技术领域
本发明涉及疫苗接种的领域，更特别涉及新型免疫佐剂。特别 是，本发明涉及糖基化四官能的非离子两亲性嵌段共聚物作为免疫 佐剂的用途。
背景技术
如Le Moignic在1916年所述，研发的第一个佐剂是基于油包 水乳液。后来，已研发了众多有效的佐剂，但由毒性副作用引起的 不良反应已限制它们用于人类的疫苗。在1937年，Freund已研发 出包含与灭活细菌结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)混 合的矿物油的弗氏佐剂。虽然该佐剂由于严重的副作用禁止用于人 类，但其仍然用于兽禽疫苗(Broderson，Lab Anim Sci，1989，39， 400-5)。以另一种方式，Glenny等最先使用由食品与药物管理局批 准的唯一佐剂铝盐(明矾)(Gupta，R.K.，Adv Drug Deliv Rev，1998， 32，155-172)。明矾诱导与微弱的细胞免疫有关的体液免疫反应， 但不是粘膜免疫，并且可能是变态反应的原因。近年来，研发出角 鲨烯水包油乳液(MF59)，并在欧洲批准用于流感疫苗(Ott，G.，G.L. Barchfeld，和G.Van Nest，Vaccine，1995，13，1557-62；Cataldo， D.M.和G.Van Nest，Vaccine，1997，15，1710-5)。虽然这些佐剂能够 诱导强烈的体液免疫反应，但仅观察到微弱的细胞反应，并且通常 观察到高毒性。
基于它们的作用机理，已研发出不同类型的佐剂，如脂质体基 佐剂或免疫刺激复合物(ISCOM)。然而，它们与溶血活性和局部炎 症反应有关，并且仅用于兽禽疫苗。或者，已提出通常衍生自病原 体如脂多糖、单磷酰A或CpG DNA的免疫刺激成分作为与其它佐 剂如明矾结合的佐剂(特别是用于亚单位疫苗)以引起强烈的体液 反应。然而，它们同样趋于诱导促炎细胞因子产生，这阻碍它们用 于人类(Gustafson，G.L.和M.J.Rhodes，Res Immunol，1992，143， 483-8)。此外，虽然这些佐剂提供强烈的体液免疫反应，但通常观 察到微弱的细胞反应并且缺乏安全性。
设计亚单位疫苗以仅包括刺激免疫系统所必需的抗原。亚单位 疫苗定义明确、纯净且可以以良好的安全性大量生产。然而，与传 统疫苗相比，它们通常具有降低的免疫原性，因此要求使用刺激免 疫系统的佐剂分子。
因此，需要能引起强烈的免疫细胞反应的新型免疫佐剂。
还需要能提高亚单位疫苗效力的新型免疫佐剂。
还需要能引起强烈的免疫细胞反应和体液反应的组合的新型 免疫佐剂。
还需要具有适用于人类的良好安全性的新型免疫佐剂。
还需要能够容易地制备的新型免疫佐剂。
还需要能够以低成本制备的新型免疫佐剂。
本发明的目的是满足那些需求。
发明内容
本发明涉及至少一种糖基化四官能的非离子两亲性嵌段共聚 物作为免疫佐剂的用途。
出乎意料地，如以下实施例中详述的，本发明人已观察到，四 官能的非离子两亲性嵌段共聚物704和904的甘露糖基化不仅能够 显著改进抗体滴度(Th-2反应)，而且能够显著改进针对不同重组抗 原的I类限制的细胞反应(Th-1反应)。704和904具有独特的高效 特性和包括优异安全性的产业特性。
在本发明中，术语″免疫佐剂″旨在表示适合于刺激免疫系统并 增加对本身没有任何特异性抗原效应的疫苗的反应的试剂。本发明 的免疫佐剂能够诱导强烈的免疫细胞反应。
根据一个实施方式，根据本发明的免疫佐剂能够诱导I类限制 的细胞免疫反应(或Th-1反应)。
在本发明中，术语″I类限制的细胞免疫反应″旨在表示主要由 CD8+细胞毒性T细胞介导的免疫反应。细胞毒性T细胞(也称为TC、 细胞毒性T淋巴细胞、CTL、T-杀伤细胞、细胞溶解T细胞、CD8+T细胞或杀伤T细胞)是能够诱导感染的体细胞或肿瘤细胞死亡的T 淋巴细胞的亚群。细胞毒性T细胞表示能够识别结合I级MHC分 子的特异性抗原肽和称为CD8的被吸引至所述I类MHC分子的不 可变部分的糖蛋白的T细胞受体(TCR)。除非另有说明，本发明的 免疫佐剂能够诱导主要组织相容性复合体(MHC)I类限制的免疫或 Th-1反应。
″保护性″I类限制的细胞免疫反应是由CD8+细胞毒性T细胞介 导的免疫反应，其强度或水平能够预防或降低由病原体如病原细 菌、病毒、真菌或由癌细胞触发的疾病发生的可能性，或治疗、缓 减或减少所述疾病的症状。
本发明的免疫佐剂不限于刺激I类限制的细胞免疫反应，而且 还能伴随地诱导强烈的体液反应或主要组织相容性复合体(MHC)II 类限制免疫(或Th-2反应)。Th2反应是以活化B细胞以产生中和抗 体，导致″体液免疫″为特征的免疫反应。
根据一个实施方式，根据本发明的免疫佐剂能够诱导体液免疫 反应。
根据另一实施方式，根据本发明的免疫佐剂能够刺激粘膜免疫 性。
在本发明中，术语″粘膜免疫性″旨在表示对生物体的各种粘膜 提供保护的部分免疫系统。
根据其另一目的，本发明涉及根据本发明的免疫佐剂在亚单位 疫苗组合物中的用途。
根据其另一目的，本发明涉及一种用于赋予针对抗原的保护性 I类限制的细胞免疫反应的免疫佐剂，其包含至少一种糖基化四官 能的非离子两亲性嵌段共聚物。
根据其另一目的，本发明涉及一种疫苗组合物，其包含至少一 种抗原和作为免疫佐剂的至少一种糖基化四官能的非离子两亲性 嵌段共聚物。
根据一个优点，本发明提供一种能够诱导强烈和保护性I类限 制的细胞免疫反应的新型免疫佐剂。
根据另一个优点，本发明提供一种具有适用于人类的良好安全 性的新型免疫佐剂。
根据另一个优点，本发明提供一种制备简单且可以低成本获得 的新型免疫佐剂。
四官能的非离子两亲性嵌段共聚物
在本发明中，特征″嵌段共聚物″旨在表示包含至少两个聚合的 单体单元的组或嵌段的聚合物。″嵌段″是指通过单体聚合获得的基 序，其可在聚合物内重复。嵌段共聚物必须包含至少两个不同种类 的聚合单体的嵌段。
在本发明中，特征″非离子两亲性嵌段共聚物″旨在表示包含至 少一个亲水性嵌段和至少一个疏水性嵌段的嵌段共聚物，所述嵌段 是非离子的，即它们不包含形成离子的部分。
在本发明中，与″嵌段共聚物″有关的特征″四官能的″是指包含 结合由四官能的连接部分具有的四个反应性官能团的四个嵌段共 聚物的化合物。换句话说，″四官能的嵌段共聚物″包含结合中心四 官能的连接部分的四个支链的嵌段共聚物。
所述四个嵌段共聚物可彼此独立地相同或不同，并且优选相 同。
本发明的四官能的非离子两亲性嵌段共聚物包含各自包含至 少一个亲水性嵌段和至少一个疏水性嵌段的四个支链的嵌段共聚 物。
本发明的四官能的非离子两亲性嵌段共聚物不是单磷酰脂质 A，或如Jiang等，Carbohydrate Res，2007，342：784中描述的其 类似物。
本发明的四官能的非离子两亲性嵌段共聚物不是如US 5,977,081中所描述的三萜-皂苷亲油性共轭物。
在可用于本发明的四官能的非离子两亲性嵌段共聚物中，所述 亲水性嵌段可选自由聚氧化烯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚(2- 甲基-2-噁唑啉)或糖组成的组，和所述疏水性嵌段可选自由聚氧化 烯、脂肪链、亚烷基聚酯、具有苄基聚醚端部的聚乙二醇和胆固醇 组成的组。
特别是，所述亲水性嵌段可选自由聚氧化烯、聚乙烯醇、聚乙 烯吡咯烷酮、聚(2-甲基-2-噁唑啉)组成的组，和所述疏水性嵌段可 选自由聚氧化烯、脂肪链、亚烷基聚酯、具有苄基聚醚端部的聚乙 二醇和胆固醇组成的组。
更特别的是，所述亲水性嵌段可选自由聚氧化乙烯、聚乙烯醇、 聚乙烯吡咯烷酮、聚(2-甲基-2-噁唑啉)组成的组，和所述疏水性嵌 段可选自由聚氧化丙烯、脂肪链、亚烷基聚酯、具有苄基聚醚端部 的聚乙二醇和胆固醇组成的组。
根据一个实施方式，本发明的嵌段共聚物的亲水性嵌段包含聚 氧化乙烯单元，优选由聚氧化乙烯单元组成。
根据一个实施方式，本发明的嵌段共聚物的疏水性嵌段包含聚 氧化丙烯单元，优选由聚氧化丙烯单元组成。
根据一个优选实施方式，本发明的嵌段共聚物包含亲水性嵌段 和疏水性嵌段，所述亲水性嵌段包含聚氧化乙烯单元，优选由聚氧 化乙烯单元组成，和所述疏水性嵌段包含聚氧化丙烯单元，优选由 聚氧化丙烯单元组成。
在一个优选实施方式中，本发明的四官能的非离子两亲性嵌段 共聚物包含至少一个末端亲水性嵌段。″末端亲水性嵌段″是位于共 聚物的一端的嵌段，特别是位于本发明的四官能的聚合物的一个支 链的远端的嵌段。四官能的非离子两亲性嵌段共聚物优选包含至少 两个、优选三个、更优选四个末端亲水性嵌段。
根据一个优选实施方式，本发明的嵌段共聚物包含至少一个、 优选两个、甚至优选三个、更优选四个各自位于所述聚合物的各支 链的一端的末端氧化乙烯单元。
本发明的四官能的非离子两亲性嵌段共聚物优选包含亲水性 嵌段/疏水性嵌段比例为0.7至1.5、优选0.8至1.3、更优选0.8至 1.2的亲水性嵌段和疏水性嵌段。
可用于本发明的四官能的非离子两亲性四官能的嵌段共聚物 可以是(A-B)n-C支链嵌段共聚物，其中A表示亲水性嵌段，B表示 疏水性嵌段，C表示连接部分，和n为4和表示连接至C的(A-B) 基团的数量。
优选地，所述亲水性嵌段A为聚氧化乙烯嵌段，所述疏水性 嵌段B为聚氧化丙烯嵌段。
所述连接部分C可以是亚烷基二胺部分，优选为亚乙基二胺 部分。
可用于本发明的四官能的非离子两亲性嵌段共聚物可以是式 (I)：
(II)
其中RA、RB、RC、RD彼此独立地表示
其中
-i的值为约5至约125，特别是约10至约100，更特别是约10 至约60，和
-j的值为5至约85，特别是约10至约50，特别是约10至约 20，更特别是等于或大于13，
-R*为具有2-6个碳的亚烷基，具有5-8个碳的环亚烷基或亚 苯基，并且优选为亚乙基，
-对于R1和R2，或者(a)两个均为氢，或(b)一个为氢，另一个 为甲基，
-对于R3和R4，或者(a)两个均为氢，或者(b)一个为氢，另一 个为甲基，和
-如果R3和R4均为氢，则R5和R6中一个为氢，另一个为甲基， 或如果R3和R4之一为甲基，则R5和R6均为氢。
更优选地，可用于本发明的非离子两亲性四官能的嵌段共聚物 可以是式(II)：
其中
-i的值为约5至约125，特别是约10至约100，更特别是约10 至约60，和
-j的值为约5至约85，特别是约10至约50，特别是约10至 约20，更特别是等于或大于13，
-和其中对于各R1、R2对，一个应为氢，另一个应为甲基。
优选地，i可以为约5至约125，特别是约10至约100，更特 别是约10至约60，和j可以是约5至约50，特别是约10至约25， 特别是约10至约20，更特别是等于或大于13。
本发明的嵌段共聚物的分子量可以是4000至35000，特别是 4500至30000，更特别是5000至25000。
本发明的嵌段共聚物可包含，优选由约40％、特别是约45％、 特别是约45％至约80％、特别是约45-70％，更特别是约45-60％， 更优选约50％的氧化乙烯单元含量组成。
许多本发明的四官能的非离子两亲性嵌段共聚物，特别是非离 子两亲性四官能的嵌段共聚物，可以通用商品名″poloxamines″商 购。
特别是，本发明的非离子两亲性四官能的嵌段共聚物可从 BASF(Wyandotte，Mich.)以商品名Tetronic(TM)获得。
适合用于本发明的泊洛沙胺(poloxamines)的更多细节可见于 Surfactant Systems，Eds.Attwood和Florence，Chapman and Hall， London 1983，p 356-361；The Condensed Encyclopaedia of Surfactants， Ed.Ash和Ash，Edward Arnold，London，1989；Non-ionic Surfactants， pp.300-371，Ed.Nace，Dekker，New York，1996；Santon，Am. Perfumer Cosmet.72(4)：54-58(1958)；(Dekker，N.Y.，1967)；或US 6,353,055。
根据一个实施方式，适合于本发明的非离子两亲性嵌段共聚物 可选自由四官能的非离子两亲性嵌段共聚物304、四官能的非离子 两亲性嵌段共聚物704、四官能的非离子两亲性嵌段共聚物904、 四官能的非离子两亲性嵌段共聚物908和四官能的非离子两亲性 嵌段共聚物1107以及它们的混合物组成的组。
本发明的非离子嵌段共聚物可优选选自由304、704、904、1107 和它们的混合物组成的组，更优选选自由304、704、904和它们的 混合物组成的组，更优选选自由704、904和它们的混合物组成的 组。
本发明的嵌段共聚物的至少一个嵌段，优选亲水性嵌段，与糖 基部分共轭。
本发明的糖基化四官能的非离子两亲性嵌段共聚物包含至少 一个与至少一个糖基部分共轭的末端嵌段，优选一个末端亲水性嵌 段。
更优选本发明的嵌段共聚物的至少25％、特别是至少50％、特 别是至少75％、更特别是至少100％的末端嵌段与糖基部分共轭。
将根据各种参数如抗原的数量和性质、待接种的个体的种族、 性别、重量、年龄、饮食、状态、附加处理，调整可用作本发明的 免疫佐剂的糖基化四官能的非离子两亲性嵌段共聚物的量。要考虑 的参数是技术人员众所周知的，根据这些参数调整免疫佐剂的适合 的量属于他的常规工作。
糖基化四官能的非离子两亲性嵌段共聚物的用量可以为包含 其的组合物的总重量的0.01-10重量％，特别是包含其的组合物的 总重量的0.02-5％，更特别是0.05-2％，更优选0.1-1％，更优选 0.1-0.5％，更优选约0.25％。
糖基部分和接枝方法
可用于本发明的糖基部分可包含至少一个糖基单元。糖基部分 可以是单糖基单元或可以是糖基单元的直链或支链聚合物。糖基部 分可包含1至5个糖基单元，其包括1、2、3、4和5个糖基单元。 糖基部分可优选包含一个或两个糖基单元，并且可优选包含一个糖 基单元。
可用于本发明的糖基部分可选自甘露糖或半乳糖部分，并且优 选为甘露糖部分。甘露糖部分可包含1至5个甘露糖单元，其包括 1、2、3、4和5个甘露糖单元，并且优选可包含一个或两个甘露 糖单元，和优选可包含一个甘露糖单元。
糖基部分可通过在所述糖基部分的一个官能团与所述嵌段共 聚物的一个官能团之间形成的共价键来共轭至本发明的嵌段共聚 物。所述共价键可由本身或改性至反应性的两个官能团之间的反应 来形成。糖基部分可直接共轭至嵌段共聚物。或者，糖基部分可通 过间隔基共轭至嵌段共聚物。
根据一个实施方式，糖基部分可通过醚官能团共轭至嵌段共聚 物。
根据另一实施方式，糖基部分可通过共价连接所述糖基部分的 一个官能团和所述嵌段共聚物的一个官能团的间隔基来共轭至本 发明的嵌段共聚物。
间隔基为任选包含优选选自N或O的杂原子且将至少两个分 子如糖基部分和嵌段共聚物连接到一起的基于烃的基团。
可用于本发明的间隔基可连接一个嵌段共聚物与至少一个或 两个、三个、四个或五个、优选三个糖基部分。
当多个糖基部分与间隔基结合时，所述糖基部分可以彼此相同 或不同，并且优选它们可以是相同的。
间隔基可通过氨基官能团共价连接至嵌段共聚物。
间隔基可通过醚官能团共价连接至糖基部分。
间隔基可以是直链或支链的。
连接一个嵌段共聚物与单个糖基单元的间隔基是直链间隔基。
直链间隔基可通过氨基官能团共价连接至嵌段共聚物，并可通 过醚官能团共价连接至糖基部分。
直链间隔基可以是(羟甲基)-4-三唑。
连接一个嵌段共聚物与至少两个、三个、四个或五个糖基部分 的间隔基是支链间隔基。
所述支链可以由单个原子携带，或可以沿所述间隔基的主链分 布。当然，单个原子上的支链数将取决于该原子的化合价。例如， 所述间隔基的主链中的氮原子将能够具有一个支链，而碳原子将能 够具有一个或两个支链。或者，位于间隔基的主链的一端的氮原子 将能够具有一个或两个支链，而位于间隔基的主链的一端的碳原子 将能够具有一个、两个或三个支链。
支链间隔基可优选包含至少一个具有至少两个、优选三个支链 的位于主链的一端的碳原子。
可用于本发明的间隔基可共价连接所述嵌段共聚物的一个官 能团，并且可包含至少一个、优选两个、三个、四个或五个、更优 选三个各自共价连接至糖基部分的一个官能团的支链。
支链间隔基可通过氨基官能团共价连接至嵌段共聚物，并可通 过醚官能团共价连接至糖基部分。
糖基部分可根据现有技术中任何已知技术共轭至本发明的非 离子两亲性嵌段共聚物，将根据所述糖基部分和共聚物嵌段的属性 和化学性质来选用所述已知技术。
糖基部分可通过化学反应共轭至亲水性嵌段，特别是末端亲水 性嵌段。
可通过直接偶合或点击化学，特别是如以下实施例中详述的， 进行适合于本发明的化学反应。
作为适合于直接偶合或点击化学的嵌段共聚物的实例，可提及 具有至少一个羟基，特别是来自一个末端氧化乙烯单元的羟基的嵌 段共聚物。
作为至少一个糖基部分通过直接偶合共轭至具有至少一个羟 基的嵌段共聚物的实例，可提及通过四-O-乙酰基-糖苷部分与所述 聚合物在三氟化硼乙醚络合物存在下反应，并通过甲酸钠进行所述 糖的脱保护，所述羟基与糖基部分例如甘露糖之间通过O连接直 接偶合。
所述四-O-乙酰基糖苷可根据现有技术中已知的任何方法来获 得。例如，可使乙酸肼与五-O-乙酰基糖苷在无水溶剂如THF中反 应。此后，在碳酸钾和三氯乙腈存在下，并在无水溶剂如二氯甲烷 存在下，可将所述四-O-乙酰基糖苷转化成反应性四-O-乙酰基-1-O- 三氯乙酰亚胺基(trichloroacetimidoyl)-糖苷。然后，例如在三氟化硼 乙醚络合物存在下，在无水溶剂如二氯甲烷中，可将该化合物与具 有至少一个羟基的嵌段共聚物反应，以产生2，3，4，6-四-O-乙酰基 -1-O-嵌段共聚物-糖苷。可将所述产物添加到甲酸钠溶液中，以产 生嵌段共聚物-糖苷。
在一个优选实施方式中，糖基部分与本发明的嵌段共聚物的共 轭可通过点击化学来进行。
点击化学反应是两个导致在碳原子与杂原子之间形成至少一 个共价键的官能部分之间的反应。
可用于本发明的点击化学反应例如是由Sharpless等(Angew Chem Int，2001，40，2004-2021)定义的。
根据一个优选实施方式，可用于本发明的官能部分对可以是腈 或炔/叠氮化物(azoture)对。
点击化学反应可在催化剂存在下进行。作为有用的催化剂，可 提及过渡金属如Cu。
作为优选的可用于根据本发明的点击化学的化学反应的实例， 可提及铜(Cu)存在下的叠氮化物官能化化合物与炔官能化化合物 之间的化学反应。
例如，本发明的嵌段共聚物可用叠氮化物部分官能化，特别是 在例如来自氧化乙烯单元的末端羟基上，而共轭至该改性嵌段共聚 物的糖基部分可用炔部分官能化。
作为至少一个糖基部分通过点击化学共轭至具有至少一个羟 基的嵌段共聚物的实例，可提及叠氮基封端的聚合物与经改性含有 炔基的甘露糖部分之间的铜催化的Huisgen 1，3-偶极环加成。
O-炔基碳水化合物如炔丙基-β-D-糖苷可通过β-D-糖五乙酸酯 如β-D-甘露糖五乙酸酯与炔基醇如炔丙醇，在干燥二氯甲烷中在三 氟化硼乙醚络合物存在下反应，然后通过甲醇钠介导除去乙酰基保 护基来制备。
具有至少一个羟基例如末端氧化乙烯单元的嵌段共聚物可通 过根据来源于Mereyala等，Carbohydrate Research，1998，307，351； Muthana等.，J Am Chem Soc，2007，129，11918；Bonger等，Bioorg Med Chem，2007，15，4841；等，Pharm Res，2005，22， 1411-1421；Li等，Biomacromol，2003，4，1055；Iyer等，Tetrahedron Lett，2004，45，4285的方法引入至少一个叠氮基而改性。可首先使 用过量的对甲苯磺酰氯和氢氧化钾在无水二氯甲烷中将所述末端 羟基转化成双甲苯磺酸化衍生物嵌段共聚物-OTs。然后，可在无水 乙醇中从所述具有叠氮根离子的衍生物嵌段共聚物-OTs除去所述 磺酸酯，从而得到双叠氮基嵌段共聚物。
可在叔丁醇/H2O中，使用硫酸铜/抗坏血酸钠进行叠氮化物嵌 段共聚物和炔丙基糖苷的1，3-偶极环加成，从而得到嵌段共聚物- 三唑-甘露糖。
抗原
根据一个实施方式，与本发明的免疫佐剂结合的抗原可以是来 自细菌、病毒、真菌或癌细胞的抗原。
术语″抗原″表示刺激动物中保护性免疫反应的肽或核苷酸型 生物材料(天然的、重组的或合成的)。适合于本发明的抗原可以是 氨基酸序列如肽或蛋白质，或核酸序列如基因组DNA、cDNA、 mRNA、tRNA、rRNA、小干扰RNA(iRNA)杂交序列，或改性或未 改性的合成的或半合成的寡核苷酸序列。
适合于本发明的抗原可从选自由细菌、病毒、寄生虫、立克次 氏体、原生动物和癌细胞组成的组的生物体中获得。
细菌的实例可选自由博代杆菌属(Bordetella spp.)、链球菌 属(Streptococcus spp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、梭 菌属(Clostridium spp.)、钩端螺旋体属(Leptospira spp.)、埃希 氏菌属(Escherichia spp.)、沙门氏菌属(Salmonella spp.)、巴斯 德氏菌属(Pasteurella spp.)、分枝杆菌属(Mycobacteria spp.)、 支原体属(Mycoplasma spp.)、莫拉氏菌属(Moraxella spp.)、嗜 血杆菌属(Haemophilus spp.)、包柔氏螺旋体属(Borrelia spp.)、 梭杆菌属(Fusobacteria spp.)、变形细菌属(Bacteriodes spp.)和 红球菌属(Rhodococcus spp.)组成的组。
病毒的实例可选自由疱疹病毒、副流感病毒、呼肠孤病毒、轮 状病毒、麻疹病毒、逆转录病毒、冠状病毒、腺病毒、披膜病毒、 细小病毒、副痘病毒、副粘病毒、巨细胞病毒、虫媒病毒和汉坦病 毒组成的组。
寄生虫和原生动物的实例可选自由新孢子虫属(Neospora spp.)、弓形体属(Toxoplasma spp.)、恶丝虫属(Dirofilaria spp.)、 隐孢子虫属(Cryptosporidium spp.)、贾第虫属(Giardia spp.)、 巴倍虫属(Babesia spp.)和球虫属(Coccidia spp.)组成的组。
立克次氏体的实例可选自由披衣菌属(Chlamydia spp.)、波 托玛克马热、埃利希氏体犬属(Ehrlichia canis)和其它埃利希氏 体属(Ehrlichia spp.)组成的组。
从癌细胞中获得的抗原的实例可选自由甲胎蛋白、Mela1、 NY-ESO-1、抗原BAGE、抗原MAGE、抗原GAGE、MART1、MUC1 和CA-125组成的组。
所述抗原可从生物体的全培养物如全培养收获物、部分纯化的 全培养收获物、从收获物中提取的纯化亚单位、通过重组技术获得 且在同源或异源的生物体中表达的亚单位、全生物体的缺失突变体 (常规或rDNA基因缺失突变体)、肽、裸DNA、化学合成的抗原、 反转转录的裸cDNA或它们的组合中获得。
通常，抗原可通过培养和收获生物体、浓缩和/或常规纯化这 种生物体的抗原的本领域已知技术来制备。例如，抗原可通过在具 有生长培养基的培养物中使所选择的生物体生长来制备。更具体 地，所述生物体可在由哺乳动物或植物细胞制备的组织培养物中生 长。所述生物体还可以在发酵培养基中生长，其中所述生物体在没 有组织培养物下生长，但已向其中添加生长培养基。
本发明的疫苗可用于治疗或预防大量疾病和紊乱，例如：
-涉及下述病毒的疾病和紊乱：逆转录病毒科(例如人类免疫缺 陷性病毒，包括HIV-1)；小核粮核酸病毒科(例如脊髓灰质炎病毒、 甲肝病毒；肠道病毒、人类柯萨奇病毒、鼻病毒、艾柯病毒)；杯 状病毒科(例如引起肠胃炎的菌株)；披膜病毒科(例如马脑炎病毒、 风疹病毒)；黄病毒科(例如登革热病毒、脑炎病毒、黄热病毒)；冠 状病毒科(例如冠状病毒)；弹状病毒科(例如水疱性口腔炎病毒、狂 犬病病毒)；纤丝病毒科(例如埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如副流 感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞体病毒)；正粘病毒 科(例如流感病毒)；布尼亚病毒科(例如汉坦病毒、布尼病毒(bunga viruses)、白蛉病毒和内罗病毒)；沙粒病毒科(出血热病毒)；呼肠 孤病毒科(例如呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒)；双核糖核酸病 毒科；肝脱氧核糖核酸病毒科(乙肝病毒)；细小病毒科(细小病毒)； 乳多空病毒科(乳头状瘤病毒、多形瘤病毒)；腺病毒科(大多数腺病 毒)；疱疹病毒科(单纯性疱疹病毒(HSV)1和2、水痘带状疱疹病毒、 细胞肥大病毒(CMV)、疱渗病毒；痘病毒科(Poxyiridae)(天花病毒、 痘苗病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(例如非洲猪瘟病毒)；和未分类 的病毒(例如海绵状脑病的病原体，丁型病毒性肝炎的试剂(被认为 是乙肝病毒的缺陷卫星)、HCV病毒(引起非甲、非乙型肝炎)； Norwalk及相关病毒和星状病毒)。前述之中，特别优选HIV、甲肝、 乙肝、丙肝、狂犬病病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、脑膜炎病 毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹、百日咳、脑炎病毒、乳头状瘤 病毒、黄热病毒、呼吸道合胞体病毒、细小病毒、切昆贡亚热病毒、 出血热病毒和疱疹病毒(特别是水痘)、细胞肥大病毒和埃-巴二 氏病毒。在上述实施方式中，选择用于疫苗的抗原源自于存在于天 然存在的病毒中(或在感染期间表达/诱导)的那些抗原(或参考那些 抗原而设计)。
-涉及下述革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的疾病和紊乱：幽门 螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、伯氏疏螺旋体(Borelia burgdorferi)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、分枝杆菌 属(例如肺结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、麻风分枝杆菌(M. leprae)、鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellular)、 M.kansaii和戈登分枝杆菌)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏 球菌(Neisseria meningitidis)、单核细胞增多性李氏菌(Listeria monocytogenes)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链 球菌属)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B组链球菌属)、 草绿色链球菌(Streptococcus viridans)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、链球菌属的任何厌 氧种类、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、弯曲杆菌属 (Campylobacter spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)、流感嗜 血杆菌(Haemophilus influenzae)、炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)、棒杆菌属(Corynebacterium spp)(包括白喉杆菌(C. diphtheriae))、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、产 气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、克雷伯氏杆菌属 (Klebsiella spp)(包括克雷伯氏肺炎菌(K.pneumoniae))、多杀 性巴氏杆菌(Pasturella multocida)、拟杆菌属(Bacteroides spp.)、 具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠状链杆菌 (streptobacillus monilijormis)、苍白密螺旋体(Treponema pallidium)、细弱密螺旋体(Treponema pertenue)、钩端螺旋体 属(Leptospira spp.)、立克次氏体属(Rickettsia spp.)和放线菌 属(Actinomyces spp.)(包括衣氏放线菌(A.israelii))。在上述实 施方式中，选择用于疫苗的抗原源自于存在于天然存在的细菌中 (或在感染期间表达/诱导)的那些抗原(或参考那些抗原而设计)。
-涉及下述真菌的疾病和紊乱：新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、粗球 孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)和白色念珠 菌(Candida albicans)，在上述实施方式中，选择用于疫苗的抗 原源自于存在于天然存在的真菌中(或在感染期间表达/诱导)的那 些抗原(或参考那些抗原而设计)。
-涉及下述原生动物的疾病和紊乱：疟原虫属(Plasmodium spp.)(包括恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、三日疟原虫 (Plasmodium malariae)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)和间 日疟原虫(Plasmodium vivax))、弓形体属(Toxoplasma spp.)(包 括刚地弓形虫(T.gondii)和T.cruzii)和利什曼虫属(Leishmania spp.)。
-涉及下述癌细胞的疾病和紊乱：血液和淋巴系统癌症(包括霍 奇金病、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和病)、黑 素瘤(包括眼睛的黑素瘤)、腺瘤、肉瘤、实体组织的癌、黑素瘤、 肺癌、甲状腺癌、唾液腺癌、腿癌、舌癌、唇癌、胆管癌、骨盆癌、 纵隔腔癌、尿道癌、卡波西肉瘤(例如与AIDS有关时)；皮肤癌(包 括恶性黑素瘤)、消化道癌症(包括头和颈癌、食道癌、胃癌、胰腺 癌、肝癌、结肠和直肠癌、肛门癌)、生殖和泌尿系统的癌症(包括 肾癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌)、女性癌症(包括乳房癌、子宫 颈癌、卵巢癌、妇科癌症和绒毛膜癌)以及脑癌、骨类癌瘤、鼻咽 癌、腹膜后肿瘤、甲状腺癌、软组织瘤和未知的主要部位癌症。在 上述实施方式中，选择用于疫苗的抗原为存在于恶性细胞和/或组 织中的同源性新抗原或肿瘤相关的抗原。
-涉及多细胞寄生虫如蠕虫(例如血吸虫属(Schistosoma spp)) 的疾病和紊乱。
在一个优选实施方式中，可用于本发明的抗原是肽或蛋白质抗 原。
抗原以致免疫的有效量自然地与本发明的免疫佐剂组合。″致 免疫的有效量″表示当向个体施用包含本发明的免疫佐剂和包含抗 原的疫苗时，抗原包含足以保护动物免于目标疾病的浓度的保护性 成分。作为抗原的致免疫的有效量的实例，可提及0.01-100μg的量。
疫苗组合物
适合于本发明的疫苗组合物可以是活疫苗、死疫苗或灭活疫苗 和亚单位疫苗。
通常减毒活疫苗以使它们能够发动对它们的抗原的长免疫反 应，而不会引起通常与它们有关的疾病。
死疫苗通过不使存在于宿主免疫系统中的抗原因子灭活的化 学或其它手段灭活。
对于一些疾病载体，即使杀死生物体也不能阻止它在接受者中 引起不希望的作用。在这种情况下，所述试剂必须分成本身不是病 原体的亚单位或亚级分。
本发明的疫苗优选为亚单位疫苗。
本发明的疫苗可通过针对使用的特定疫苗所规定的任何方式， 优选胃肠外，即皮下、静脉内、肌内或腹腔内施用。
本发明的疫苗可用于兽禽或人类治疗。
本发明的疫苗可通过将本发明的免疫佐剂溶解或悬浮于抗原 稀释剂中，然后以适合的抗原稀释度组合适合量的所述免疫佐剂溶 液和所述抗原溶液来制备。抗原稀释剂是现有技术中常规的那些， 如磷酸盐缓冲盐水、最小必需培养基、蛋白胨等。
可使用现有技术中任何适合的赋形剂，包括例如惰生稀释剂、 崩解剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。适 合的惰性稀释剂包括碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和磷酸钙、和乳糖， 而玉米淀粉和褐藻酸是适合的崩解剂。粘合剂可包括淀粉和凝胶， 而润滑剂，如果存在，将通常是硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
除本发明的免疫佐剂外，根据本发明的疫苗可包含不同的免疫 佐剂。可使用现有技术已知的且不同于本发明的免疫佐剂的任何免 疫佐剂。作为其它不同的免疫佐剂的实例，可提及完全和不完全弗 氏佐剂、铝盐、角鲨烯或Toll样受体激动剂如聚(I：C)、脂多糖或 CpG寡脱氧核苷酸。
本发明的疫苗可采取任何适合的形式，包括例如片剂、酏剂、 胶囊、溶液、悬浮液、粉末、颗粒和气雾剂。
对于肌肉、腹膜内、皮下和静脉内使用，本发明的化合物将通 常以缓冲至适当pH和等渗性的无菌水溶液或悬浮液提供。
适合的含水载体包括林格氏溶液和等渗氯化钠。根据本发明的 水悬浮液可包括悬浮剂如纤维素衍生物、褐藻酸钠、聚乙烯基吡咯 烷酮和黄蓍胶以及润湿剂如卵磷脂。适合于水悬浮液的防腐剂包括 对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸正丙酯。
本发明的疫苗中的糖基化四官能的非离子两亲性嵌段共聚物 的含量可根据所述疫苗的性质、采用的特定剂量单位、治疗的患者 的疗程、年龄、重量、辅助治疗(如果有的话)的种类和性别、治疗 的紊乱的性质和程度以及施用的抗原的性质而广泛地变化。
将借助于下述实施例和附图更充分地描述本发明，但下述实施 例和附图应理解为说明性的和非限制性的。
附图说明
图1示出用于通过点击化学(a)和直接偶合(b)获得糖基化704 的化学合成路径。
图2示出了将甘露糖耦合至四官能聚合物的方式对亚单位疫 苗接种后的免疫反应的影响。在0天和21天时，用使用0.25％分 别由点击化学(白色柱，704-M和904-M)和直接偶合(灰色柱， 704-O-M和904-O-M)合成的704-M、904-M和704-O-M、904-O-M 配制的β-半乳糖苷酶皮下注射小鼠组。图2(a)和2(c)示出用25μg 用704-M、704-O-M、904-M和904-O-M配制的β-半乳糖苷酶注射 的小鼠在21天(垂直阴影线柱)和42天(水平阴影线柱)时的体液反 应。图2(b)和2(d)示出用使用704-M、704-O-M、904-M和904-O-M 配制的β-半乳糖苷酶注射的小鼠在42天时的I类限制的细胞反应。 对于体液反应和细胞反应，对于n＝6的注射小鼠，示出各组+/-标 准偏差的平均滴度。
图3示出了704-M目标载体对亚单位疫苗接种后免疫反应的 影响。用使用704和704-M配制的β-半乳糖苷酶在0天和21天时 皮下注射小鼠组。图3(a)示出用25μg在复合培养基中用0.05-2％的 不同浓度的704-M配制的β-半乳糖苷酶注射的小鼠在42天时的体 液反应。图3(b)示出用使用704(白色柱)或704-M(灰色柱)配制的β- 半乳糖苷酶注射的小鼠在21天(垂直阴影线柱)和42天(水平阴影线 柱)时的体液反应。图3(c)示出用使用704(白色柱)或704-M(灰色柱) 配制的β-半乳糖苷酶注射的小鼠在42天时的I类限制的细胞反应。 图3(d)示出用不同量的使用恒定0.25％704-M配制的β-半乳糖苷酶 注射的小鼠的体液反应。图3(e)示出用25μg使用0.25％704(白色 柱)或704-M(灰色柱)配制的β-半乳糖苷酶注射的Balb/c小鼠在21 天(垂直阴影线柱)和42天(水平阴影线柱)时的体液反应。对于体液 反应和细胞反应，对于n＝6的注射小鼠，示出各组+/-标准偏差的 平均滴度。
图4示出了制剂培养基对具有704载体的亚单位疫苗接种的影 响。用25μg使用0.25％的生理盐水或复合培养基中的704(白色柱) 或704-M(灰色柱)配制的β-半乳糖苷酶皮下注射小鼠组。在第一次 注射后42天时(水平阴影线柱)和21天加强时(垂直阴影线柱)测定 体液反应。对于体液反应，对于n＝6的注射小鼠，示出各组+/-标 准偏差的平均滴度。
图5示出了具有β-半乳糖苷酶的704-M疫苗接种在狗研究中 的效力。用150μg使用704-M配制的β-半乳糖苷酶s.c.注射狗。在 单次注射后的不同时间点测定β-半乳糖苷酶特定抗体。
实施例
材料和方法
配制物。由In-Cell-Art(Nantes，法国)友好提供704、904、704-M 和904-M。β-半乳糖苷酶由Roche(Rosny-Sous-Bois，法国)提供。即 将在皮下(s.c.)注射之前，配制β-半乳糖苷酶或卵清蛋白。根据厂商 的方案(Sigma，St Quentin Fallavier，法国)进行与不完全和完全弗 氏佐剂的配制。
通过点击化学的704和904的甘露糖基化(704-M和904-M)
2-丙炔基2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃甘露糖苷
在氮气气氛下，在0℃下，将三氟化硼乙醚络合物(7.90mL， 64mmol，5当量)滴加至α-D-吡喃甘露糖五乙酸酯(5g，12.8mmol) 和炔丙醇(2.98mL，51.2mmol，4当量)的无水二氯甲烷(150mL)溶液 中，并在0℃下搅拌所述溶液4天。添加无水碳酸钾(8g)，并再搅 拌所述反应混合物1小时，过滤。用二氯甲烷(200mL)稀释所述滤 液，用水(3×200mL)洗涤，通过Na2SO4干燥，过滤并浓缩，从而提 供作为棕色油状物的2-丙炔基2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃甘露 糖苷(4.95g，定量的产量)，其不经进一步纯化而使用。1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ＝5.38-5.20(m，3H，H2，3，4)，5.02(d，J＝1.6Hz，1H， H1)，4.27(dd，J＝5.2，12.2Hz，1H，H6)，4.26(d，J＝2.4Hz，2H， OCH2C≡CH)，4.10(dd，J＝2.5，12.2Hz，1H，H6)，4.45-3.72(m，1H， H5)，2.46(t，J＝2.4Hz，1H，C≡CH)，2.15，2.09，2.03，1.98(4s，4×3H， OCOCH3)；13C NMR(100.6MHz，CDCl3)：δ＝170.7，170.0，169.9和 169.8(OCOCH3)，96.4(C1)，78.0(C≡C-H)，75.7(C≡C-H)，69.5(C5)， 69.1(C4)，69.0(C3)，66.2(C2)，62.5(C6)，55.1(OCH2C≡CH)，20.9， 20.8×2和20.7(OCOCH3)；MS(ESI)：m/z＝409.0[M+Na]+。
炔丙基-α-D-吡喃甘露糖苷
在室温下将2-丙炔基2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃甘露糖苷 (990mg，2.56mmol)溶于甲醇钠(69mg，1.28mmol，0.5当量)的无水 甲醇(15mL)溶液中。搅拌所述混合物24小时，用DOWEX(H+)树脂 中和，过滤并浓缩，从而提供作为油状物的炔丙基-α-D-吡喃甘露 糖苷(559mg，定量的产量)，其不经进一步纯化而使用。1H NMR(400 MHz，D2O)：δ＝5.02(d，J＝1.6Hz，1H，H1)，4.38-4.22(m，2H，OCH2C≡CH)，3.98-3.56(m，6H，H2，3，4，5，6)，2.90(t，J＝2.4Hz，1H，C≡CH)； 13C NMR(100.6MHz，D2O)：δ＝99.1(C1)，79.1(C≡CH)，76.5 (C≡CH)，73.4(C2)，70.8(C5)，70.2(C3)，66.9(C4)，61.1(C6)，54.9 (OCH2C≡CH)；MS(ESI)：m/z＝240.8[M+Na]+，218.9[M+H]+。
四甲苯磺酸化(tetratosylated)704嵌段共聚物：704-OTs
在氮气气氛下，在分子筛存在下，将对甲苯磺酰氯(416mg， 2.18mmol，12当量)添加到704(1g，182μmol)的无水二氯甲烷(16mL) 溶液中。用冰浴将所述混合物冷却至0℃，并在低于5℃的温度下， 小心地添加小部分粉末氢氧化钾(163mg，2.90mmol，16当量)。在 室温下剧烈搅拌所述混合物6天，并用二氯甲烷(150mL)稀释。用 水(3×100mL)洗涤所述有机层，通过Na2SO4干燥，过滤并浓缩，从 而提供作为油状物的704-OTs(948mg，91％的甲苯磺酸化官能团)， 其不经进一步纯化而使用。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝7.79(d，J ＝8.3Hz，Har)，7.33(d，J＝8.3Hz，Har)，4.15(t，J＝4.9Hz，CH2OTs)， 3.70-3.30(m，[CH2CH2O]n，[CH2CH(CH3)O]n，CH2N)，2.44(s，CH3)， 1.17-1.08(m，[CH2CH(CH3)O]n)。
四叠氮基704嵌段共聚物：704-N3
将叠氮化钠(280mg，4.31mmol，25当量)添加至704-Ots (948mg，172μmol)的无水乙醇(8mL)溶液中，并在80℃下剧烈搅拌 所述混合物6天。然后浓缩所述溶液，将残留物溶于水(15mL)中， 并在4℃下通过对MilliQ去离子水(6×1.5L)透析(MCWO＝2000)来纯 化，然后冷冻干燥，以提供作为黄色油状物的704-N3(583mg，定 量转化，91％的叠氮基官能团)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝ 3.70-3.30(m，CH2N3，[CH2CH2O]n，[CH2CH(CH3)O]n，CH2N)， 1.17-1.07(m，[CH2CH(CH3)O]n)；13C NMR(100.6MHz，CDCl3)：δ＝ 75.6，75.5，75.3，73.5，73.1，73.0，71.0，70.9，70.8，70.7和70.2 ([CH2CH2O]n，[CH2CH(CH3)O]n，CH2N，CH2CH2N3)，50.8(CH2N3)， 17.6和17.5([CH2CH(CH3)O]n)。分析计算值704-N3：C，57.70；H， 9.68；N，3.44。实测值：C，57.25；H，9.75；N，2.85。
甘露糖基化704：704-三唑-Man(704-M)
在室温下将新鲜制备的硫酸铜(II)五水合物(90.7mg，364μmol， 2当量)和抗坏血酸钠(288mg，1.45mmol，8当量)的水(6mL)溶液 添加至炔丙基-α-D-吡喃甘露糖苷(476mg，218mmol，12当量)的水 (6mL)溶液中。将所得到的混合物添加至704-N3(1g，182μmol)的叔 丁醇(12mL)溶液中。在55℃下搅拌48小时后，添加在水(15mL) 中的乙二胺四乙酸二钠盐二水合物(EDTA，677mg，1.82mmol，l0 当量)，并在室温下继续搅拌30min。在4℃下，通过对MilliQ去离 子水(6×1.5L)透析(H1透析膜1,000MCWO)来纯化粗制 的反应混合物，然后冷冻干燥，以提供作为棕色油状物的704-三唑 -Man(221mg，高达85％的甘露糖引入)。1H NMR(400MHz，D2O)： δ＝8.11(s，4H，H三唑)，4.95(s，4H，H1甘露糖)，4.83(d，J＝12.4Hz， 4H，OCH2-三唑)，4.70(d，J＝12.4Hz，4H，OCH2-三唑)，4.63(t，J＝ 4.8Hz，8H，OCH2CH2N)，3.97(t，J＝4.8Hz，8H，OCH2CH2N)， 3.92-3.25(m，H2，3，4，5，6半乳糖，CH2N，[CH2CH2O]n，[CH2CH(CH3)O]n)， 1.42-0.89(m，[CH2CH(CH3)O]n)；13C NMR(100.6MHz，D2O)：δ＝ 143.8(NCH＝C)，126.0(NCH＝C)，99.7(C1甘露糖)，75.8，75.7，75.6， 74.8，73.3，72.6，72.3，70.8，70.3，69.9，69.8，69.1，67.9，67.0，61.2， 60.0，50.4，17.5，16.4。
通过点击化学，应用如上所述相同的方法制备甘露糖基化 904(904-M)。
通过O连接的704和904的甘露糖基化(704-O-M和904-O-M)
2，3，4，6-四-O-乙酰基-D-吡喃甘露糖苷
在惰性气氛下，在分子筛存在下，将乙酸肼(190mg， 2.06mmol，1.35Eq)添加至五-O-乙酰基-α-D-吡喃甘露糖苷(596mg， 1.53mmol)的无水THF(6mL)溶液中。在室温下搅拌所述混合物4小 时30分钟，减压浓缩并通过硅胶色谱(CH2Cl2/CH3OH；25∶1)纯化， 得到作为黄色油状物的2，3，4，6-四-O-乙酰基-D-吡喃甘露糖苷 (383.3mg，78％)。RMN 1H(CDCl3)：δ＝5.41(m，0.5H，H1α)，5.40(m， 0.5H，H1β)，5.31-5.19(m，3H，H4，3，2)，4.30-4.06(m，3H，H5，6a，6b)， 2.21-1.98(m，12H，CH3CO)。RMN 13C(100.6MHz，CDCl3)：δ＝176.2， 171.2，170.5et 170.2(C＝O)，92.6(C1)，71.5(C4)，69.2(C3)，68.9(C2)， 66.6(C5)，62.9(C6)，21.3，21.2，21.1et 20.9(4×CH3CO)。
2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-O-三氯乙酰亚胺基-α-D-吡喃甘露糖苷
在惰性气氛下，在分子筛存在下，依次将碳酸钾(836mg， 6.05mmol，6.7Eq)和三氯乙腈(0.78mL，7.8mmol，8.8Eq)添加到 2，3，4，6-四-O-乙酰基-D-吡喃甘露糖苷(310mg，0.89mmol)的无水二 氯甲烷(20mL)溶液中。在室温下搅拌所述混合物12小时，然后过 滤，蒸发，得到作为无色油状物的2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-O-三氯乙 酰亚胺基-α-D-吡喃甘露糖苷(457mg，96％)。
2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-O-704-α-D-吡喃甘露糖苷(704-manAc4)：
在氮气气氛下，在室温下，将三氟化硼乙醚络合物(200μL， 1.62mmol，25当量)添加至704(377.6mg，69μmol)和2，3，4，6-四-O- 乙酰基-α-D-吡喃甘露糖苷三氯乙酰亚氨酯(mannopyranoside trichloroacetamidate)(509.4mg，1.03μmol，15当量)的无水二氯甲烷 (20mL)溶液中，并在室温下搅拌所述反应混合物2小时。减压浓缩 所述溶液，用磷酸盐缓冲液(pH7，4mL)稀释，并在4℃下，通过对 MilliQ去离子水(6×1.5L)透析(H1透析膜2,000MCWO) 来纯化，然后冷冻干燥，以提供作为黄色油状物的 704-ManAc4(290mg，高达35％的乙酰化甘露糖引入)。1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ＝5,36(dd，J＝3,4，10,1Hz，1H，H4)，5,30-5,25(m，2H， H2，H3)，4,86(d，J＝3,3Hz，1H，H1)，4,34-4,13(m，4H，CH2OgalAc4， H5，H6)，3.80-3.21(m，[CH2CH2O]n，[CH2CH(CH3)O]n，CH2N)，2,15， 2,10，2,03et 1,98(4×s，4×3H，CH3CO)，1,15-1,05(m， [CH2CH(CH3)O]n)；RMN 13C(100,6MHz，CDCl3)：δ97,9(C1)，77,5， 77,2，76,8，75,7，75,5，73,5，73,0，72,7，71,0，70,7，70,5，70,1，69,2 (C2)，68,7(C4)，66,3，62,6，61,9(C6)，29,8，21,0×2et 20,8(4×CH3CO)， 17,6，17,4。
1-O-704-α-D-吡喃甘露糖苷704嵌段共聚物：704-O-M
将产物704-manAc4(296mg，43μmol)添加至新鲜制备的甲酸钠 溶液(200mM，1.7mmol，29eq.)中，在室温下搅拌2小时，然后减 压浓缩，用磷酸盐缓冲液(pH7，4mL)稀释，并在4℃下，通过对 MilliQ去离子水(6×1.5L)透析(H1透析膜2,000MCWO) 来纯化，然后冷冻干燥，得到作为黄色油状物的704-Man(246mg， 高达35％的乙酰化甘露糖引入)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝ 4,87(d，J＝3,4Hz，1H，H1)，3,85-3,75(m，2H，CH2OGal)，3,70-3,25 (m，H2，3，4，5，6[CH2CH2O]n，[CH2CH(CH3)o]n，CH2N)，1,22-1,02(m， [CH2CH(CH3)O]n)；RMN 13C(100,6MHz，CDCl3)：δ＝100,5(C1)，77,7， 77,4，77,1，76,2，75,9，75,7(C5)，74,9(C3)，74,2，74,0，73,7，73,3(C2)， 73,0，72,3(C4)，72,1，71,2，70,970,6，68,9，67,1，62,1(C6)，18,9，18,6， 17,8，17,7。
通过直接偶合，应用如上所述相同的方法制备甘露糖基化 904(904-O-M)。
动物程序。将8周龄C57bl/6雌性小鼠(Janvier，Le Genest Saint Isle，法国)用于试验。将动物放在用于安放小鼠的标准尺寸的塑料 箱中。将动物放置在带空调的(15-21℃)环境中。人造的白天/夜晚 光线循环包括12小时光和12小时黑暗，在8：00a.m开始照明。在 各注射之前，通过异氟烷麻醉小鼠。使用U100微细注射器(BD Medical Rungis，法国)注射重组蛋白质-合成配制物。在第0天和 21天，按照初免/加强方案，用100μl皮下(s.c.)注射各动物。在第0、 21和42天，使用玻璃移液管收集全部小鼠的来自眶后静脉窦的血 样。在37℃下加热血样30分钟，然后在5000rpm下离心5分钟。 收集血清，并在-80℃下储存。在第42天处死小鼠，收集血样，并 将脾脏用于ELISPOT分析。
用150μg使用0.25％的Tyrode′s培养基(CaCl2 3mM，MgCl22mM，KCl 6mM，NaCl 140mM，葡萄糖10mM，和Hepes 10mM， pH7.4；Tyrode Pharmacology.Philadelphia，1908，第二版，1912) 中的704-M配制的β-半乳糖苷酶重组蛋白质，在肩胛间区皮下注 射Beagle雄性狗(ENV，Nantes，法国)。使用2.5ml具有21G针的 注射器注射1ml配制物。
免疫反应的测定。通过ELISA测定β-半乳糖苷酶特异性的小 鼠抗体(总IgG)滴度。使用β-半乳糖苷酶蛋白质用于在4℃下涂布 所述孔过夜。在环境温度下用BSA饱和1小时后，在37℃下培养 血清稀释液1个半小时。然后，在环境温度下，培养以1/5000稀 释的过氧化物酶-共轭的山羊抗小鼠IgG 1小时，并在添加所述过氧 化物酶底物后，在490nm下采用分光光度法读取平板。对于各小 鼠，以4种稀释液：1/20，1/200，1/2000，1/20000测试免疫前、 加强前和最终的血清。将标准物的滴度任意固定在5000，并从 1/1000稀释至1/64000，以构造校准曲线。保存所述校准曲线线性 部分包括的具有OD的各测试稀释样品，用于抗体滴度测定。不包 括其它稀释液。通过具有一些较小改变的如上所述的ELISA测定β- 半乳糖苷酶特异性狗抗体(总IgG)滴度。简言之，使用1/5000稀释 度的过氧化物酶-偶联的山羊抗狗IgG。将标准物的滴度任意固定在 5000。通过调整所述的小鼠抗β-半乳糖苷酶滴度测定的方案，通过 ELISA测定卵清蛋白特异性小鼠抗体(总IgG)滴度。
通过ELISPOT(Diaclone，Besan on，法国)测定作为βGal CTL 存在的标记物的I类限制的IFNγ分泌物。使用H2-Kb受限的 ICPMYARV肽作为代表性的βGal表位。阴性对照是KRWIILGLNK 肽(HIV gag 263-272)。通过锥石蓝分离术在血球计数器载玻片上计 数活的脾细胞，以1×106/ml重悬于完全培养基(补充有全部来自 Invitrogen，Paisley，UK的10％胎牛血清、2mmol/l L-谷氨酰胺、青 霉素和链霉素的RPMI 1640)中，然后以1×105个细胞/孔一式三份 分配。在5μg/ml刀豆素A或4μg/ml肽存在下，在37℃和5％CO2 下，培养细胞过夜。根据厂商的方案检测SFC，在AID ELISPOT 读数器(Autoimmun Diagnostika，Strassberg德国)上自动计数，并将 结果表示为SFC/百万个脾细胞。为了校正细胞计数误差，通过乘 以全部孔的ConA刺激的平均SFC，除以来自第n只小鼠的ConA 刺激的SFC，来标准化来自第n只小鼠的肽特异性SFC计数。一 致地发现标准化降低了组内差异。此外，通过如上所述的用于卵清 蛋白CD8特异性细胞的定量的ELISPOT测定I类限制的IFNγ分泌 物。使用H2-Kb受限的SIINFEKL肽作为代表性的卵清蛋白表位。
实施例1
甘露糖基化嵌段共聚物的合成和表征
为了测试作为用于亚单位疫苗接种的佐剂的潜在的目标载体， 通过引入甘露糖目标配体以化学方法改性两亲性四官能的嵌段共 聚物。然后，在与重组抗原配制和皮下注射之后，分析它们诱导体 液和细胞反应的能力。
按照两种化学策略(图1)进行在四官能的两亲性嵌段共聚物 704的远末端引入甘露糖基残基；(a)通过凭借所述叠氮基封端聚合 物和含有炔基的甘露糖部分之间的铜催化的Huisgen 1，3-偶极环加 成的点击化学(Fig.1a)，和(b)在三氟化硼乙醚络合物存在下使 2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-O-α-D吡喃甘露糖苷与所述聚合物的反应， 然后通过甲酸钠进行所述糖的脱保护，通过O连接的所述四官能 聚合物的羟基与甘露糖之间的直接偶合(图1b)。将通过点击化学和 直接偶合获得的甘露糖基化704分别命名为704-M和704-O-M。对 于点击化学方法，通过在三氟化硼乙醚络合物存在下在无水二氯甲 烷中β-D-甘露糖五乙酸酯与炔丙醇之间反应，然后甲醇钠介导除去 乙酰基保护基而容易地制备所需O-炔基碳水化合物。以定量的产 量获得炔丙基-β-D-吡喃甘露糖苷，而不形成不希望的α-端基异构 体(anomer)。
使用之前已经应用于聚乙二醇的修正两步法(Mereyala等， Carbohydrate Research，1998，307，351；Muthana等，J Am Chem Soc， 2007，129，11918；Bonger等，Bioorg Med Chem，2007，15，4841； 等，Pharm Res，2005，22，1411-1421；Li等，Biomacromol， 2003，4，1055；Iyer等，Tetrahedron Lett，2004，45，4285)在四官能化 704的PEO末端引入叠氮基。使用在无水二氯甲烷中的过量的对甲 苯磺酰氯(每羟基3当量)和氢氧化钾，将具有远末端羟基的704转 化成双甲苯磺酸化衍生物嵌段共聚物-OTs。通过400MHz的1H NMR试验，使用δ＝1.18-1.03ppm(多重线，150H)的PPO CH3信号 与δ＝4.14ppm的末端PEO亚甲基CH2OTs信号或δ＝7.78和7.33ppm 的甲苯磺酰基芳族信号的对比积分(integration)来测定羟基的转 化率。该方法表明，高达91％的所述704的末端端基被官能化。在 80℃下在无水乙醇中进行用叠氮根离子完全取代704-OTs的磺酸 酯，得到所述双叠氮基704-N3。1H NMR分析显示，甲苯磺酰基芳 族信号全部消失，末端PEO亚甲基质子信号变缓成宽的-OCH2CH2- 信号。13C NMR实验也证实，磺酸酯定量转化成具有对应于-CH2N3信号的δ＝50.8ppm的末端PEO亚甲基碳的独特信号的叠氮化物。
在55℃下，使用在t-BuOH/H2O(1∶1，v/v)中的硫酸铜/抗坏血酸 钠进行叠氮化物704-N3与炔丙基-β-D-吡喃甘露糖苷的优化的1，3- 偶极环加成2天，得到在704-M远末端含有高达85％甘露糖残基 的嵌段共聚物704三唑-甘露糖。通过1H和13C NMR证实1，4-三唑 环的区域特异性(regiospecific)形成，使用PPO CH3信号与三唑 或吡喃糖苷信号的对比积分计算甘露糖的引入率。使用通过直接偶 合形成产生80％的位于704-O-M远末端的甘露糖残基的1-O-聚合 物-α-D-甘露糖的第二种化学合成来定量分析704中引入甘露糖。 同样将通过点击化学或者直接O-连接的甘露糖基化704的所述合 成法应用于四官能嵌段共聚物904的甘露糖基化。
甘露糖基化或未甘露糖基化的704和904的分子再分配 (repartition)的Maidi-Tof分析未显示出差异(未示出数据)。
实施例2
通过两种不同化学策略的甘露糖基化704和904引起对s.c.亚 单位疫苗接种的免疫反应
研究将甘露糖耦合至704和904四官能化聚合物的方法对疫苗 接种效力的影响。为此，用使用通过点击化学(704-M和904-M)或 直接O-连接(704-O-M和904-O-M)的甘露糖基化704和904配制的 重组β-半乳糖苷酶在第0天和21天皮下注射小鼠。结果(图2)表明， 在第42天，不论所测试的将甘露糖耦合至两种四官能聚合物的方 法，对β-半乳糖苷酶的细胞和体液反应均是相同的。
实施例3
优化具有704-M的配制物参数以获得高体液和细胞反应
用使用不同量的704-M配制的重组β-半乳糖苷酶在第0天和 21天皮下注射小鼠。在第一次β-半乳糖苷酶注射后的第42天杀死 小鼠，以比较不同组的抗β-半乳糖苷酶滴度的水平。对于含有 0.25％的704-M的配制物(图3a)，观察到体液反应的显著增强，并 达到最高点。
接着，研究与母体载体相比的目标载体的影响。为此，在第0 天和21天，用25μg使用704-M和母体704配制的β-半乳糖苷酶 皮下注射小鼠。以产生抗β-半乳糖苷酶抗体滴度最大增强的0.25％ 的浓度使用各载体。与母体704载体相比，对于704-M，在第42 天观察到抗β-半乳糖苷酶滴度的显著增加(图3b)。最重要的是， 在注射704-M的小鼠组中，I类限制的细胞免疫反应也显示出增强 (图3c)。
用使用0.25％的704-M配制的β-半乳糖苷酶的剂量反应试验表 明，用10μg β-半乳糖苷酶获得最大的体液反应(图3d)。还对小鼠 品系对704和704-M疫苗接种效力的影响进行了研究。图3e显示， 与用704母体获得的相比，在使用704-M的Bal/c小鼠中，也观察 到抗β-半乳糖苷酶抗体滴度增加。
实施例4
配制培养基不影响甘露糖基化的704的疫苗接种效力
然后在不同的配制培养基中测试704和704-M的效力。在第0 天和21天，使用用生理盐水或Tyrode′s培养基中的704和704-M 配制的β-半乳糖苷酶皮下注射小鼠。结果表明，用于配制物的培养 基组成不改变使用704或704-M进行免疫的小鼠组中的抗β-半乳 糖苷酶抗体滴度(图4)。结果也证实，当用甘露糖目标部分以化学 方法改性704时，在第42天获得急剧增加的体液反应。
实施例5
704-M引起大动物中的重组疫苗接种
为了在大动物上延伸我们的发现，狗在第0天接受用150μg使 用704-M配制的β-半乳糖苷酶的单次s.c.注射。结果表明，在单次 注射后10天，可检测到体液反应，并且所述体液反应随时间连续 增加(图5)。
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