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1、(10)授权公告号 CN 101361459 B (45)授权公告日 2012.03.07 CN 101361459 B *CN101361459B* (21)申请号 200810198634.7 (22)申请日 2008.09.19 A01H 4/00(2006.01) (73)专利权人 广州甘蔗糖业研究所 地址 510403 广东省广州市海珠区石榴岗路 10 号 (72)发明人 沈万宽 陈仲华 邓海华 刘睿 何慧怡 杨湛端 (74)专利代理机构 广州市红荔专利代理有限公 司 44214 代理人 唐弟 CN 101138321 A,2008.03.12, 全文 . 沈万宽等 . 热水处理防治。
2、甘蔗宿根矮化病的 效果及对再生植株影响研究 .云南农业大学学 报 .2008, 第 23 卷 ( 第 4 期 ),474-478. 易代勇等 . 甘蔗新品种黔糖 4 号腋芽繁殖培 养基与激素配方的研究 .中国农学通报 .2005, 第 21 卷 ( 第 10 期 ),57-59. (54) 发明名称 去除甘蔗宿根矮化病菌、 快速繁殖健康甘蔗 种苗的方法 (57) 摘要 本发明涉及甘蔗种苗的繁殖生产， 提供一种 去除甘蔗宿根矮化病菌、 快速繁殖健康甘蔗种苗 的方法， 包括如下步骤 ： 热水处理少量原种并生 产、 以其再生植株经斑点酶标免疫试验 (DB-EIA) 检测为阴性的茎尖为外植体， 经诱导。
3、培养、 继代增 殖培养、 促根培养、 假植及二级或三级苗圃扩繁生 产健康种苗， 并在苗圃扩繁中注意砍种工具 ( 蔗 刀 ) 的消毒， 在种苗出圃用于大田生产用种前， 抽 样取蔗茎汁用 DB-EIA 检测 RSD 病菌， 确保提供合 格种苗。本发明的优点是 ： 能彻底去除甘蔗种苗 宿根矮病病原菌， 年繁殖系数高达 1 万倍以上， 且 种苗无变异， 具有快速、 高效、 安全的优点， 适合工 厂化、 规模化、 标准化生产甘蔗健康种苗。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 吴涛 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 CN 101361。
4、459 B1/1 页 2 1. 一种去除甘蔗宿根矮化病菌、 快速繁殖健康甘蔗种苗的方法， 其特征在于包括如下 步骤 ： . 原种处理和生产 ： 采集甘蔗品种主茎， 砍成双芽段， 选取若干有效芽段， 经 49.5 50.5水浴处理23h， 然后在3538光照培养箱中催芽3d5d， 催芽后育苗于35 以下的温室中， 待蔗苗长成 2 4 片叶时， 定植于网室苗圃中， 待甘蔗生长至 12 或 13 个芽， 用经 75酒清浸泡消毒的蔗刀砍取整条蔗茎， 并取汁用斑点酶标免疫试验法 (DB-EIA) 检 测 RSD 病菌 ； .外植体选取与灭菌 ： 取步骤中经DB-EIA检测结果呈阴性且生长健壮的蔗茎顶芽 。
5、进行灭菌处理， 作组织培养外植体 ； . 外植体诱导培养 ： 将步骤灭菌处理后的蔗茎顶芽在无菌条件下， 切取其 3 5mm 的茎尖组织接种于诱导培养基上， 诱导产生丛芽 ； . 继代增殖培养 ： 将步骤诱导分化的丛芽切成单株接种于增殖培养基上， 进行继 代增殖培养， 在 27 28散射光下培养， 15 20d 继代一次， 继代数不超过 10 代 ； . 促根培养 ： 将步骤长至 5 6cm 高的小苗转接于生根培养基上， 进行生根培养 ； . 假植 ： 当步骤生根小苗生长至 6 8cm 高， 根系发育健壮后， 将生根瓶苗移到自 然光下炼苗23d， 取出洗去苗上的培养基， 种植于苗圃上， 按常规管。
6、理， 苗高3545cm且 生长健壮的假植苗可移栽于大田进行扩繁 ； . 苗圃扩繁 ： 将步骤中的假植苗定植于大田建立一级健康种苗圃， 再通过二级或 三级苗圃扩繁， 在从上级苗圃采苗进入下级苗圃扩繁时， 采苗工具需用 75的酒精浸泡消 毒 5min 以上， 方可用于采苗， 以防交叉感染 ； . 种苗 RSD 检测 ： 将步骤扩繁的种苗， 在种苗出圃用于大田生产用种前， 抽样取蔗 茎汁用 DB-EIA 检测 RSD 病菌， 当蔗茎感染率为 0 时， 种苗合格， 可供大田生产种植。 权 利 要 求 书 CN 101361459 B1/5 页 3 去除甘蔗宿根矮化病菌、 快速繁殖健康甘蔗种苗的方法 技。
7、术领域 0001 本发明涉及甘蔗种苗的繁殖生产， 尤其是关于去除甘蔗宿根矮化病菌的技术 背景技术 0002 甘蔗 (Saccharum.spp) 是我国主要的糖料作物及具有良好发展前景的生物质能 作物。 甘蔗宿根矮化病(Ratoon Stunting Disease， 简称RSD)是一种世界性的重要甘蔗病 害， 也是我国蔗区的一种主要甘蔗病害， 对甘蔗产量影响较大， 一般新植蔗产量损失 10 15， 宿根蔗产量损失 20 25， 且影响宿根蔗年限， 是甘蔗品种退化的重要原因之一。 甘蔗 RSD 病原细菌寄居于蔗茎维管束中， 尚无有效的化学防治方法 ； 同时由于缺乏抗源材 料， 甘蔗 RSD 抗。
8、病育种成效不大， 至今未育成抗性较好的生产品种， 其较有效的控制措施是 种植健康种苗。 0003 培育甘蔗健康种苗的主要目的是去除以甘蔗 RSD 为主的种苗传播病害。早期比较 传统的去除甘蔗RSD病菌的方法是50热水浸种2-3h或54-58热空气处理蔗种8h， 可在 一定程度上杀死感病蔗茎中的RSD病原菌， 大大减轻RSD的发生程度， 但上述热处理方法具 有不能彻底去除 RSD 病菌、 易伤害蔗芽、 水温难控制、 去菌效果不稳定及种苗繁殖系数低等 不足之处， 不适合我国蔗区生产实际， 难以在生产上大面积推广应用。 近年也有利用热处理 结合茎尖分生组织 (1mm 以下 ) 培养去除甘蔗 RSD 。
9、病菌的报道， 但该种方法切取的外植体特 别细小， 需要在解剖镜下切取， 操作难度较大， 且由于外植体特别细小， 导致培养过程中酚 污染率极高， 诱导成苗率极低， 生产成本较高， 难以在生产上推广应用。 因此， 生产上迫切需 要一种能高效去除 RSD 病菌、 繁种速度快， 同时生产成本低、 操作容易的甘蔗健康种苗生产 方法， 来满足我国甘蔗健康种苗生产的实际需要。 发明内容 0004 本发明的目的是提出一种去除甘蔗宿根矮化病菌和快速繁殖甘蔗健康种苗的方 法， 其具有去菌彻底、 能规模化、 快速、 经济的地繁殖甘蔗健康种苗的效果。 0005 本发明的技术方案如下 ： 0006 一种去除甘蔗宿根矮化。
10、病菌、 快速繁殖健康甘蔗种苗的方法， 包括如下步骤 ： 0007 1. 原种处理和生产 ： 采集甘蔗品种主茎， 砍成双芽段， 选取若干有效芽段， 经 49.550.5水浴处理 2 3h， 放在 35 38光照培养箱中催芽 3d 5d， 催芽后育苗 于 35以下温室中， 待蔗苗长成 2 4 片叶时， 定植于网室苗圃中， 待甘蔗生长至 10 个芽 左右， 用经 75酒清浸泡消毒的蔗刀砍取整条蔗茎， 并取汁采用斑点酶标免疫试验法 (Dot b1ot enzyme immunoassays， 简称 DB-EIA) 检测 RSD 病菌 ； 0008 2. 外植体选取与灭菌 ： 取步骤 1) 中经 DB-。
11、EIA 检测结果呈阴性且生长健壮的蔗茎 的顶芽， 经灭菌处理， 作组织培养外植体 ； 0009 3. 外植体诱导培养 ： 将步骤 2) 灭菌处理后的顶芽在无菌条件下， 切取其 3 5mm 的茎尖组织接种于诱导培养基上， 诱导产生丛芽 ； 说 明 书 CN 101361459 B2/5 页 4 0010 4. 继代增殖培养 ： 将步骤 3) 诱导分化的丛芽切成单株接种于增殖培养其上， 进行 继代增殖培养， 在 27 28散射光下培养， 15 20d 继代一次， 继代数以不超过 10 代为 宜 ； 0011 5. 促根培养 ： 将步骤 4) 长至 5 6cm 高的小苗转接于生根培养基上， 进行生根。
12、培 养 ； 0012 6. 假植 ： 当步骤 5) 生根小苗生长至 6 8cm 高， 根系发育健壮后， 将生根瓶苗移 到自然光下炼苗 2 3d， 取出洗去苗上的培养基， 种植于苗圃 ( 塘泥、 泥碳土和河沙混合的 基质 ) 上， 按常规管理， 苗高 35 45cm 且生长健壮的假植苗可移栽于大田进行扩繁 ； 0013 7. 苗圃扩繁 ： 将步骤 6) 假植苗定植于大田建立一级健康种苗圃， 再通过二级或三 级苗圃扩繁， 在从上级苗圃采苗进入下级苗圃扩繁时， 采苗工具需用 75的酒精浸泡消毒 5min 以上， 方可用于采苗， 以防交叉感染 ； 0014 8. 种苗 RSD 检测 ： 将步骤 7) 。
13、扩繁的种苗， 在种苗出圃用于大田生产用种前， 抽样 取蔗茎汁用 DB-EIA 检测 RSD 病菌， 当蔗茎感染率为 0 时， 种苗合格， 可供大田生产种植。 0015 与现有技术对比， 本发明有如下突出特点和显著进步 ： 0016 一、 以高效彻底去除甘蔗种苗 RSD 病菌， 确保种苗质量 0017 本发明采用两次去除RSD病菌的方法(热水处理及茎尖培养)， 确保种苗RSD病菌 去除率 100。 0018 二、 以快速大量繁殖甘蔗健康种苗， 其种苗无变异 0019 本发明采用组织培养微体快繁及田间多级苗圃扩繁技术， 种苗年繁殖系数在 1 万 倍以上， 本发明采用茎尖培养， 未诱导产生愈伤组织，。
14、 不存在变异问题。 0020 而现有技术中 ： 热水处理种苗年繁殖系数约 100 倍 ； 心叶愈伤组织培养虽然也能 高效去除 RSD 病菌且繁殖系较高， 但愈伤组织培养易产生变异， 种苗遗传稳定性差。 0021 三、 本发明培植的甘蔗健康种苗， 具有明显的增产、 增糖、 提高抗旱性能效果由于 本发明生产的健康种苗， 能彻底去除 RSD 病菌， 保持蔗茎维管束畅通， 有利于水份和营养物 质的运输， 从而具有显著的增产、 增糖效果。 具体实施方式 0022 下面用二个具体实施例来对本发明作进一步的说明 ： 0023 实施例一 0024 一种高效去除甘蔗宿根矮化病菌、 快速繁殖健康甘蔗种苗的方法， 。
15、包括如下步 骤 ： 0025 1. 原种处理和生产 ： 于 8 月中旬采取甘蔗品种粤糖 00-236 主茎 10 条 ( 株龄 8 个月 )， 砍成双芽段， 选取蔗芽质量较好的有效芽段 40 段， 经 500.3水浴处理 2h， 放在 35光照培养箱中催芽 3d， 蔗芽萌动后在玻璃温室 (28 30 ) 中， 用细沙育苗， 待蔗苗长 成 3 4 片叶、 假茎高 25cm 时， 移栽于试验基地网室中， 待甘蔗生长至 12 13 个芽， 用经 75酒清浸泡 5min 以上的蔗刀砍取 20 条生长正常的蔗茎 ( 保留蔗梢 )， 并给每条蔗茎编 号， 砍每条蔗茎基部 1 4 节中的 1 个节， 用气泵。
16、取汁 200 300L， 保存于 -20冰箱 中， 3d 内用 DBEIA 方法检测 RSD 病菌。 0026 2. 外植体选取与灭菌 ： 取检测结果为阴性的蔗茎的蔗梢， 剥去外叶， 切取茎尖 1 说 明 书 CN 101361459 B3/5 页 5 2cm， 在超净工作台上， 用 75 (V/V) 的酒精擦拭， 然后用 0.1的升汞溶液浸泡消毒 12 15min， 再用无菌水冲洗 4 遍， 将茎尖组织浸泡在 500mg/L PVP 溶液中， 切取 3 5mm 的茎尖 组织作外植体。 0027 3. 外植体诱导培养 ： 将步骤 2) 的外植体在无菌条件下接种于液体茎尖诱导培养 基 (1/2M。
17、S+0.2mg/L6-BA+30g/L 蔗糖 +1g/L 活性炭 (AC)， PH 6.2)， 在 27 28光照静置 培养 7 15d 诱导出丛芽。 0028 4. 继代增殖培养 ： 将步骤 3) 诱导出的丛芽切成单株转接于继代增殖培养基 (MS+0.5mg/L6-BA+NAA0.2mg/L+ 蔗糖 30g/L， pH 6.2) 中， 在 28散射光下培养， 15 20d 继代一次， 总继代次数 8 次。 0029 5. 促 根 培 养 ： 将 步 骤 4) 长 至 5 6cm 高 的 继 代 小 苗 转 接 于 生 根 培 养 基 (MS+IBA2mg/L+ 蔗糖 50g/L) 上进行生根。
18、培养， 经充分光照培养 30d 左右。 0030 6. 假植 ： 当生根小苗长至 6 8cm 高， 根系发育健壮后， 将生根瓶苗移到自然光下 炼苗 2 3d， 取出洗去苗上的培养基， 种植于由塘泥、 泥碳土和河沙混合的基质苗圃上， 种 植后7d内每天淋水12次， 约7d小苗返青后薄施水肥， 45d后苗高3545cm， 生长健壮， 即可移栽于大田进行扩繁。 0031 7. 苗圃扩繁 ： 将步骤 6) 假植苗定植于一级苗圃中， 定植规格为行距 1.0m， 株距 25 30cm， 2200 2500 株 / 亩， 定植前种植沟施呋呷 3 5kg/ 亩， 并用小锄使药与土混 合， 定植时用手压实， 边。
19、植边淋足定根水， 定植时间以下午 3 点钟后为宜， 植后 5 7d 每天 淋水至少 1 次， 7d 左右蔗苗返青， 成活率 95， 定植后 15 20d 薄施水肥， 以 5 8Kg 尿素 / 亩为宜， 并及时除草， 定植后约 30d， 蔗苗生长健壮， 其后田间管理按常规。当蔗株长至 20 个芽左右时， 即可采苗进入二级苗圃扩繁， 采苗前蔗刀需用 75酒精浸泡消毒 5min 以上， 以防交叉感染。当二级苗圃的蔗株长至 20 个芽左右时， 即可采苗进入三级苗圃扩繁， 同样 采苗前蔗刀需用75酒精浸泡消毒5min以上， 以防交叉感染， 当三级苗圃的蔗株长至20个 芽左右时， 即采苗用作生产用种， 采。
20、苗前蔗刀也需用 75酒精浸泡消毒 5min 以上， 以防交 叉感染。 0032 8. 种苗 RSD 检测 ： 将步骤 7) 扩繁的种苗， 在种苗出圃用于大田生产用种前， 随机 采取 20 条蔗茎取汁检测 RSD 病菌 (DB-EIA 检测方法 )， 蔗茎感染率为 0， 种苗合格。 0033 至此， 可将合格种苗用经酒精浸泡消毒的砍刀砍收， 贴上合格标签供大田生产种 植。 0034 实施例二 0035 一种高效去除甘蔗宿根矮化病菌、 快速繁殖健康甘蔗种苗的方法， 包括如下步 骤 ： 0036 1. 原种处理和生产 ： 于 8 月 9 月采取甘蔗品种新台糖 22 号主茎 10 条 ( 株龄 8 个。
21、月)， 砍成双芽段， 选取蔗芽质量较好的有效芽32个双芽段， 经500.3水浴处理2.5h， 放在37光照培养箱中催芽4d， 蔗芽萌动后在玻璃温室(2830)中， 用细沙育苗， 待蔗 苗长成34片叶、 假茎高26cm时， 移栽于网室苗圃中， 待甘蔗生长10个芽左右， 用经75 酒清浸泡 5min 以上的蔗刀砍取 20 条生长正常的蔗茎 ( 保留蔗梢 )， 并给每条蔗茎编号， 砍 每条蔗茎基部 1 4 节中的 1 个节， 用气泵取汁 200 300L， 保存于 -20冰箱中， 3d 内用 DBEIA 方法检测 RSD 病菌。 说 明 书 CN 101361459 B4/5 页 6 0037 2.。
22、 外植体选取与灭菌 ： 取步骤 1) 中检测结果为阴性的蔗茎的蔗梢， 剥去外叶， 切 取茎尖12cm， 在超净工作台上， 用75(V/V)的酒精擦拭， 然后用0.1的升汞溶液浸泡 消毒 12 15min， 再用无菌水冲洗 4 遍， 将茎尖组织浸泡在 500mg/LPVP 溶液中， 切取 3 5mm 的茎尖组织作外植体。 0038 3. 外植体诱导培养 ： 将步骤 2) 的外植体在无菌条件下接种于液体茎尖诱导培养 基 (MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+30g/L 蔗糖 +0.5g/L 活性炭 (AC)PH 5.8) 上， 以滤纸为 支持物， 在271的摇床中黑暗条件下振荡培养。
23、5d， 转速为401r/min， 第6d转入光照培 养， 15d 20d 诱导出丛芽。 0039 4. 继代增殖培养 ： 将步骤 3) 诱导出的丛芽切成单株转接于继代增殖培养基 (MS+6BA1.0mg/L+KT0.5mg/L+ 蔗糖 30g/L) 上培养， 15 20d 继代一次， 增殖系数 3 5 倍， 总继代次数 9 代。 0040 5. 促 根 培 养 ： 将 步 骤 4) 长 至 5 6cm 高 的 继 代 小 苗 转 接 于 生 根 培 养 基 (1/2MS+NAA1mg/L+ 蔗糖 20g/L) 上， 经充分光照培养 25d。 0041 6.假植 ： 当将步骤4)的生根小苗长至6。
24、8cm高， 根系发育健壮后， 将生根瓶苗移 到自然光下炼苗 2 3d， 取出洗去苗上的培养基， 种植于由塘泥、 泥碳土和河沙混合的基质 苗圃上， 种植后7d内每天淋水12次， 约7d小苗返青后薄施水肥， 45d后苗高3545cm， 生长健壮， 即可移栽于大田。 0042 7. 苗圃扩繁 ： 将步骤 6) 假植苗定植于一级苗圃中， 定植规格为行距 1.0m， 株距 25 30cm， 2200 2500 株 / 亩， 定植前种植沟施呋呷 3 5Kg/ 亩， 并用小锄使药与土混 合， 定植时用手压实， 边植边淋足定根水， 定植时间以下午 3 点钟后为宜， 植后 5 7d 每天 淋水至少 1 次， 7。
25、d 左右蔗苗返青， 成活率 91， 定植后 15 20d 薄施水肥， 以 5 8Kg 尿素 / 亩为宜， 并及时除草， 定植后约 30d， 蔗苗生长健壮， 其后田间管理按常规。当蔗株长到至 20 个芽左右时， 即可采苗进入二级苗圃扩繁， 采苗前蔗刀需用 75酒精浸泡消毒 5min 以 上， 以防交叉感染。当二级苗圃的蔗株长至 20 个芽左右时， 即可采苗进入三级苗圃扩繁， 同 样采苗前蔗刀需用75酒精浸泡消毒5min以上， 以防交叉感染， 当三级苗圃的蔗株长至20 个芽左右时， 即采苗用作生产用种， 采苗前蔗刀也需用 75酒精浸泡消毒 5min 以上， 以防 交叉感染。 0043 8. 种苗 。
26、RSD 检测 ： 将步骤 7) 扩繁的种苗， 在种苗出圃用于大田生产用种前， 随机 采取 20 条蔗茎取汁检测 RSD 病菌 (DB-EIA 检测方法 )， 蔗茎感染率为 0， 种苗合格。 0044 至此， 可将合格种苗用经酒精浸泡消毒的砍刀砍收， 贴上合格标签供大田生产种 植。 0045 经田间评价试验表明， 本发明生产的健康种苗， 具有明显的增产效果， 一般新植蔗 增产1015， 宿根蔗增产2030， 蔗糖份提高0.5个百分点左右， 延长宿根年限1 2 年。 0046 附录 0047 DB-EIA 检测程序 ： 0048 压板 ： 取1015张吸水纸， 剪成与硝化纤维膜一样大小(硝化纤维膜。
27、的长度与宽 度略小于压板的长宽度)， 硝化纤维膜用蒸镏水浸泡23min， 将硝化纤维膜附到一块带孔 的压板上 ( 注意膜与板上的孔对齐 )， 然后与吸水纸一起用压板压好， 上紧螺丝。 说 明 书 CN 101361459 B5/5 页 7 0049 上样 ： 用微量移液器吸取 100 130L 蔗汁样品点于板孔中， 每孔点一个样。 0050 晾干 ： 将点好样的板， 置于室温、 通风的地方， 待孔中的样液全部被硝化纤维膜和 吸水纸吸干 (1 2h)， 用螺丝刀解开压板， 取出硝化纤维膜。 0051 干燥 ： 将晾干后的硝化纤维膜， 置于 80的恒温鼓风干燥箱中 1h。 0052 封闭 ： 将硝。
28、化纤维膜置于 3的脱脂奶粉水溶液中， 在摇床上摇动 30min。 0053 洗膜 ： 取出硝化纤维膜， 用蒸镏水冲洗 3 次。 0054 加入 RSD 兔抗体 ( 一抗 ) ： 将 RSD 兔抗体溶于 PBST 中， 将冲洗干净的硝化纤维膜 置于加入 RSD 兔抗体的 PBST 溶液中， 并在摇床上温育 1 2h。 0055 洗膜 ： 取出硝化纤维膜， 用蒸镏水冲洗 3 次。 0056 加入羊抗兔碱性磷酸酶标记抗体 ( 二抗 ) ： 将碱性磷酸酶标记抗体溶于 PBST 中， 将冲洗干净的硝化纤维膜置于加入碱性磷酸酶标记抗体的 PBST 溶液中， 并在摇床上温育 1 2h。 0057 洗膜 ： 取出硝化纤维膜， 用蒸镏水冲洗 3 次。 0058 加入底物显色 ： 将 NBT/BCIP 加入到底物工作液中， 将硝化纤维膜在加入 NBT/BCIP 的底物工作液中温育 (37 )， 并在摇床上摇动 30min。 0059 洗膜 ： 取出硝化纤维膜， 用蒸镏水冲洗 3 次。 0060 漂白 ： 将冲洗后的硝化纤维膜在 10双氧水中漂白 20min。 0061 晾干、 拍照、 记录结果。 说 明 书 。