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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810677701.7 (22)申请日 2018.06.27 (71)申请人 芜湖东源新农村开发股份有限公司 地址 241300 安徽省芜湖市南陵县南翔路 118号 (72)发明人 汪锡文 裴宝平 邱许凤 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (54)发明名称 瓜蒌的组织培养方法 (57)摘要 本发明公开了一种瓜蒌的组织培养方法， 包 括： 1） 将瓜蒌茎切段作为外植体进行热处理脱 菌， 接着置于酒精溶液中进行二次灭菌， 然后置 于初代培养基中进行诱。
2、导培养、 于增殖培养基中 进行增殖培养得到分化幼苗； 2） 将分化幼苗于生 根培养基中进行生根培养、 接着置于5以下进 行低温处理以得到组织培养苗； 3） 将组织培养苗 炼苗； 其中， 初代培养基为含有萘乙酸NAA、 6-苄 基腺嘌呤6-BA和肌醇的MS培养基； 增殖培养基为 含有玉米素ZT、 卡那霉素、 2,4-D和番茄汁的MS培 养基； 生根培养基含有多效唑、 吲哚丁酸IBA和香 蕉泥的1/2MS培养基。 该瓜蒌的组织培养方法具 有优异的成活率以及繁殖率。 权利要求书2页 说明书6页 CN 108935099 A 2018.12.07 CN 108935099 A 1.一种瓜蒌的组织培养方。
3、法， 其特征在于， 包括： 1） 将瓜蒌茎切段作为外植体进行热处理脱菌， 接着置于酒精溶液中进行二次灭菌， 然 后置于初代培养基中进行诱导培养、 于增殖培养基中进行增殖培养得到分化幼苗； 2） 将所述分化幼苗于生根培养基中进行生根培养、 接着置于5以下进行低温处理以 得到组织培养苗； 3） 将所述组织培养苗炼苗； 其中， 步骤1） -2） 的培养条件均至少符合以下条件： 无菌且透气； 所述初代培养基为含 有萘乙酸NAA、 6-苄基腺嘌呤6-BA和肌醇的MS培养基； 所述增殖培养基为含有玉米素ZT、 卡 那霉素、 2,4-D和番茄汁的MS培养基； 所述生根培养基含有多效唑、 吲哚丁酸IBA和香蕉。
4、泥的 1/2MS培养基。 2.根据权利要求1所述的组织培养方法， 其特征在于， 在所述初代培养基中， 所述NAA的 浓度为0.8-1.3mg/L， 所述6-BA的浓度为0.2-0.4mg/L， 所述肌醇的浓度为0.8-1.3mg/L； 在所述增殖培养基中， 所述ZT的浓度为0.2-0.4mg/L， 所述卡那霉素的浓度为0.8- 1.3mg/L， 所述2,4-D的浓度为0.4-0.6mg/L， 所述番茄汁的浓度为2-5mg/L； 在所述生根培养基中， 所述多效唑的浓度为0.05-0.1mg/L， 所述IBA的浓度为0.3- 0.6mg/L， 所述香蕉泥的浓度为3-4.5g/L。 3.根据权利要求。
5、1所述的组织培养方法， 其特征在于， 所述初代培养基、 增殖培养基以 及生根培养基均含有3-6g/L的琼脂和14-18g/L的蔗糖， 且pH值为6.0-7.0。 4.根据权利要求1所述的组织培养方法， 其特征在于， 所述热处理脱菌满足以下条件： 脱菌温度为42-48， 脱菌时间为3-6min。 5.根据权利要求1所述的组织培养方法， 其特征在于， 所述二次灭菌满足以下条件： 灭 菌时间为15-25min， 灭菌温度为15-35； 所述酒精溶液中乙醇的浓度为60-70体积%。 6.根据权利要求1-5中任意一项所述的组织培养方法， 其特征在于， 所述外植体的长度 为0.25-0.35cm。 7.根。
6、据权利要求1-5中任意一项所述的组织培养方法， 其特征在于， 所述诱导培养满足 以下条件： 先暗培养1-2天， 接着转入光暗交替的条件下培养4-6天； 其中， 光暗交替条件为： 光照时间为12-14h/天， 光照强度为1400-1600lux， 培养温度为25-30， 相对湿度为50- 60%。 8.根据权利要求1-5中任意一项所述的组织培养方法， 其特征在于， 所述增殖培养于光 暗交替条件下培养8-10天， 光暗交替条件为： 光照时间为12-14h/天， 光照强度为1700- 1900lux， 培养温度为20-25， 相对湿度为50-60%。 9.根据权利要求1-5中任意一项所述的组织培养方。
7、法， 其特征在于， 所述生根培养于光 暗交替条件下培养10-15天， 光暗交替条件为： 光照时间为12-14h/天， 光照强度为2000- 2200lux， 培养温度为20-25， 相对湿度为50-60%； 优选地， 所述低温处理的时间为8-12h。 10.根据权利要求1-5中任意一项所述的组织培养方法， 其特征在于， 步骤1） -2） 中的无 菌且透气条件通过以下操作获得： 培养环境为带防菌透气膜的组培瓶； 优选地， 透气膜至少满足以下条件： 孔隙为0.2-0.3um， 开孔率80-90； 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 108935099 A 2 更优选地， 所述炼苗的条件为： 。
8、光照时间为12-14h/天， 黑暗时间为10-12h/天， 光照强 度为1800-2000lux， 温度为21-23， 相对湿度为75-85%， 时间为5-7天。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 108935099 A 3 瓜蒌的组织培养方法 技术领域 0001 本发明涉及组织培养， 具体地， 涉及一种瓜蒌的组织培养方法。 背景技术 0002 瓜蒌是葫芦科， 又称栝楼， 属多年生攀缘草本， 长可达10米。 根状茎肥厚， 圆柱状， 外皮黄色。 茎多分枝， 无毛； 叶互生， 近圆形或心形， 雌雄异株； 雄花数朵总状花序， 少有单 生， 花冠裂片倒卵形， 雌花单生， 子房卵形， 果实近球形。
9、， 熟时橙红色， 花果期7-11月。 瓜蒌分 布于中国辽宁、 华北、 华东、 中南、 陕西、 甘肃、 四川、 贵州和云南。 生于海拔200-1800米的山 坡林下、 灌丛中、 草地和村旁田边。 因本种为传统中药天花粉和栝楼， 故在其自然分布区内、 外， 广为栽培， 分布于朝鲜、 日本、 越南和老挝。 瓜蒌有解热止渴、 利尿、 镇咳祛痰等作用。 种 子含脂花肪油； 果实含三萜皂苷、 有机酸、 树脂、 糖类、 色素； 根含蛋白质、 皂苷、 酸类。 0003 瓜蒌的繁殖方法有两种， 其中， 分根繁殖： 3月中下旬挖取3-5年生断面白色新鲜的 健壮雌株的老根， 分成7-10cm的小段， 穴栽， 浇足水。
10、， 约10余天出苗， 每年结合中耕施追肥2- 3次。 种子繁殖： 9-10月采收果实， 待果皮稍软， 取出种子以草木灰拌种擦去果肉， 干藏过冬； 亦可带果梗悬挂于通风处。 冷床育苗在早春进行， 将种子尖头插入土中， 常喷水保持苗床湿 润、 待种子萌动时， 开始通气， 床温控制在22左右， 约10日后出土， 见真叶伸出即可上盆或 分栽培育。 直播在4月进行， 选择土壤肥沃， 排水良好之地， 开穴施足基肥， 穴距30x40厘米。 覆土后点播种子， 再盖厚2厘米泥， 约半个月出土， 当有真叶2片时每穴留苗1株， 待蔓长至50 厘米时插引杆。 但是瓜蒌野生资源有限且遭严重破坏， 尽管各地有少量引种栽培。
11、， 但是其产 量缺远不能满足市场要求。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种瓜蒌的组织培养方法， 该瓜蒌的组织培养方法具有优异 的成活率以及繁殖率。 0005 为了实现上述目的， 本发明提供了一种瓜蒌的组织培养方法， 包括： 1） 将瓜蒌茎切段作为外植体进行热处理脱菌， 接着置于酒精溶液中进行二次灭菌， 然 后置于初代培养基中进行诱导培养、 于增殖培养基中进行增殖培养得到分化幼苗； 2） 将分化幼苗于生根培养基中进行生根培养、 接着置于5以下进行低温处理以得到 组织培养苗； 3） 将组织培养苗炼苗； 其中， 步骤1） -2） 的培养条件均至少符合以下条件： 无菌且透气； 初代培养基为含有。
12、萘 乙酸NAA、 6-苄基腺嘌呤6-BA和肌醇的MS培养基； 增殖培养基为含有玉米素ZT、 卡那霉素、 2, 4-D和番茄汁的MS培养基； 生根培养基含有多效唑、 吲哚丁酸IBA和香蕉泥的1/2MS培养基。 0006 在上述技术方案中， 本发明以瓜蒌茎切段作为外植体， 然后依次经过诱导培养、 增 殖培养、 生根培养、 炼苗以得到成熟的瓜蒌苗， 在各个培养工序中采用特定的培养基进而使 得得到的瓜蒌苗具有优异的成活率和高产率， 在此基础上能够大面积的进行培育瓜蒌， 从 说 明 书 1/6 页 4 CN 108935099 A 4 而为瓜蒌的组织培养的推广奠定了坚实的基础。 0007 本发明的其他特。
13、征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。 具体实施方式 0008 以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。 应当理解的是， 此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明， 并不用于限制本发明。 0009 本发明提供了一种瓜蒌的组织培养方法， 包括： 1） 将瓜蒌茎切段作为外植体进行热处理脱菌， 接着置于酒精溶液中进行二次灭菌， 然 后置于初代培养基中进行诱导培养、 于增殖培养基中进行增殖培养得到分化幼苗； 2） 将分化幼苗于生根培养基中进行生根培养、 接着置于5以下进行低温处理以得到 组织培养苗； 3） 将组织培养苗炼苗； 其中， 步骤1） -2） 的培养条件均至少符合以下条件： 。
14、无菌且透气； 初代培养基为含有萘 乙酸NAA、 6-苄基腺嘌呤6-BA和肌醇的MS培养基； 增殖培养基为含有玉米素ZT、 卡那霉素、 2, 4-D和番茄汁的MS培养基； 生根培养基含有多效唑、 吲哚丁酸IBA和香蕉泥的1/2MS培养基。 0010 在上述组织培养方法中， 各个培养基中的组分浓度可以在宽的范围内选择， 但是 为了进一步提高瓜蒌的的成活率和繁殖效率， 优选地， 在初代培养基中， NAA的浓度为0.8- 1.3mg/L， 6-BA的浓度为0.2-0.4mg/L， 肌醇的浓度为0.8-1.3mg/L； 在增殖培养基中， ZT的浓 度为0.2-0.4mg/L， 卡那霉素的浓度为0.8-1。
15、.3mg/L， 2,4-D的浓度为0.4-0.6mg/L， 番茄汁的 浓度为2-5mg/L； 在生根培养基中， 多效唑的浓度为0.05-0.1mg/L， IBA的浓度为0.3-0.6mg/ L， 香蕉泥的浓度为3-4.5g/L。 0011 在本发明的各种培养基中， 为了更好地为各个组织提供优异的养分以及适宜的培 养条件， 优选地， 初代培养基、 增殖培养基以及生根培养基均含有3-6g/L的琼脂和14-18g/L 的蔗糖， 且pH值为6.0-7.0。 0012 在本发明中， 热处理脱菌的条件可以在宽的范围内选择， 但是为了进一步提高灭 菌效果， 优选地， 热处理脱菌满足以下条件： 脱菌温度为42。
16、-48， 脱菌时间为3-6min。 0013 在本发明中， 二次灭菌的条件以及酒精溶液中各组分的浓度也可以在宽的范围内 选择， 但是为了进一步提高灭菌效果， 优选地， 二次灭菌满足以下条件： 灭菌时间为15- 25min， 灭菌温度为15-35； 酒精溶液中乙醇的浓度为60-70体积%。 0014 在本发明中， 外植体的大小可以在宽的范围内选择， 但是为了进一步提高瓜蒌的 成活率和繁殖效率， 优选地， 外植体的长度为0.25-0.35cm。 0015 在本发明中， 诱导培养的条件可以在宽的范围内选择， 但是为了进一步提高瓜蒌 的成活率和繁殖效率， 优选地， 诱导培养满足以下条件： 先暗培养1-。
17、2天， 接着转入光暗交替 的条件下培养4-6天； 其中， 光暗交替条件为： 光照时间为12-14h/天， 光照强度为1400- 1600lux， 培养温度为25-30， 相对湿度为50-60%。 0016 在本发明中， 增殖培养的条件可以在宽的范围内选择， 但是为了进一步提高瓜蒌 的成活率和繁殖效率， 优选地， 增殖培养于光暗交替条件下培养8-10天， 光暗交替条件为： 光照时间为12-14h/天， 光照强度为1700-1900lux， 培养温度为20-25， 相对湿度为50- 60%。 说 明 书 2/6 页 5 CN 108935099 A 5 0017 在本发明中， 生根培养的条件可以在。
18、宽的范围内选择， 但是为了进一步提高瓜蒌 的成活率和繁殖效率， 优选地， 生根培养于光暗交替条件下培养10-15天， 光暗交替条件为： 光照时间为12-14h/天， 光照强度为2000-2200lux， 培养温度为20-25， 相对湿度为50- 60%。 0018 在本发明中， 低温处理的时间可以在宽的范围内选择， 但是为了进一步提高瓜蒌 的成活率和繁殖效率； 优选地， 所述低温处理的时间为8-12h 在本发明中， 无菌且透气条件的获取可以在宽的范围内选择， 但是为了进一步提高瓜 蒌的成活率和繁殖效率， 优选地， 步骤1） -2） 中的无菌且透气条件通过以下操作获得： 培养 环境为带防菌透气膜。
19、的组培瓶； 其中， 透气膜的具体条件也可以在宽的范围内选择， 但是为 了进一步提高多肉植物的成活率和繁殖效率， 更优选地， 透气膜至少满足以下条件： 孔隙为 0.2-0.3um， 开孔率80-90。 0019 在本发明中， 炼苗的条件可以在宽的范围内选择， 但是为了进一步提高瓜蒌的成 活率和繁殖效率， 优选地， 炼苗的条件为： 光照时间为12-14h/天， 黑暗时间为10-12h/天， 光 照强度为1800-2000lux， 温度为21-23， 相对湿度为75-85%， 时间为5-7天。 0020 以下将通过实施例对本发明进行详细描述。 在以下实施例中， MS培养基以及1/2MS培养 基的基本。
20、组分参见表1和2； 其中， 表1中为MS培养基以及1/2MS培养基中不同浓度组分的统 计表， 表2中为MS培养基以及1/2MS培养基中相同浓度组分的统计表。 0021 表1 说 明 书 3/6 页 6 CN 108935099 A 6 表2 实施例1 1） 将长度为0.3cm的瓜蒌茎切段作为外植体进行热处理脱菌 （脱菌温度为46， 脱菌时 间为5min） ， 接着置于酒精溶液 （乙醇的浓度为60-70体积%） 中进行二次灭菌 （灭菌时间为 20min， 灭菌温度为20） ， 然后置于初代培养基中进行诱导培养 （先暗培养1.5天， 接着转入 说 明 书 4/6 页 7 CN 108935099 。
21、A 7 光暗交替的条件下培养5天； 其中， 光暗交替条件为： 光照时间为13h/天， 光照强度为 1500lux， 培养温度为28， 相对湿度为55%） 、 于增殖培养基中进行增殖培养 （于光暗交替条 件下培养9天， 光暗交替条件为： 光照时间为13h/天， 光照强度为1800lux， 培养温度为22， 相对湿度为55%） 得到分化幼苗； 2） 将分化幼苗于生根培养基中进行生根培养 （于光暗交替条件下培养13天， 光暗交替 条件为： 光照时间为13h/天， 光照强度为2100lux， 培养温度为23， 相对湿度为55%） 、 接着 置于5以下进行低温处理10h以得到组织培养苗； 3） 将组织培。
22、养苗炼苗得到瓜蒌幼苗 （光照时间为13h/天， 黑暗时间为11h/天， 光照强度 为1900lux， 温度为22， 相对湿度为79%， 时间为6天） ； 其中， 步骤1） -2） 的培养条件均至少符合以下条件： 无菌且透气， 于带防菌透气膜的组 培瓶中进行， 透气膜满足以下条件： 孔隙为0.25um， 开孔率85； 初代培养基为含有1mg/L NAA、 0.3mg/L 6-BA、 1mg/L肌醇的MS培养基； 增殖培养基为含有0.3mg/L ZT、 1mg/L卡那霉 素、 0.5mg/L 2,4-D的浓度为、 3mg/L番茄汁的MS培养基； 在生根培养基中， 0.08mg/L多效唑、 0.5m。
23、g/L IBA的浓度、 3.5g/L香蕉泥的1/2MS培养基； 初代培养基、 增殖培养基以及生根培养 基均含有5g/L的琼脂和15g/L的蔗糖， 且pH值为6.5。 0022 实施例2 1） 将长度为0.25cm的瓜蒌茎切段作为外植体进行热处理脱菌 （脱菌温度为42， 脱菌 时间为6min） ， 接着置于酒精溶液 （乙醇的浓度为60体积%） 中进行二次灭菌 （灭菌时间为 15min， 灭菌温度为35） ， 然后置于初代培养基中进行诱导培养 （先暗培养1天， 接着转入光 暗交替的条件下培养4天； 其中， 光暗交替条件为： 光照时间为12h/天， 光照强度为1400lux， 培养温度为25， 相对。
24、湿度为50%） 、 于增殖培养基中进行增殖培养 （于光暗交替条件下培养 8天， 光暗交替条件为： 光照时间为12h/天， 光照强度为1700lux， 培养温度为20， 相对湿度 为50%） 得到分化幼苗； 2） 将分化幼苗于生根培养基中进行生根培养 （于光暗交替条件下培养10天， 光暗交替 条件为： 光照时间为12h/天， 光照强度为2000lux， 培养温度为20， 相对湿度为50%） 、 接着 置于5以下进行低温处理8h以得到组织培养苗； 3） 将组织培养苗炼苗得到瓜蒌幼苗 （光照时间为12h/天， 黑暗时间为10h/天， 光照强度 为1800lux， 温度为21， 相对湿度为75%， 时。
25、间为5天） ； 其中， 步骤1） -2） 的培养条件均至少符合以下条件： 无菌且透气， 于带防菌透气膜的组 培瓶中进行， 透气膜满足以下条件： 孔隙为0.25um， 开孔率85； 初代培养基为含有0.8mg/L NAA、 0.2mg/L 6-BA、 0.8mg/L肌醇的MS培养基； 增殖培养基为含有0.2mg/L ZT、 0.8mg/L卡那 霉素、 0.4mg/L 2,4-D的浓度为、 2mg/L番茄汁的MS培养基； 在生根培养基中， 0.05mg/L多效 唑、 0.3mg/L IBA的浓度、 3g/L香蕉泥的1/2MS培养基； 初代培养基、 增殖培养基以及生根培 养基均含有3g/L的琼脂和1。
26、4g/L的蔗糖， 且pH值为6.0。 0023 实施例3 1） 将长度为0.35cm的瓜蒌茎切段作为外植体进行热处理脱菌 （脱菌温度为48， 脱菌 时间为3min） ， 接着置于酒精溶液 （乙醇的浓度为70体积%） 中进行二次灭菌 （灭菌时间为 25min， 灭菌温度为35） ， 然后置于初代培养基中进行诱导培养 （先暗培养2天， 接着转入光 暗交替的条件下培养6天； 其中， 光暗交替条件为： 光照时间为14h/天， 光照强度为1600lux， 说 明 书 5/6 页 8 CN 108935099 A 8 培养温度为30， 相对湿度为60%） 、 于增殖培养基中进行增殖培养 （于光暗交替条件下。
27、培养 10天， 光暗交替条件为： 光照时间为14h/天， 光照强度为1900lux， 培养温度为25， 相对湿 度为60%） 得到分化幼苗； 2） 将分化幼苗于生根培养基中进行生根培养 （于光暗交替条件下培养15天， 光暗交替 条件为： 光照时间为14h/天， 光照强度为2200lux， 培养温度为25， 相对湿度为60%） 、 接着 置于5以下进行低温处理12h以得到组织培养苗； 3） 将组织培养苗炼苗得到瓜蒌幼苗 （光照时间为14h/天， 黑暗时间为12h/天， 光照强度 为2000lux， 温度为23， 相对湿度为85%， 时间为7天） ； 其中， 步骤1） -2） 的培养条件均至少符合。
28、以下条件： 无菌且透气， 于带防菌透气膜的组 培瓶中进行， 透气膜满足以下条件： 孔隙为0.25um， 开孔率85； 初代培养基为含有1.3mg/L NAA、 0.4mg/L 6-BA、 1.3mg/L肌醇的MS培养基； 增殖培养基为含有0.4mg/L ZT、 1.3mg/L卡那 霉素、 0.6mg/L 2,4-D的浓度为、 5mg/L番茄汁的MS培养基； 在生根培养基中， 0.1mg/L多效 唑、 0.3-0.6mg/L IBA的浓度、 4.5g/L香蕉泥的1/2MS培养基； 初代培养基、 增殖培养基以及 生根培养基均含有6g/L的琼脂和18g/L的蔗糖， 且pH值为7.0。 0024 应用。
29、例1 取上述各实施例中100株的炼苗后的幼苗于基质中进行培养直至50%以上的植株生长 出5个叶片， 然后统计幼苗的成活率 （W） ， 同时计算10个4cm的瓜蒌茎切段在一个组织培养周 期后能够获取的成活瓜蒌的数量 （N） ， 具体结果如表3所示。 0025 表3 W/%N/棵 实施例18869 实施例27959 实施例38662 以上详细描述了本发明的优选实施方式， 但是， 本发明并不限于上述实施方式中的具 体细节， 在本发明的技术构思范围内， 可以对本发明的技术方案进行多种简单变型， 这些简 单变型均属于本发明的保护范围。 0026 另外需要说明的是， 在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征， 在不矛 盾的情况下， 可以通过任何合适的方式进行组合， 为了避免不必要的重复， 本发明对各种可 能的组合方式不再另行说明。 0027 此外， 本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合， 只要其不违背本 发明的思想， 其同样应当视为本发明所公开的内容。 说 明 书 6/6 页 9 CN 108935099 A 9 。