - 抗原特异性的结合， 实现 主动靶向肿瘤部位的功能。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 王斯婷 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书2页 说明书7页 附图4页 (10)授权公告号 CN 102716495 B CN 102716495 B 1/2 页 2 1. 一种聚苹果酸载体药物， 是将药物固定在聚苹果酸载体上， 其特征在于 ： （1） 所述药物为含有氨基或可引入氨。

4、基的抗肿瘤药物 ； （2） 聚苹果酸载体上连接有穿膜肽 ； （3） 靶向基团或柔性链修饰的靶向基团通过易断裂键连接在聚苹果酸载体上 ； 所述聚苹果酸载体药物通过以下方法制备得到， （1） 在 1-（3- 二甲氨基丙基） -3- 乙基碳二亚胺盐酸盐、 N- 羟基丁二酰亚胺和三乙胺 的催化下， 聚苹果酸 PMLA 与水合肼反应制备得到 PMLA-NH2， 其中聚苹果酸中含有的羧基和 水合肼的摩尔比在 101 之间 ； （2） 选用含有醛基的聚乙二醇和靶向基团 Ligand 反应制备得到靶向基团修饰化的聚 乙二醇 OHC-PEG-Ligand， 选用的含有醛基的聚乙二醇的分子量在 35007000，。

5、 其中 Ligand 与醛基聚乙二醇的反应摩尔比在 0.110 之间 ； （3）将 PMLA-NH2与 OHC-PEG-Ligand 溶 解 到 DMF 溶 剂 中， 室 温 下 发 生 反 应 得 到 PMLA-Hz-PEG-Ligand， 形成所需的腙键间隔基， 其中 PMLA-NH2中氨基与 OHC-PEG-Ligand 的 反应摩尔比在 0.51 ； （4） PMLA-Hz-PEG-Ligand 和穿膜肽 TAT 或 TAT-PEG 反应得到 TAT-PMLA-Hz-PEG-Ligand 或 TAT-PEG-PMLA-Hz-PEG-Ligand， 其中短链 PEG 的分子量 50030。

6、00 ； （5） 在 1-（3- 二甲氨基丙基） -3- 乙基碳二亚胺盐酸盐、 N- 羟基丁二酰亚胺和三乙胺 的催化下， 将TAT- PMLA-Hz-PEG-Ligand或TAT-PEG-PMLA-Hz-PEG-Ligand和含有氨基的抗 肿瘤药物反应制备得到聚苹果酸载体药物。 2. 根据权利要求 1 所述的聚苹果酸载体药物， 其特征在于 ： 所述抗肿瘤药物为阿霉素、 氨基喜树碱、 阿扎胞苷或克拉曲滨。 3. 根据权利要求 1 所述的聚苹果酸载体药物， 其特征在于 ： 所述的聚苹果酸的分子量 为 1000200,000。 4. 根据权利要求 1 所述的聚苹果酸载体药物， 其特征在于 ： 所述穿。

7、膜肽还包括具有穿 过细胞核、 细胞膜功能的核定位信号肽。 5. 根据权利要求 1 所述的聚苹果酸载体药物， 其特征在于 ： 所述靶向基团为具有肿瘤 细胞靶向作用的物质， 包括所有实体瘤组织表面有其对应的相对高表达的受体的配体， 种 类为维生素、 蛋白、 肽类、 多糖或整合素。 6. 根据权利要求 5 所述的聚苹果酸载体药物， 其特征在于 ： 所述靶向基团为叶酸、 促黄 体激素释放激素、 生物素、 转铁蛋白、 低密度脂蛋白、 甘草次酸、 凝集素、 抗肿瘤融合蛋白、 单 克隆抗体或人工合成配体。 7. 权利要求 1 所述聚苹果酸载体药物的制备方法， 包括以下步骤 ： （1） 在 1-（3- 二甲氨。

8、基丙基） -3- 乙基碳二亚胺盐酸盐、 N- 羟基丁二酰亚胺和三乙胺 的催化下， 聚苹果酸 PMLA 与水合肼反应制备得到 PMLA-NH2， 其中聚苹果酸中含有的羧基和 水合肼的摩尔比在 101 之间 ； （2） 选用含有醛基的聚乙二醇和靶向基团 Ligand 反应制备得到靶向基团修饰化的聚 乙二醇 OHC-PEG-Ligand， 选用的含有醛基的聚乙二醇的分子量在 35007000， 其中 Ligand 与醛基聚乙二醇的反应摩尔比在 0.110 之间 ； （3）将 PMLA-NH2与 OHC-PEG-Ligand 溶 解 到 DMF 溶 剂 中， 室 温 下 发 生 反 应 得 到 权 利。

9、 要 求 书 CN 102716495 B 2 2/2 页 3 PMLA-Hz-PEG-Ligand， 形成所需的腙键间隔基， 其中 PMLA-NH2中氨基与 OHC-PEG-Ligand 的 反应摩尔比在 0.51 ； （4） PMLA-Hz-PEG-Ligand 和穿膜肽 TAT 或 TAT-PEG 反应得到 TAT-PMLA-Hz-PEG-Ligand 或 TAT-PEG-PMLA-Hz-PEG-Ligand， 其中短链 PEG 的分子量 5003000 ； （5） 在 1-（3- 二甲氨基丙基） -3- 乙基碳二亚胺盐酸盐、 N- 羟基丁二酰亚胺和三乙胺 的催化下， 将TAT- PML。

10、A-Hz-PEG-Ligand或TAT-PEG-PMLA-Hz-PEG-Ligand和含有氨基的抗 肿瘤药物反应制备得到聚苹果酸载体药物。 8. 权利要求 1 所述的聚苹果酸载体药物在制备兼具肿瘤靶向特异性及高效入胞释药 特性药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102716495 B 3 1/7 页 4 靶向肿瘤多功能聚苹果酸载体药物 技术领域 0001 本发明涉及一种靶向肿瘤多功能聚苹果酸载体药物。 背景技术 0002 化学药物治疗是恶性肿瘤综合治疗的主要手段之一。 抗肿瘤药物通常有极高的生 物毒性而较少有生物选择性， 在杀伤肿瘤细胞的同时， 亦杀伤正常组织细胞。 由于非特异毒 性、 。

11、缺乏肿瘤选择性以及肿瘤的多药耐药性， 大多数抗肿瘤药物并不像预期那样有效， 其对 正常组织的毒副作用更是困扰化疗的主要问题。 0003 具有生物相容性和生物可降解性的高分子材料作为小分子药物的载体可在病灶 部位选择性地释放药物， 能极大地提高药物的生物利用率， 有效地降低药物的毒副作用和 用药剂量 ； 将靶向分子引入聚合物， 还可将药物主动靶向至病变部位。 目前制备聚合物前药 中应用较多的高分子材料有 ： 聚乳酸 （PLA） 、 聚乙醇酸 （PGA） ， 聚谷氨酸等。聚乳酸、 聚乙醇 酸不溶于水， 交联的药物分子在体内释放很慢， 影响药效， 而聚谷氨酸等吸水性又太强， 容 易崩解， 所以都不能。

12、作为最佳药物载体的选择。聚苹果酸 （Polymalic acid， PMLA） 是以苹 果酸为唯一单体相互通过酯键连接而成的一种脂肪族聚酯。 其在生理条件下的相对高溶解 性、 高自发降解速率和免疫惰性使得它成为优于多糖和多肽类生物高分子的新型药物控释 载体材料。- 聚苹果酸结构规整， 具有多个活性中心， 可共价连接多个具有生物学功能的 基团， 如同时携带多种药物、 多重靶向分子及荧光示踪剂等形成纳米共聚物， 是抗肿瘤药物 的高效载体。迄今为止， 以 Vert、 Cammas 和 Kajiyaina 等为代表的国外学者已对聚苹果酸 的合成、 性能和应用做了较深入的研究 ； 用其做载体制备的脑靶向。

13、聚合物前药， 不但具有良 好的生物相容性及降解性， 且改善了药物性质。 0004 尽管很多药物运载系统表现出了相当好的肿瘤靶向性， 通过抗原-抗体、 受体-配 体之间特异性结合将药物主动靶向至肿瘤细胞表面， 但肿瘤通常呈现多样细胞群， 细胞表 面有不同受体或抗原表达， 且与肿瘤复发和转移有关的 “癌症干细胞” 具有不同于其他肿瘤 细胞的显型。因此， 通常为特定抗原或受体设计的主动靶向方法对于杀伤癌细胞并非一定 有效。 且通常载体与靶细胞结合后入胞能力较弱， 并不能提供足够高的胞内药物浓度， 而细 胞毒性药物必须进入细胞才能发挥作用， 因而无法有效抑制肿瘤细胞的生长， 特别是耐药 肿瘤细胞 ； 。

14、且载体在胞外释放的药物扩散后有可能重新分布到正常组织， 降低靶向药物的 特异性。因此， 生物活性分子的细胞内转运仍是药物转运中的一个关键问题。 0005 细胞穿膜肽 （cell-penetrating peptides， CPP） 是近年来发现的一类能携带大分 子物质进入细胞的短肽， 其穿膜作用不依赖经典的胞吞作用， 具有细胞膜亲和性高、 穿膜速 度快、 可迅速被降解等优势， 尤以 TAT（transcriptional activator protein） 穿膜肽研究 最为成熟。 通过无受体介导、 无耗能的方式， 穿膜肽可将肽段、 蛋白质、 甚至比自身分子量大 很多倍的寡聚核苷酸、 脂质体带。

15、入细胞， 转导率几乎能达到100%。 但穿膜肽用于体内递药系 统研究时疗效并不理想， 存在的主要问题是 CPP 缺乏靶特异性， 对所有的细胞具有相同的 转导活性 ； 非靶向组织通过 CPP 介导， 也可通过非特异性的细胞内化作用摄取嵌合体。 说 明 书 CN 102716495 B 4 2/7 页 5 0006 Sethuraman 等以 pH 敏感的聚合物和细胞穿膜肽 TAT 为基础构建了一种多功能聚 合物胶束系统， 该系统由两部分组成 ： 一部分是 TAT 为靶头的胶束， 聚乳酸 （PLLA） 构成疏水 内核， TAT 连接于亲水嵌段聚乙二醇 （PEG） 的末端 ； 另一部分为 pH 敏感。

16、的二嵌段共聚物聚 磺胺间二甲氧嘧啶 - 聚乙二醇 （PSD-PEG） 。在生理条件下， 带负电的 PSD 与带正电的 TAT 相 结合， PSD-PEG 覆盖于 TAT 胶束的外面， 将靶头 TAT 隐藏， 在肿瘤部位的 pH 环境下， PSD-PEG 与 TAT 胶束分离而将靶头暴露出来。与之类似， Lee 等制备的多功能混合胶束， 在生理环境 下 （pH7.4） ， TAT 通过 pH 敏感的聚组氨酸 （polyHis） 锚定在疏水内核上。当胶束暴露在肿瘤 或者炎症部位时 （6.5pH7.0） ， polyHis 一定程度被质子化， 亲水性增加， TAT 暴露出来并 介导内吞。但受胶束稳定。

17、性的限制， 穿膜肽在到达靶位前能否被安全保护， 仍面临着挑战。 因此， 如何构建兼有肿瘤靶向特异性及高效入胞释药特性双重功能的靶向释药体系是提高 肿瘤靶向制剂疗效的关键。 发明内容 0007 本发明的目的是提供一种兼有肿瘤靶向特异性及高效入胞释药特性的多功能聚 苹果酸载体药物。 0008 本发明另一目的是提供上述聚苹果酸载体药物的制备方法。 0009 本发明实现过程如下 ： 0010 一种聚苹果酸载体药物， 是将药物固定在聚苹果酸载体上， 其特征在于 ： 0011 （1） 所述药物为含有氨基或可引入氨基的抗肿瘤药物及其衍生物 ； 0012 （2） 聚苹果酸载体上连接有穿膜肽 ； 0013 （3。

18、） 靶向基团 Ligand 或柔性链修饰的靶向基团通过易断裂键 （如腙键） 连接在聚 苹果酸载体上。 0014 所述柔性链可以为聚乙二醇连接， 分子量为 3000 7000。 0015 所述的聚苹果酸的分子量为 1000200,000。 0016 所述抗肿瘤药物或其衍生物为阿霉素 （DOX） 、 氨基喜树碱 （CPT-NH2） 、 阿扎胞苷或 克拉曲滨。 0017 所述穿膜肽 CPP 通过柔性短链修饰或直接连接到聚苹果酸载体上， 所述柔性短链 为聚乙二醇连接， 分子量为 500 3000， 其还包括具有穿过细胞核、 细胞膜功能的短肽， 如 核定位信号肽 （NLS） 等。 0018 所述靶向基团。

19、为具有肿瘤细胞靶向作用的物质， 包括所有实体瘤组织表面有其对 应的相对高表达的受体的配体， 种类为维生素、 蛋白、 肽类、 多糖、 整合素等， 如叶酸 （FA） 、 促 黄体激素释放激素 （LHRH） 、 生物素 （biotin） 、 转铁蛋白、 低密度脂蛋白、 甘草次酸、 凝集素、 抗肿瘤融合蛋白、 单克隆抗体或人工合成配体 （如 Angiopep-2） 。 0019 上述聚苹果酸载体药物的制备方法， 包括以下步骤 ： 0020 （1） 在 1-（3- 二甲氨基丙基） -3- 乙基碳二亚胺盐酸盐 （EDCHCl） 、 N- 羟基丁二酰 亚胺 （NHS） 和三乙胺 （TEA） 的催化下， 聚苹。

20、果酸 （PMLA） 与水合肼反应制备得到 PMLA-NH2， 其 中聚苹果酸中含有的羧基和水合肼的摩尔比在 101 之间 ； 0021 （2）选用含有醛基的聚乙二醇和靶向基团 Ligand 反应制备得到靶向基团修饰 化的聚乙二醇 OHC-PEG-Ligand， 选用的含有醛基的聚乙二醇的分子量在 35007000， 其中 说 明 书 CN 102716495 B 5 3/7 页 6 Ligand 与醛基聚乙二醇的反应摩尔比在 0.110 之间 ； 0022 （3）将 PMLA-NH2与 OHC-PEG-Ligand 溶解到 DMF 溶剂中， 室温下发生反应得到 PMLA-Hz-PEG-Liga。

21、nd， 形成所需的腙键间隔基， 其中 PMLA-NH2中氨基与 OHC-PEG-Ligand 的 反应摩尔比在 0.51 ； 0023 （4） PMLA-Hz-PEG-Ligand 和穿膜肽 TAT 或 TAT-PEG 反应得到 TAT-PMLA-Hz-PEG-Ligand 或 TAT-PEG-PMLA-Hz-PEG-Ligand，其 中 短 链 PEG 的 分 子 量 5003000 ； 0024 （5）在 1-（3- 二 甲 氨 基 丙 基） -3- 乙 基 碳 二 亚 胺 盐 酸 盐 （EDCHCl） 、 N- 羟 基 丁 二 酰 亚 胺 （NHS）和 三 乙 胺 （TEA）的 催 化 。

22、下， 将 TAT- PMLA-Hz-PEG-Ligand 或 TAT-PEG-PMLA-Hz-PEG-Ligand 和含有氨基的抗肿瘤药物或其衍生物反应制备得到聚苹果 酸载体药物 TAT- PMLA（drug） -Hz-PEG-Ligand 或 TAT-PEG-PMLA（drug） -Hz-PEG-Ligand。 0025 PMLA-Hz-PEG6-FA 的合成路线如下 ： 0026 0027 说 明 书 CN 102716495 B 6 4/7 页 7 0028 上述的聚苹果酸载体药物在制备兼具肿瘤靶向特异性及高效入胞释药特性药物 中的应用。 0029 本发明在聚苹果酸主链上采用弱酸性环境下。

23、易断裂的腙键间隔基连接柔性长链 上的靶向基团， 短链的间隔基团连接穿膜肽 （TAT） 及抗肿瘤药物， 形成一定的层次感。在保 护 TAT 时， 可以在聚苹果酸主链上键合单一的柔性链 （如聚乙二醇） 或柔性链修饰的靶向基 团。穿膜肽可直接或间接通过不同分子量柔性链与聚苹果酸主链连接， 且该链的长度要小 于靶向基团 （或PEG） 和聚苹果酸间的链长。 本发明使用聚苹果酸为聚合物载体， 通过柔性链 将靶向基团键合， 可以达到主动靶向的效果 ； 在到达肿瘤组织部位后， 酸敏连接臂可以感应 肿瘤组织酸性环境与聚苹果酸主链断开。通过直接或者使用较短的柔性链连接的穿膜肽， 可以促进药物到达肿瘤组织后快速入胞。

24、。 0030 本发明选用聚苹果酸为基材， 可赋予前药良好的生物相容性和体内降解性。在其 主链上分别键合亲水性良好的配体修饰的聚乙二醇 （PEG） 、 穿膜肽 （CPP） 及抗肿瘤药物。采 用屏蔽 / 去屏蔽方法解决 CPP 缺乏特异性的瓶颈问题， 即 CPP 在到达靶向区域前先被隐藏， 避免 CPP 介导的非特异性穿膜 ； 在配体介导到达靶向区域后， CPP 才完全暴露促进有效的细 说 明 书 CN 102716495 B 7 5/7 页 8 胞内化。 0031 本发明以 pH 敏感的化学键 （腙键） 和聚苹果酸为基础构建了一种多功能纳米复合 系统， 利用不同分子量柔性链段 （PEG 链） 分。

25、别运载配体 （或单克隆抗体、 凝集素、 生物素等） 、 穿膜肽， 使他们互不干扰， 在肿瘤酸性环境下， 依次发挥靶向累积及内化入胞作用。在正常 体循环中 （pH7.4） ， 短链 PEG 上的 TAT（生物素等） 隐蔽在长链 PEG 的保护层中 ； 在肿瘤酸 性环境中， 连接长链 PEG 的酸敏部位解离， 失去保护层， TAT 裸露在微粒表面， 从而实现针对 肿瘤细胞的内化。这种靶向释药体系可以使药物特异性的聚集在肿瘤部位， 并穿过靶细胞 膜将药物高效转运至肿瘤细胞内， 进而响应溶酶体酸性环境 （pH6.0） 释药。 0032 本发明的优点与积极效果 ：（1） 将多种功能巧妙的整合于同一个聚合。

26、物体系中， 使得聚苹果酸纳米接枝物成为更理想的药物递送载体。 该释药体系可以使药物特异性的聚 集在肿瘤部位， 并穿过靶细胞膜将药物高效转运至肿瘤细胞内， 进而响应肿瘤细胞内体酸 性环境释药。 （2） 本发明充分利用聚苹果酸结构特点， 将不同生物特性的活性分子依次连接 在聚苹果酸上， 通过屏蔽 - 去屏蔽效应， 构建了兼有肿瘤靶向、 高效入胞释药特性的聚合物 药物体系。该体系通过配体 - 受体、 抗体 - 抗原特异性的结合， 实现主动靶向肿瘤部位的功 能。而穿膜肽在正常体循环中， 隐藏在保护层中， 到达靶位后， 在肿瘤细胞外酸性环境下保 护层消失， 穿膜肽暴露出来， 从而实现针对肿瘤细胞的快速内。

27、化。 这种可对实体肿瘤环境做 出响应的复合功能胶束， 为构建高效低毒的肿瘤靶向给药系统提供了新策略。 （3） 本发明所 用的载体材料聚苹果酸是一种可生物降解的材料， 其降解产物为人体本身具有的物质， 不 会产生蓄积毒性和毒副作用， 具有无毒性、 无免疫原性和抗原性、 生物相容性好的特点。 附图说明 0033 图 1 为 PMLA(A), PMLA-NH2(B) 的红外光谱 0034 图 2 为 O-PEG6-FA(C), PMLA-Hz-PEG6-FA(D) 的核磁图谱 ； 0035 图 3 为聚苹果酸载药胶束的透射电镜图 ； 0036 图4为两小时后不同pH时A2780细胞对聚苹果酸纳米复合。

28、物的内摄作用图 （A ： pH 7.4 ； B ： pH 6.8） ； 0037 图 5 为聚苹果酸载体药物结构示意图。 具体实施方式 0038 以下是发明人给出的实施例， 本发明不限于这些实施例。 0039 实施例 1 ： TAT-PEG2-PMLA(DOX)-Hz- PEG6-FA 载药体系的建立 0040 （1） 醛基聚乙二醇 - 叶酸 （CHO-PEG6-FA） 的制备 0041 称取 44 mg 叶酸 （FA） 溶于适量的 DMSO 中， 依次加入 22mg (Boc)2O、 20 mg 三乙胺， 室温避光反应 4 h， 得到 Boc 保护的 FA ； 然后依次加入 170 mg H。

29、O-PEG6-CHO （Mn： 6000） 、 19 mg EDC HCl、 10 mg DMAP， 室温避光， 搅拌过夜 ； 反应液用 DMSO 透析 24 h， 去离子水透析 48 h， 冷冻干燥， 得到 CHO-PEG-FA(Boc) ； 将 CHO-PEG-FA(Boc) 溶于 10 mL 的无水 CH2Cl2中， 滴 加 5 mL TFA， 室温搅拌 4 h， 旋蒸除去 CH2Cl2和 TFA， 得到 FA-PEG-CHO。 0042 说 明 书 CN 102716495 B 8 6/7 页 9 0043 （2） 带有酰肼键的聚苹果酸 （PMLA-NH2） 的制备 0044 称取 8。

30、0 mg PMLA， 88 mg NHS 溶于 20 ml DMF 中， 室温下搅拌 5 min。加入 192 mg EDC HCl， 冰水浴中反应2 h。 逐滴加入1 ml 5 %水合肼溶液， 室温下反应过夜。 反应后的 溶液用去离子水透析两天， 冷冻干燥得产物。 PMLA的红外图谱 （图1A） 相比， 图 1B中在1612 cm-1出现了新的强吸收峰， 为酰胺键中羰基的特征吸收峰， 表明形成了酰胺键， PMLA-NH2合 成成功。NH2取代度以每 100 个结构单元 （即羧基） 上取代的氨基数目计， 经测定为 75。 0045 （3） 聚苹果酸 - 聚乙二醇 - 叶酸 （PMLA-Hz-P。

31、EG6-FA） 的制备 0046 称取 6 mg PMLA-NH2和 126 mg OHC-PEG6-FA 溶于 20 mLDMF 中， 室温下反应 24 h。 去离子水透析 48 小时， 冷冻干燥， 得淡黄色固体。PEG6-FA 的接枝率以摩尔百分比计 （即所 连接的 PEG6-FA 摩尔数与结构单元的摩尔数比） ， 通过紫外分光光度法 （280nm） 测得产物接 枝率为 8.65 mol%。图 2A 图 2B 的 6.7-9.0 ppm 处均出现了叶酸的特征峰， 证实了目标产物 的生成。 0047 （4） TAT-PEG2-PMLA(DOX)-Hz-PEG6-FA 的制备 0048 称取适。

32、量 HO-PEG2-COOH（Mn ： 2,000） 溶入适量的 DMF 中， 加入 EDCHCl 和 TEA， 冰 水浴条件下将 TAT-NH2的 DMF 溶液缓慢滴加进去， 0反应 2h 后室温反应 24 h。反应液用 去离子水透析， 冷冻干燥得到 TAT-PEG2-OH。将 （3） 得到的产物 PMLA-Hz-PEG6-FA 溶于适量 DMF 中， 加入 192mg EDCHCl、 0.14mL TEA， 冰水浴搅拌。将已预先溶于 DMF 的 TAT-PEG2-OH 和定量的阿霉素 （DOX） 溶液逐渐加入到该体系中， 0反应 2h 后转移至室温反应 24 h。反 应结束后用去离子水透析。

33、 24 h， 冷冻干燥得到黄色粉末状产物。 0049 （5） 聚合物胶束的制备 0050 称取 10mg 终产物溶于 20mLDMSO 中， 去离子水中透析 24h， 自组装成纳米胶束 （图 说 明 书 CN 102716495 B 9 7/7 页 10 3） ， 形态圆整。 0051 （6） 细胞内摄实验 0052 以 A2780 为细胞模型， 将对数生长期的受试细胞配制成 5105/mL 的细胞悬液， 按 每孔200L接种到96孔板上， 待细胞长到约80%汇合时， 倒掉原有培养基， 分别换上pH6.6 和 pH7.4 的 200L（2g/mL） 的 TAT-PEG2-PMLA(DOX)-H。

34、z-PEG6-FA 溶液共培养 2h， 之后先 用 PBS 冲洗干净样品池， 3% 的戊二醛固定 5min 后， hoechst33342 荧光染料对细胞进行染色 15min， 荧光显微镜下观察细胞的内摄现象。细胞内摄实验结果表明， 在 pH6.6 时， 该体系入 胞效率明显高于生理 pH7.4 时的入胞效率。说明在酸性条件下， 连接叶酸的腙键断裂后， 露 出 TAT， 在穿膜肽的带领下， 快速进入细胞。流式细胞仪检测结果同样表明 ： 相同时间内， 酸 性条件下聚苹果酸纳米复合物入胞效果显著高于生理 pH 的对照组 （图 4） 。 0053 采用相同方法将靶向基团叶酸换成促黄体生成激素释放激素。

35、 （LHRH） 后制备得到 的 TAT-PEG2-PMLA(DOX)-Hz-PEG6-LHRH 纳米复合物也得到了相似的实验结果。 0054 实施例 2: TAT- PMLA(CPT-NH2)-Hz- PEG6载药体系的建立 0055 称取稍过量的聚苹果酸 （PMLA ； Mn ： 5,000） 30mg 溶于适量的 DMF 中， 加入 EDCHCl 100mg， 2 ml 5 % 水合肼， 室温搅拌过夜。加入 200mg OHC-PEG6-OH（Mn ： 6,000）室温搅 拌 10h。结束后用去离子水透析 48h， 以除去未反应的底物和溶剂， 冷冻干燥即得产物 PMLA-Hz-PEG6-O。

36、H。 0056 将 PMLA-Hz- PEG6-OH 溶于适量 DMF 中， 加入 EDCHCl 和 TEA， 冰水浴搅拌。将适量 的 TAT 的 DMF 溶液逐滴加入到该体系中， 再加入 50mg 氨基喜树碱 (CPT-NH2)， 0反应 2h 后 转移至室温反应24h， 去离子水透析24h， 冷冻干燥得到黄色粉状物TAT-PMLA(CPT-NH2)-Hz- PEG6。 0057 初步生物学实验证实这种保护/去保护TAT的方法可以有效的增强纳米复合物的 内摄效率， 达到高效入胞的效果。本发明聚苹果酸载体药物， 可以是接枝物刷状结构， 也可 以是聚合物胶束 （如图 5 所示） ， 成胶束的过程中也可采用物理包封的方式将某些不易连接 的药物及增敏剂载入。 说 明 书 CN 102716495 B 10 1/4 页 11 图 1 说 明 书 附 图 CN 102716495 B 11 2/4 页 12 图 2 说 明 书 附 图 CN 102716495 B 12 3/4 页 13 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102716495 B 13 4/4 页 14 图 5 说 明 书 附 图 CN 102716495 B 14 。