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1、(10)授权公告号 CN 101342192 B (45)授权公告日 2011.05.18 CN 101342192 B *CN101342192B* (21)申请号 200710043611.4 (22)申请日 2007.07.09 A01N 1/02(2006.01) A61K 35/52(2006.01) (73)专利权人 中国水产科学研究院东海水产研 究所 地址 200090 上海市杨浦区军工路 300 号 (72)发明人 章龙珍 庄平 闫文罡 黄晓荣 张涛 冯广朋 赵峰 (74)专利代理机构 上海东方易知识产权事务所 31121 代理人 欧阳俊立 CN 1596670 A,2005.。
2、05.23, (54) 发明名称 褐牙鲆精子快速冷冻保存方法 (57) 摘要 褐牙鲆精子快速冷冻保存方法， 涉及海水鱼 类精子保存方法， 需要提供一种操作简便， 快速保 存褐牙鲆精子， 能获得较高精子活率的冷冻保存 方法。本发明包括稀释液、 抗冻剂、 冷冻保护液配 制， 液氮中保存， 其特征是将天然海水稀释， 以不 能激活精子的稀释海水作为保存精子的稀释液 ； 采用浓度为 14g/100ml 乙二醇作为抗冻剂 ； 将稀 释液 + 抗冻剂作为褐牙鲆精子的低温冷冻保护 液， 将冷冻保护液在 4的恒温箱预冷 ； 精子与保 护液按1:1至1:3比例均匀混合放入离心管中， 将 离心管置于液氮罐口下 -2。
3、0平衡 1min， 然后快 速投入液氮中保存。本发明用于冷冻保存褐牙鲆 精子。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张忠会 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 2 页 CN 101342192 B1/1 页 2 1. 褐牙鲆精子快速冷冻保存方法， 包括稀释液、 抗冻剂、 冷冻保护液配制， 精子与保护 液混合放入离心管中投入液氮中保存， 其特征是将天然海水稀释， 用稀释的海水激活精子， 以稀释 1 倍海水作为保存精子的稀释液 ； 采用浓度为 14g/100ml 乙二醇作为抗冻剂 ； 上述 稀释液加抗冻剂作为冷冻保护液， 将冷冻保护液在。
4、 4的恒温箱预冷 ； 精子与冷冻保护液 按 1 1 或 1 1.5 或 1 2 或 1 2.5 或 1 3 比例均匀混合放入离心管中， 将离心管 置于液氮罐口下 -20平衡 1min， 然后快速投入液氮中保存。 2. 根据权利要求 1 所述的褐牙鲆精子快速冷冻保存方法， 其特征是采用浓度为 3g/100ml 乙二醇加浓度为 3g/100ml 二甲亚砜替代浓度为 14g/100ml 乙二醇抗冻剂。 权 利 要 求 书 CN 101342192 B1/2 页 3 褐牙鲆精子快速冷冻保存方法 技术领域 ： 0001 本发明涉及海水鱼类精子保存方法。 背景技术 0002 褐牙鲆 (Paralichth。
5、ys olivacens) 俗称比目鱼， 属鲽形目， 鲆科、 牙鲆属， 是近海 暖温性底层鱼类。其自然分布区主要是中国沿海、 朝鲜、 日本和俄罗斯的亚洲海区。其适应 性强， 生长快、 个体大、 肉质细嫩鲜美， 并有消炎解毒、 健脾益气等功效， 是名贵的重要海水 养殖品种之一。由于国际市场大量需求， 从上世纪 80 年代末至 90 年代初， 褐牙鲆遭到大量 的捕捞， 资源受到严重的破坏。为了弥补资源的不足和满足市场的需求， 在上世纪 90 年代 初， 我国引进的欧洲一些品种如大菱鲆， 已成为工厂化海水养殖的主要品种之一。 而褐牙鲆 是我国土族种， 由于受到过渡捕捞和环境等因素的影响， 种质资源越。
6、来越少。 0003 现有大菱鲆、 牙鲆精子的冷冻保存方法， 该方法为 ： 精子的稀释液为 MPRS、 TS-19、 TS-2等完全人工配制 ； 抗冻剂为10浓度的二甲亚砜(DMSO) ； 降温方法液氮面上6cm处10 分钟， 液氮面上 5 分钟， 进入液氮保存。精子活率最高 70。 0004 褐牙鲆精子的冷冻保存关系到我国这种物种保护， 但是目前还缺乏适合褐牙鲆精 子快速冷冻保存的方法。 现有技术用冰点渗透压仪首先测出精浆渗透压(mOsm/kg)， 根据渗 透压进行精子稀释液的配制， 精子稀释液主要采用 NaCl、 KCl、 葡萄糖等配制， 要配制出适合 于精子保存的稀释液需经过反复多次的实验。
7、才能获得 ； 抗冻剂用二甲亚砜， 二甲亚砜对精 子的毒性作用较大， 影响精子的保存效果 ； 降温过程一般应用程序降温仪降温， 需配备程序 降温仪 ； 保存容器为液氮罐。 发明内容 0005 本发明需要解决的技术问题是提供一种操作简便， 适合快速保存褐牙鲆精子， 同 时能获得较高精子活率的冷冻保存方法。 0006 本发明的技术方案包括稀释液、 抗冻剂、 冷冻保护液配制， 精子与保护液混合放 入离心管中投入液氮中保存， 其特征是将天然海水稀释， 用稀释的海水激活精子， 以不能 激活精子的稀释海水作为保存精子的稀释液 ； 采用浓度为 14g/100ml 乙二醇， 或浓度为 3g/100ml乙二醇+浓。
8、度为3g/100ml二甲亚砜作为抗冻剂 ； 上述稀释液+抗冻剂作为冷冻保 护液， 将冷冻保护液在4的恒温箱预冷 ； 精子与冷冻保护液按1:1或1:1.5或1:2或1:2.5 或1:3比例均匀混合放入离心管中， 将离心管置于液氮罐口下-20平衡1min， 然后快速投 入液氮中保存。 0007 本发明用褐牙鲆生存环境的天然海水稀释作为褐牙鲆精子的稀释液， 避免人工 配制精子稀释液要经过多次反复实验才能确定各种离子成分和离子浓度的烦琐操作， 同 时人工配制的稀释液由于缺乏一些天然的微量元素， 所以人工配制的稀释液不能完全满 足保存精子的需要， 对精子的保存效果不好， 影响精子的成活率。现有技术精子保。
9、存采用 的抗冻剂是二甲亚砜， 而本发明用乙二醇 (EG) 作为抗冻剂添加到稀释液中作为抗冻保护 说 明 书 CN 101342192 B2/2 页 4 液， 保存褐牙鲆精子， 使褐牙鲆精子冷冻保存后获得的成活率达到 90以上， 成活时间达 255s13.45s。采用 EG(3ml/100ml)+DMSO(3ml/100ml) 两种抗冻剂作为组合抗冻剂， 除可 以获得较好的冷冻保存效果外 ( 冷冻后精子的成活率达到 90以上 )， 两种组合抗冻剂还 可以延长冷冻后精子的成活时间， 成活时间长达 540s60s， 比单用乙二醇保存的成活时间 长 285s。本发明通过液氮罐口下 -20平衡 1 分钟。
10、， 快速投入液氮保存， 步骤简单， 不需要 昂贵的程序降温仪， 同样达到较好的保存效果。野外操作时只需配带 5-10 升的液氮罐和一 个保温瓶， 就可以进行精子的冷冻保存， 避免了目前野外采集到的精子必须带回实验室才 能进行冷冻保存， 精子采集时间过长或长途运输对精子的冷冻保存会造成很大的影响， 直 接影响到冷冻精子的成活率。 具体实施方式 0008 本发明采用褐牙鲆生存环境的天然海水 ( 其盐度为 31) 稀释， 例如将盐度为 31 的海水稀释 0.5、 1、 1.5、 2、 2.5、 3 倍， 用稀释的海水激活精子， 以不能激活精子的稀释海水 作为保存精子的稀释液， 经低温冷冻保存后， 检。
11、测精子的成活率来确定最适合冷冻保存的 稀释液， 经实验选择稀释 1 倍海水最适合作为褐牙鲆精子的稀释液 ； 通过不同抗冻剂、 不 同浓度对精子冷冻保存效果的比较， 确定乙二醇 (EG) 作为抗冻剂， 浓度为 14g/100ml， 或 EG(3g/100ml) 加 DMSO(3g/100ml) 作为抗冻剂添加到稀释液中作为褐牙鲆的低温冷冻保护 液， 将冷冻保护液置于 4下预冷， 将预冷过的保护液取出， 精子与保护液可按 1:1、 1.5、 2、 2.5、 3 的比例稀释， 按 1:15 比例稀释的效果最好， 将稀释好的精子装入 200l 的塑料离心 管中， 置于液氮罐口下 -20平衡 1 分钟， 然后将其快速投入液氮保存 ； 解冻时离心管快速 从液氮中提出， 置于38水浴中解冻。 采用本方法冷冻保存褐牙鲆精子， 冷冻后精子的活率 达 90以上。该方法与保存大菱鲆、 牙鲆的方法比较， 冷冻后精子的活率提高 20以上， 是 目前淡水和海水鱼类精子冷冻保存后获得精子活率最高的方法。 说 明 书 。