技术领域
本发明涉及制备用于治疗慢性髓细胞性白血病的来自北美鹅掌楸树 皮的提取物的方法，该提取物含有表美鹅掌楸内酯(epi-tulipinolide)和 木香烯内酯(costunolide)作为活性成分。此外，本发明还涉及用于治疗 慢性髓细胞性白血病的治疗剂，该治疗剂含有提取自北美鹅掌楸树皮的 表美鹅掌楸内酯和木香烯内酯。
背景技术
北美鹅掌楸(LiriodendrontulipiferaL.，Yellow-poplar)是属于木兰科 (Magnoliaceae)的一种落叶阔叶乔木。已知北美鹅掌楸的树皮中含有生 物碱、倍半萜烯和/或木酚素。
此外，北美鹅掌楸的提取物中含有倍半萜烯内酯化合物，包括木香 烯内酯、郁金香酯、表美鹅掌楸内酯、epi-tulipdienolide和/或 γ-liriodenolide。
此外，已知这些倍半萜烯内酯中的小白菊内酯(parthenolide)作为 调节核转录因子NF-κB、p21和/或细胞周期蛋白(cyclin)D1的抗癌剂 和/或抗炎剂。特别地，已知小白菊内酯和/或LC-1(二甲基氨基-小白菊 内酯)作为用于急性髓系白血病的抗癌剂，通过阻抑核转录因子NF-κB 的活性诱导细胞凋亡。
慢性髓系白血病的形式的特征在于：骨髓中主要的髓系细胞增高的、 不受调控的生长，以及血液中这些细胞的累积。此外，白血病的种类可 分为：急性髓系白血病、慢性髓系白血病、急性淋巴细胞性白血病和慢 性淋巴细胞性白血病。
在占总的成人白血病15％-20％的慢性髓系白血病的情况中，该疾病 与被称为费城染色体(Philadelphiachromosome；Ph)的染色体易位有关， 该染色体易位使骨髓中不受调控的异常的髓系细胞生长增高。此外，费 城染色体被称为BCR-ABL融合基因，该BCR-ABL融合基因由9号染色 体上的ABL基因与22号染色体上的BCR基因的易位产生。
此类异常的融合基因可诱发显示出酪氨酸激酶活性的融合蛋白的表 达，已知该融合蛋白涉及P210蛋白的生物合成。由于生物合成的P210 蛋白能够抑制髓系祖细胞的细胞凋亡，髓系祖细胞可能异常增殖，从而 引起髓系白血病。
伊马替尼(作为格列卫(Gleevec)进行市售)被用作治疗髓系白血 病的第一代治疗剂，抑制了BCR-ABL蛋白的酪氨酸激酶。然而，伊马 替尼存在以下问题：出现了具有伊马替尼耐药性的患者。
幸运的是，已开发出了第二代治疗剂(例如达沙替尼、尼罗替尼和 博舒替尼)，该第二代治疗剂能够克服对伊马替尼的耐药性。然而，由于 通过BCR-ABL的突变基因表达的T315I酶变体的出现，此类第二代治疗 剂不再能够显示出足够的功效。因此，需要克服第一代治疗剂以及第二 代治疗剂的不足的第三代治疗剂，以有效治疗由T315I酶变体引起的慢 性髓系白血病。
另一方面，本发明的发明人测量并确认了，对于显示出对第一代治 疗剂(伊马替尼)和第二代治疗剂二者的耐药性的慢性髓系白血病(CML) 的治疗而言，来自北美鹅掌楸树皮提取物的表美鹅掌楸内酯是有效的。
此外，本发明的发明人从北美鹅掌楸树皮提取物中分离出对治疗慢 性髓系白血病显示出药理学活性的组分，该组分包括表美鹅掌楸内酯和 木香烯内酯。
另一方面，在韩国专利No.10-1353306中，本发明的发明人还公开 了从北美鹅掌楸树皮中提取用于治疗胃肠道疾病的组分的方法，该组分 包括表美鹅掌楸内酯和木香烯内酯。
最后，本发明通过以下完成：使用多种提取溶剂，通过重复试验， 开发出从北美鹅掌楸树皮提取物中制备用于治疗慢性髓系白血病的提取 物(含有表美鹅掌楸内酯和木香烯内酯作为活性成分)的方法，其中， 对于通过BCR-ABL的突变基因表达的T315I酶变体的出现而引起的、对 第一代治疗剂(伊马替尼)和第二代治疗剂二者显示出耐药性的慢性髓 系白血病(CML)的治疗而言，来自3-5年树龄的北美鹅掌楸的树皮提 取物的表美鹅掌楸内酯组分是有效的。
发明内容
技术问题
待解决的问题是使用多种提取溶剂，通过重复试验，开发出从北美 鹅掌楸树皮提取物中制备用于治疗慢性髓系白血病的提取物(含有表美 鹅掌楸内酯和木香烯内酯作为活性成分)的方法，其中，对于通过 BCR-ABL的突变基因表达的T315I酶变体的出现而引起的、对第一代治 疗剂(伊马替尼)和第二代治疗剂二者显示出耐药性的慢性髓系白血病 (CML)的治疗而言，来自3-5年树龄的北美鹅掌楸的树皮提取物的表 美鹅掌楸内酯组分是有效的。
技术方案
本申请的目的是提供从北美鹅掌楸树皮提取物中制备含有表美鹅掌 楸内酯和木香烯内酯作为活性成分、用于治疗慢性髓系白血病的提取物 的方法，该方法包括以下步骤：
1)在加入并使用2-20重量份乙酸乙酯对1重量份经切碎并干燥的 北美鹅掌楸树皮进行提取后，得到初步提取物；向所得到的初步提取物 中加入0.5-10重量份丁醇，在通过分离乙酸乙酯层和丁醇层而将丁醇层 移出后，通过收集并在减压下浓缩乙酸乙酯层，得到粗提取物；以及
2)在向所得到的粗提取物中加入C1-C3低级醇水溶液和正己烷后， 通过将正己烷层中的脂质和水不溶性物质移出，得到低级醇水性混合物； 通过将所得到的低级醇水性混合物进行分离和纯化，得到含有表美鹅掌 楸内酯和木香烯内酯的高纯度提取物；
其中，所述得到的提取物含有20wt％-50wt％表美鹅掌楸内酯和 5wt％-20wt％木香烯内酯，通过选自如下方法中的至少一种进行提取：吸 香法(enfleurage)、渗漉法、超声法、浸渍法或回流法。
此外，在得到低级醇水性混合物的步骤2)之后，所述方法进一步包 括如下步骤：向低级醇水性混合物中加入水以得到低浓度的低级醇水性 层的步骤；通过向低级醇水性层中加入二氯甲烷而分离出二氯甲烷层的 步骤；以及对溶于二氯甲烷层中的物质进行分离、浓缩和干燥的步骤。
另一方面，本申请的另一目的是提供根据上述方法得到的用于治疗 慢性髓系白血病的治疗剂，该治疗剂含有来自北美鹅掌楸树皮提取物的 表美鹅掌楸内酯和木香烯内酯作为活性成分。
本申请进一步的目的是提供用于治疗慢性髓系白血病的药物组合 物，该药物组合物含有所述的作为活性成分的表美鹅掌楸内酯和木香烯 内酯、以及药学上可接受的载体。
有益效果
本申请显著有益的效果是提供从北美鹅掌楸树皮提取物中制备用于 治疗慢性髓系白血病的提取物(含有表美鹅掌楸内酯和木香烯内酯作为 活性成分)的方法，其中，对于通过BCR-ABL的突变基因表达的T315I 酶变体的出现而引起的、对第一代治疗剂(伊马替尼)和第二代治疗剂 二者显示出耐药性的慢性髓系白血病(CML)的治疗而言，来自该提取 物的表美鹅掌楸内酯组分是有效的。
附图说明
图1示出了制备例1所述的来自北美鹅掌楸树皮的经分离的提取物 的液相色谱数据。确认含有表美鹅掌楸内酯和木香烯内酯。
图2示出了对比制备例1所述的来自北美鹅掌楸树皮的提取物的液 相色谱数据。确认含有表美鹅掌楸内酯和木香烯内酯。
图3示出了1HNMR谱图，以查明通过液相色谱从制备例1所述的 北美鹅掌楸树皮提取物中分离的表美鹅掌楸内酯的化学结构。
具体实施方式
本申请提供了制备用于治疗慢性髓系白血病的提取物的方法，该提 取物含有表美鹅掌楸内酯和木香烯内酯作为活性成分，其中，对于通过 BCR-ABL的突变基因表达的T315I酶变体的出现而引起的慢性髓系白血 病的治疗而言，来自该提取物的表美鹅掌楸内酯组分是有效的。
此外，本申请提供了使用乙酸乙酯溶剂从3-5年树龄的北美鹅掌楸 树皮中提取并分离包括表美鹅掌楸内酯和木香烯内酯的组分的方法。因 此，本申请还提供了用于治疗慢性髓系白血病的治疗剂，该治疗剂含有 表美鹅掌楸内酯和木香烯内酯。
此外，本申请还提供了用于治疗通过BCR/ABL的突变基因表达的 T315I酶变体的出现而引起的、对第一代治疗剂(伊马替尼)和第二代治 疗剂二者显示出耐药性的慢性髓系白血病的治疗剂，该治疗剂含有北美 鹅掌楸树皮提取物中的表美鹅掌楸内酯和木香烯内酯作为活性成分。
以下，将对本发明进行详细描述。
本申请提供了制备用于治疗慢性髓系白血病的治疗剂的方法，该治 疗剂含有使用乙酸乙酯作为提取溶剂从提取物中分离的表美鹅掌楸内酯 和木香烯内酯作为活性成分。
因此，用于治疗慢性髓系白血病的治疗剂含有表美鹅掌楸内酯和木 香烯内酯作为活性成分。当然，可将表美鹅掌楸内酯和木香烯内酯用作 来自北美鹅掌楸树皮的提取物的标准指示物。
此外，本申请提供了用于治疗慢性髓系白血病的药物组合物，该药 物组合物含有分离自提取物的表美鹅掌楸内酯和木香烯内酯作为活性成 分。
本申请提供了制备用于治疗慢性髓系白血病的治疗剂的方法，该方 法包括以下步骤：(1)使用乙酸乙酯从北美鹅掌楸树皮中提取初步提取 物，向该初步提取物中加入丁醇，在将丁醇层移出后，得到来自乙酸乙 酯层的粗提取物(步骤1)；以及(2)通过对所得到的粗提取物进行分离 和纯化，得到含有表美鹅掌楸内酯和木香烯内酯的经分离的提取物(步 骤2)。
在步骤1中，向初步提取物中加入丁醇，通过分离乙酸乙酯层和丁 醇层而将丁醇层移出后，得到来自乙酸乙酯层的粗提取物，其中，在加 入并利用用作提取溶剂的乙酸乙酯对经切碎并干燥的北美鹅掌楸树皮进 行提取后，得到初步提取物。
在步骤2中，通过对所得到的低级醇水性混合物进行分离和纯化， 得到含有表美鹅掌楸内酯和木香烯内酯的高纯度提取物，其中，在向步 骤1中得到的粗提取物中加入C1-C3低级醇水溶液和正己烷后，通过将 正己烷层中的脂质和水不溶性物质移出，得到低级醇水性混合物。
在得到低级醇水性混合物的步骤之后，本申请的制备方法可需要进 一步的3个步骤，该步骤包括：向低级醇水性混合物中加入水以得到低 浓度的低级醇水性层的步骤；通过向低级醇水性层中加入二氯甲烷而分 离出二氯甲烷层的步骤；以及对溶于二氯甲烷层中的物质进行分离、浓 缩和干燥的步骤。
北美鹅掌楸树皮收集自位于韩国Jeollanam-do的Gangjin-gun的北美 鹅掌楸。在将所收集的北美鹅掌楸树皮切碎并粉末化后，以10-20倍于 所收集的树皮的量加入提取溶剂。提取在室温至50℃下进行24-96小时。 最后，在减压下进行浓缩和干燥后得到提取物。
本发明提供了从北美鹅掌楸树皮中提取并纯化表美鹅掌楸内酯和木 香烯内酯(如以下结构式所示)的方法。
根据高效液相色谱(HPLC)方法，使用WATERS的Alliancee2695 系统对从北美鹅掌楸树皮中得到的提取物进行分析，以测量表美鹅掌楸 内酯(保留时间＝约31分钟)和木香烯内酯(保留时间＝约36分钟)的 量。HPLC分析的条件如下：反相柱KromasilC18、样品浓度为5mg/ml， UV波长为215nm(流速：1.0ml/min)、流动相梯度条件在表1中示出。 表1：HPLC分析的流动相梯度条件
保留时间(min) 水(wt％) 甲醇(wt％) 0 98 2 10 50 50 60 0 100 70 0 100 80 98 2
作为根据表1中所示的梯度条件进行的HPLC分析的结果，分别在 保留时间为31分钟和36分钟时检测到主要成分表美鹅掌楸内酯和木香 烯内酯。此外，为分别确认表美鹅掌楸内酯和木香烯内酯的存在，以相 同的方式测量了表美鹅掌楸内酯标准品和木香烯内酯标准品各自的保留 时间。在对标准品和所得到的物质的保留时间进行比较后，我们确认通 过HPLC分离出了表美鹅掌楸内酯和木香烯内酯。
在立体化学方面，对表美鹅掌楸内酯的比旋度进行了测量。来自北 美鹅掌楸提取物的表美鹅掌楸内酯的测量值([α]D＝+74)与表美鹅掌楸 内酯的报道值([α]D＝+76)几乎一致。因此，通过立体化学确认了表美 鹅掌楸内酯的存在。
另一方面，按照LC-MS对来自北美鹅掌楸提取物的表美鹅掌楸内 酯、木香烯内酯和其它组分各自的分子量进行了测量。确认了表美鹅掌 楸内酯的分子量为290，而木香烯内酯的分子量为232。此外，还测量并 确认了其它组分(日登内酯(Mw＝264)和脱乙酰鹅掌楸内酯(Mw＝264))。
此外，还通过NMR分析确认了表美鹅掌楸内酯的化学结构。此外， 还使用HPLC分析，通过将木香烯内酯标准品与所得到的木香烯内酯提 取物进行比较，确认了木香烯内酯的存在。
用于LC-MS分析的仪器是采用使用反相柱的、由Waters制造的 LC-MS分析仪器。使用2μl的样品体积浓度，通过200-500nm的PDAUV 波长(流速为0.3ml/min)进行所述测量。HPLC的流动相梯度条件在表 2中示出。
表2：LC-MS分析的流动相梯度条件
保留时间(min) 水(wt％) ACN(wt％) 0 85 15 10 30 70 60 0 100 70 0 100
进一步而言，本申请所得到的北美鹅掌楸树皮提取物含有 40wt％-50wt％的表美鹅掌楸内酯和10wt％-20wt％的木香烯内酯，通过选 自如下方法中的至少一种进行提取：吸香法、渗漉法、超声法、浸渍法 或回流法。
实施例
(制备例1)使用乙酸乙酯溶剂制备来自北美鹅掌楸树皮的提取物
1.溶剂提取步骤
在室温下，使用2000ml乙酸乙酯对200g经干燥并切碎的北美鹅掌 楸(3-5年树龄)树皮进行搅拌并提取24小时。在减压下将提取的混合 物进行浓缩和过滤后，得到初步提取物。在室温下，将所得到的初步提 取物进行进一步混合并使用500ml丁醇提取2-4小时。然后，通过分离 和移出丁醇层而将丁醇可溶性物质移出。将剩余的混合物浓缩后，最终 得到12.54g粗提取物。
2.纯化步骤
将12.54g所得到的粗提取物用200ml70％乙醇溶解后，向粗提取物 混合物中加入200ml正己烷并搅拌。将正己烷层分离并移出后，得到70％ 乙醇层。当将所得到的混合物浓缩并冷冻干燥后，最终得到2.75g经纯 化的提取物。使用HPLC和LC-MS测量表美鹅掌楸内酯的量和木香烯内 酯的量。最后，测量并确认了表美鹅掌楸内酯为44.1wt％、木香烯内酯 为15.6wt％。
(制备例2)使用乙酸乙酯溶剂从北美鹅掌楸树皮中制备提取物
1.溶剂提取步骤
在室温下，使用2000ml乙酸乙酯对200g经干燥并切碎的北美鹅掌 楸(3-5年树龄)树皮进行搅拌并提取72小时。在减压下将提取的混合 物进行浓缩和过滤后，得到初步提取物。在室温下，将所得到的初步提 取物进行进一步混合并使用500ml丁醇提取2-4小时。然后，通过分离 和移出丁醇层而将丁醇可溶性物质移出。将剩余的混合物浓缩后，最终 得到13.72g粗提取物。
2.纯化步骤
将13.72g所得到的粗提取物用200ml70％乙醇溶解后，向粗提取物 混合物中加入200ml正己烷并搅拌。将正己烷层分离和移出后，得到70％ 乙醇层。当将所得到的混合物浓缩并冷冻干燥后，最终得到2.98g经纯 化的提取物。使用HPLC和LC-MS测量表美鹅掌楸内酯的量和木香烯内 酯的量。最后，测量并确认了表美鹅掌楸内酯为46.2wt％、木香烯内酯 为12.0wt％。
(制备例3)使用乙酸乙酯溶剂从北美鹅掌楸树皮中制备提取物
1.溶剂提取步骤
在室温下，使用2000ml乙酸乙酯对200g经压碎的北美鹅掌楸(3-5 年树龄)树皮进行搅拌并提取96小时。在减压下将提取的混合物进行浓 缩和过滤后，得到初步提取物。在室温下，将所得到的初步提取物进行 进一步混合并使用500ml丁醇提取2-4小时。然后，通过分离和移出丁 醇层而将丁醇可溶性物质移出。将剩余的混合物浓缩后，最终得到25.71g 粗提取物。
2.纯化步骤
将25.71g所得到的粗提取物用200ml70％乙醇溶解后，向粗提取物 混合物中加入200ml正己烷并搅拌。将正己烷层分离并移出后，得到70％ 乙醇层。当将所得到的混合物浓缩并冷冻干燥后，最终得到3.84g经纯 化的提取物。使用HPLC和LC-MS测量表美鹅掌楸内酯的量和木香烯内 酯的量。最后，测量并确定了表美鹅掌楸内酯为47.0wt％、木香烯内酯 为15.4wt％。
(对比制备例1)使用氯仿溶剂从北美鹅掌楸树皮中制备提取物
1.溶剂提取步骤
在室温下，使用2000ml氯仿对200g经压碎的北美鹅掌楸(3-5年树 龄)树皮进行搅拌并提取24小时。在减压下将提取的混合物进行浓缩和 过滤后，得到初步提取物。在室温下，将所得到的初步提取物进行进一 步混合并使用500ml丁醇提取2-4小时。然后，通过分离和移出丁醇层 而将丁醇可溶性物质移出。将剩余的混合物浓缩后，最终得到10.43g粗 提取物。
2.纯化步骤
将10.43g所得到的粗提取物用200ml70％乙醇溶解后，向粗提取物 混合物中加入200ml正己烷并搅拌。将正己烷层分离并移出后，得到70％ 乙醇层。当将所得到的混合物浓缩并冷冻干燥后，最终得到1.92g经纯 化的提取物。使用HPLC和LC-MS测量表美鹅掌楸内酯的量和木香烯内 酯的量。最后，测量并确认了表美鹅掌楸内酯为22.1wt％、木香烯内酯 为5.2wt％。
(对比制备例2)使用粗乙醇溶剂从北美鹅掌楸树皮中制备提取物
1.溶剂提取步骤
在室温下，使用2000ml粗乙醇对200g经干燥并切碎的北美鹅掌楸 (3-5年树龄)树皮进行搅拌并提取24小时。在减压下将提取的混合物 进行浓缩和过滤后，得到初步提取物。在室温下，将所得到的初步提取 物进行进一步混合并使用500ml丁醇提取2-4小时。然后，通过分离和 移出丁醇层而将丁醇可溶性物质移出。将剩余的混合物浓缩后，得到 19.5g粗提取物。
2.纯化步骤
将19.5g所得到的粗提取物用200ml70％乙醇溶解后，向粗提取物混 合物中加入200ml正己烷并搅拌。将正己烷层分离并移出后，得到70％ 乙醇层。当将所得到的混合物浓缩并冷冻干燥后，得到2.65g经纯化的 提取物。使用HPLC和LC-MS测量表美鹅掌楸内酯的量和木香烯内酯的 量。最后，测量并确认了表美鹅掌楸内酯为15.4wt％、木香烯内酯为 3.7wt％。
(对比制备例3)使用粗乙醇/水(1:1)混合溶剂从北美鹅掌楸树皮中制 备提取物
1.溶剂提取步骤
在室温下，使用2000ml粗乙醇/水(1:1)混合溶剂对200g经压碎的 北美鹅掌楸(3-5年树龄)树皮进行搅拌并提取24小时。在减压下将提 取的混合物进行浓缩和过滤后，得到初步提取物。在室温下，将所得到 的初步提取物进行进一步混合并使用500ml丁醇提取2-4小时。然后， 通过分离和移出丁醇层而将丁醇可溶性物质移出。将剩余的混合物浓缩 后，得到25.17g粗提取物。
2.纯化步骤
将25.17g所得到的粗提取物用200ml70％乙醇溶解后，向粗提取物 混合物中加入200ml正己烷并搅拌。将正己烷层分离并移出后，得到70％ 乙醇层。当将所得到的混合物浓缩并冷冻干燥后，最终得到1.75g经纯 化的提取物。使用HPLC和LC-MS测量表美鹅掌楸内酯的量和木香烯内 酯的量。最后，测量并确认了表美鹅掌楸内酯为8.8wt％、木香烯内酯为 2.7wt％。
表3：提取物中的表美鹅掌楸内酯和木香烯内酯的量(wt％)
表美鹅掌楸内酯 木香烯内酯 制备例1 44.1％ 15.6％ 制备例2 46.2％ 12.0％ 制备例3 47.0％ 15.4％ 对比制备例1 22.1％ 5.2％ 对比制备例2 15.4％ 3.7％ 对比制备例3 8.8％ 2.7％
根据制备例1-制备例3中公开的方法的北美鹅掌楸树皮提取物中的 表美鹅掌楸内酯的量和木香烯内酯的量分别为44wt％-47wt％和 12wt％-16wt％。然而，根据对比制备例1-对比制备例3的表美鹅掌楸内 酯的量和木香烯内酯的量分别为8wt％-23wt％和2wt％-6wt％。
根据提取溶剂之间的差异，确认了乙酸乙酯能够以最高产率提取表 美鹅掌楸内酯和木香烯内酯。