一、技术领域
本发明涉及一种水培方法，特别是一种适用于拟南芥根系蛋白质组学研究的无菌水培方 法。
二、技术背景
拟南芥作为模式植物已广泛应用于植物蛋白质组学研究，但拟南芥少而脆弱的根系和较 低的蛋白质含量难以满足大规模高通量的蛋白质组学研究的要求，这使得以获取根系为目的 的拟南芥常规栽培方法成为重大技术障碍。通常采用土培基质培养、琼脂基质培养和水培法 获得拟南芥根系材料，但上述种种方法都有其明显的缺点和不足：
①土培基质和琼脂基质培养的植物样本一方面不能回收完整的根系，而损失在基质的部 分恰恰是蛋白质合成最活跃的幼嫩根尖和根毛，另一方面由于根系被琼脂附着，可能造成实 验污染。
②水培法在非无菌开放条件下进行的，无法避免藻类和真菌的影响，且发芽并不整齐， 重复性低，而且以岩棉块和琼脂块为生长支持基质的水培方法更难于分离到完整的根系，给 实验结果带来负面影响。
③国内外报道的无菌水培法所用容器制作相对复杂，成本较高，特别是忽略了水培的缺 氧环境对根系蛋白质表达的影响。
所以，采用土培基质培养、琼脂基质培养和水培法获得拟南芥根系材料，不可避免地带 来很多麻烦且成本较高，因此，怎样建立一种高通量、高重复性、低成本的拟南芥无菌水培 方法，在短期内获得拟南芥大量完整健康的根系，应用于根系蛋白质组学研究，成为本领域 科技人员急待解决的问题。
三、发明内容
为了克服现有的水培方法在适合蛋白质组学研究的拟南芥根系培养中不可避免地带来的 很多麻烦，在短期内获得高生物量，高一致性的叶片和根系材料，本发明的目的是提供一种 适用于拟南芥根系蛋白质组学研究的无菌水培方法，它可以在短期内获得大量完整健康的根 系，克服了现有方法存在的缺点。
本发明的目的是这样实现的：采用锥形塑料组织培养瓶和80目不锈钢筛网为栽培容器， 注入水培营养液，并以注射针头和过滤器作为通气装置，通过在无菌工作台上完成播种与培 养过程，获得拟南芥的完整健康根系。
其中栽培容器制作方法如下：首先，以80目不锈钢筛网为栽培支持物，裁剪成12×4cm 的长方形，折叠为U型；然后，将不锈钢筛网插入锥形塑料组织培养瓶中，注入水培营养液， 筛网底部与营养液面保持5mm间隙；最后，盖好通气盖后湿热高压灭菌。
其中水培营养液配制方法如下：在1/4霍格兰氏水培营养液中添加2.5％浓度的蔗糖。
其中通气装置制作方法如下：首先，在组织培养瓶盖边缘处插入已灭菌的连有0.2μm过 滤器的5号注射针头至瓶底；然后，用Parafilm膜封紧针头与瓶盖间的缝隙；最后，在过滤 器另一端连接软管至通气泵。
其中播种方法如下：首先，在无菌工作台上，将种子置于灭过菌的离心管中，用70％乙 醇浸泡灭菌30秒，吸出乙醇；其次，用10％NaClO浸泡灭菌5分钟；然后，用无菌水清洗 5次，每次30秒；最后，将灭菌后的种子悬浮于含1％琼脂糖和20％蔗糖的高密度溶液中， 置于加热器上保持50℃，用1000μL移液枪，吸入种子，均匀的点到培养瓶的筛网上，间隔 1cm。
其中培养方法如下：首先，将培养瓶置于4℃冰箱中低温避光处理48小时；然后，将培 养瓶转移到人工气候箱中，设置光周期为16小时光照，8小时黑暗，光强110μmol.-2.s-1，光 照下温度为22℃，黑暗下温度为18℃，相对湿度70％，每日间隔7小时通气1小时，水培营 养液每周更换1次。
本项发明与现有方法相比具有以下优点：
①栽培容器制作成本低廉，制作简单，性价比高，而且，不锈钢筛网坚固稳定，不易变 形，可重复使用。
②完全避免了开放水培体系中根系损失和藻类、真菌的污染。
③克服了无菌栽培体系中根系通气困难的难题。
④该方法可以获得良好的重复性，能够获得高生物量，高一致性的叶片和根系材料。
⑤播种时更易于使用移液枪吸取单粒种子进行播种操作，而且，种子可以牢固的固定在 筛网上，不会因搬运培养瓶造成种子移位或落入营养液中。
四、附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1不锈钢筛网的折叠图。
五、具体实施方式：
适用于拟南芥根系蛋白质组学研究的无菌水培方法与现有方法不同，作了很大改进，具 体是：
采用锥形塑料组织培养瓶和80目不锈钢筛网为栽培容器，注入水培营养液，并以注射针 头和过滤器作为通气装置，通过在无菌工作台上完成播种与培养过程，获得拟南芥的完整健 康根系。
水培营养液为1/4霍格兰氏营养液，配方为1.25mM KNO3，0.5mM Ca(NO3)2，0.5mM MgSO4，0.625mM KH2PO4，2mM NaCl，42.5μM Fe-EDTA，17.5μM H3BO3，3.5μM MnCl2， 0.25μM ZnSO4，0.125μM CuSO4，0.05μM Na2MoO4，0.0025μM CoCl2，用葡甲胺调节 pH至5.8，配成2.5％浓度的蔗糖溶液。培养容器采用280ml锥形塑料组织培养瓶，口径80mm， 高70mm，锯通气孔，耐高温可重复使用。
以80目不锈钢筛网为栽培支持物，裁剪成12×4cm的长方形，如图1所示，沿虚线折 叠为U型；插入培养瓶中，注入1/4Hoagland营养液约120ml，筛网底部与营养液面保持5mm 间隙，以防止后期叶片被营养液浸没；盖好通气盖后湿热高压灭菌。
在无菌工作台上，将种子置于灭过菌的离心管中，用70％乙醇浸泡灭菌30秒，吸出乙醇， 立即用10％NaClO浸泡灭菌5分钟，最后用无菌水清洗5次，每次30秒；将灭过菌的种子 悬浮于1mL的含1％琼脂糖和20％蔗糖的溶液中，置于加热器上保持50℃；用1000μL移液 枪，吸入少量种子，均匀的点到培养瓶的筛网上；每瓶约5-6粒种子，间隔1cm左右；盖好 瓶盖后，用酒精棉擦拭瓶盖，在瓶盖边缘处插入已灭菌的连有0.2μm过滤器的5号注射针头 至瓶底，并用Parafilm膜封紧针头与瓶盖间的缝隙；使用锡纸将筛网平面以下的瓶体包裹好， 以尽量减小光照对根系生长的影响。
将所有接种的培养瓶置于4℃冰箱中低温避光处理48小时后移出；将培养瓶转移到人工 气候箱中，在过滤器另一端连接软管至通气泵；光周期为16小时光照，8小时黑暗，光强110 μmol.-2.s-1，光照下温度为22℃，黑暗下温度为18℃，相对湿度70％；每日间隔7小时通 气1小时，水培营养液每周更换1次。