《一种山胡椒的组织培养方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种山胡椒的组织培养方法.pdf（15页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)授权公告号 CN 102668980 B (45)授权公告日 2013.09.25 CN 102668980 B *CN102668980B* (21)申请号 201210141409.6 (22)申请日 2012.05.09 A01H 4/00(2006.01) (73)专利权人 中国计量学院 地址 310018 浙江省杭州市下沙高教园区学 源街 258 号 (72)发明人 邹克琴 李素芳 王为民 徐晓晖 刘军 (74)专利代理机构 杭州天正专利事务所有限公 司 33201 代理人 黄美娟 王兵 (54) 发明名称 一种山胡椒的组织培养方法 (57) 摘要 本发明公开了一种山胡椒组织。
2、培养方法， 以 山胡椒幼嫩的腋芽作为外植体， 建立一种通过组 织培养的快速离体繁殖方法 , 所述的方法包括无 菌材料的获得， 不定芽的诱导分化和增殖， 芽的生 根和移栽等步骤 ； 本发明对培养基进行了改良， 添加了谷胺酰胺调节剂， 大大提高了分化率， 省略 了组培中的无菌诱导生根环节， 采用开放式操作， 利用 NAA 诱导生根形成完整植株 ； 本发明方法克 服了山胡椒常规育种周期长、 繁殖系数低等缺点， 并提高了其性状的稳定性， 可实现育苗的工厂化 大批量生产， 并有效解决山胡椒优质种苗的供应 问题。 (51)Int.Cl. 审查员 姜岚 权利要求书 1 页 说明书 10 页 附图 3 页 (。
3、19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书10页 附图3页 (10)授权公告号 CN 102668980 B CN 102668980 B *CN102668980B* 1/1 页 2 1. 一种山胡椒 （lindera glauca） 组织培养方法， 其特征在于所述方法按如下步骤进 行 ： （1） 无菌材料的获得及诱导培养 ： 切取长势良好、 无病虫害的山胡椒幼嫩的腋芽， 用自 来水冲洗 0.5 2h， 然后在体积浓度为 1% 洗洁精的水溶液中振摇 2 5min， 用无菌水冲 净 ； 在超净工作台上用体积浓度 70 75% 乙醇水溶液浸泡 30 60s， 然。
4、后用混合消毒液 浸泡 20 30min， 所述的混合消毒液为体积比 1 ： 200 的吐温 20 和 84 消毒液的混合液， 再 用无菌水冲洗 3 5 遍， 将腋芽分切成 0.5 2cm 的节段， 然后将节段接种到装丛生芽诱 导培养基的培养瓶中， 盖上瓶盖并用封口膜封住瓶口， 置于培养箱中， 在 24 26， 光照 1500 2500lx 条件下培养 15 25 天 ； 所述丛生芽诱导培养基为添加 6-BA1.0 4.0mg/ L 和 NAA0.1 0.5mg/L 的 MS 基本培养基 ； 所述的 MS 基本培养基终浓度组成为 ： NH4NO31.65 克 / 升、 KNO31.9 克 / 升。
5、、 CaCl22H2O0.44 克 / 升、 MgSO47H2O0.37 克 / 升、 KH2PO40.17 克 / 升、 KI0.83 毫克 / 升、 H3BO35.2 毫克 / 升、 MnSO44H2O22.3 毫克 / 升、 ZnSO47H2O3.6 毫 克 / 升、 Na2MoO42H2O0.25 毫克 / 升、 CuSO45H2O0.025 毫克 / 升、 CoCl26H2O0.025 毫克 / 升、 Na2EDTA37.3 毫克 / 升、 FeSO47H2O27.8 毫克 / 升、 肌醇 100 毫克 / 升、 甘氨酸 2 毫克 / 升、 盐酸硫胺素 0.1 毫克 / 升、 盐酸吡。
6、哆醇 0.5 毫克 / 升、 烟酸 0.5 毫克 / 升、 蔗糖 20 40 克 / 升、 琼脂粉 3 12 克 / 升， 溶剂为水， pH 为 5.6 6.0 ； （2） 芽的分化和增殖 ： 观察步骤 （1） 所述 24 26， 光照 1500 2500lx 条件下培养 15 25 天后的节段， 切口部位开始膨大， 出现绿色突起， 20 40 天后出现不定芽， 再培养 10 20 天后， 当不定芽长到 2 4cm 时， 将不定芽切下转接到芽增殖培养基中， 在 24 26， 光照 1500 2500lx 条件下进行增殖培养， 获得丛生苗 ； 所述芽增殖培养基为添加 6-BA0.5 2.0mg/。
7、L、 NAA0.05 0.2mg/L 和谷氨酰胺 80 120mg/L 的 MS 基本培养基 ； 所 述的 MS 基本培养基终浓度组成同步骤 （1） ； （3） 壮苗培养 ： 将步骤 （2） 获得的丛生苗切割成单个， 并转接到壮苗培养基中， 在 24 26， 光照 1500 2500lx 条件下培养 15 25 天， 发育成 3 5cm 的分化苗 ； 所述壮苗培 养基为添加 6-BA0.5 2mg/L 和 NAA0.1 0.3mg/L 的 MS 基本培养基 ； 所述的 MS 基本培养 基终浓度组成同步骤 （1） ； （4） 分化苗的生根 ： 将经壮苗培养的分化苗从基部切下， 将芽苗基部切口在 。
8、30 50mg/ L 的 NAA 水溶液中浸泡 20 40min， 然后直接扦插入已消毒的移栽基质中， 再在移栽基质中 施以 1/4MS 无机盐含量的培养基作为养分， 扦插苗盖上薄膜， 保持湿度 90% 以上， 置通风阴 凉处， 在 24 26、 光照 1500 2500lx 条件下培养 10 20 天后长出 3 6 条细根， 形 成完整植株， 最终的生根率为9095% ； 所述移栽基质为细沙、 腐殖土与谷糠灰按质量比5 ： 2 ： 2 的比例配置而成， 所述移栽基质的消毒方法为 ： 采用体积浓度 0.5% 福尔马林水溶液均 匀喷洒基质， 塑料薄膜覆盖 3 5 天后揭开薄膜再曝晒 1 3 天，。
9、 完成对移栽基质的消毒。 2. 如权利要求 1 所述山胡椒组织培养方法， 其特征在于步骤 （1） 所述丛生芽诱导培养 基为添加 6-BA2.0mg/L 和 NAA0.3mg/L 的 MS 基本培养基。 3. 如权利要求 1 所述山胡椒组织培养方法， 其特征在于步骤 （2） 所述的芽增殖培养基 为添加 6-BA1.5mg/L、 NAA0.1mg/L 和谷氨酰胺 100mg/L 的 MS 基本培养基。 4. 如权利要求 1 所述山胡椒组织培养方法， 其特征在于步骤 （3） 所述壮苗培养基为添 加 6-BA1.0mg/L 和 NAA0.2mg/L 的 MS 培养基。 权 利 要 求 书 CN 102。
10、668980 B 2 1/10 页 3 一种山胡椒的组织培养方法 （一） 技术领域 0001 本发明涉及植物组织培养技术领域， 涉及一种山胡椒的组织培养和快速繁苗方 法。通过这种方法， 可以进行优良种苗规模生产。 （二） 背景技术 0002 山胡椒 （Lindera glauca） 属于樟科植物， 落叶灌木或小乔木， 又名毕澄茄、 野胡 椒、 山鸡椒、 山香椒、 木姜子等。主要分布于山东、 安徽、 浙江、 江西、 福建、 台湾、 河南、 湖南、 广东、 广西、 四川、 云南等地。山胡椒不但可用作园林点缀树种， 配植于草坪、 花坛和假山隙 缝， 而且山胡椒果实芳香， 果及叶可提取芳香油， 用作食。
11、品及化妆品香精， 其种子含脂肪油， 可制肥皂及机械润滑油。 更重要的是山胡椒的根、 枝、 叶、 果实可供药用， 有祛风湿、 消肿、 解 毒、 止痛的功效， 是我国卫生部公布的药食兼用植物材料。 0003 近几年研究又发现， 山胡椒果实挥发油中还含有大量的具有多种生物活性的单萜 和倍半萜类芳香油， 例如罗勒烯、 - 及 蒎烯、 樟烯、 壬醛、 癸醛和柠檬醛等。这些挥发油 对常见的多种革兰氏阳性细菌、 阴性细菌、 新型隐球菌和白色念珠真菌均有抑菌作用。 新的 研究还发现山胡椒具有防癌、 抗肿瘤等功效。因此， 山胡椒除了作为新型的香料、 食品保健 品和食品保鲜剂以外， 还被开发为新型的抑菌抗癌药物，。
12、 受到越来越广泛的关注。 0004 目前山胡椒的繁殖主要采用常规的种子繁殖和分株繁殖， 繁殖时间长， 繁殖系数 低， 无法满足日益高涨的生产和市场需求， 许多山胡椒的优良品种资源得不到利用。 生物技 术的快速发展， 特别是植物组织和细胞培养技术， 为山胡椒的快速繁殖育种研究提供了重 要基础。因此， 发明一种快速高效的山胡椒繁殖方法是必然的需要。 （三） 发明内容 0005 本发明目的是提供一种山胡椒的组织培养和离体快速繁殖的方法， 使得在短期内 可以获得大量的优质山胡椒种苗， 满足市场的需要。 0006 本发明采用的技术方案是 ： 0007 一种山胡椒组织培养方法， 所述方法按如下步骤进行 ：。
13、 0008 （1） 无菌材料的获得及诱导培养 ： 切取长势良好、 无病虫害的山胡椒幼嫩的腋芽， 用自来水冲洗 0.5 2h， 然后在体积浓度为 1% 洗洁精的水溶液中振摇 2 5min， 用无菌 水冲净 ； 在超净工作台上用体积浓度 70 75% 乙醇水溶液浸泡 30 60s， 然后用混合消毒 液浸泡 20 30min， 再用无菌水冲洗 3 5 遍 ； 将腋芽分切成 0.5 2cm 的节段， 然后将节 段接种到装丛生芽诱导培养基的培养瓶中， 盖上瓶盖并用封口膜封住瓶口， 置于培养箱中， 在 24 26， 光照 1500 2500lx 条件下培养 15 25 天 ； 所述混合消毒液为体积比 1 。
14、： 200的吐温20和84消毒液的混合液 ； 所述丛生芽诱导培养基为添加6-BA1.04.0mg/L和 NAA0.1 0.5mg/L 的 MS 基本培养基 ； 0009 （2） 芽的分化和增殖 ： 观察步骤 （1） 所述 24 26， 光照 1500 2500lx 条件下 培养 15 25 天后的节段， 切口部位开始膨大， 出现绿色突起， 20 40 天后出现不定芽， 再 说 明 书 CN 102668980 B 3 2/10 页 4 培养 10 20 天， 当不定芽长到 2 4cm 时， 将不定芽切下转接到芽增殖培养基中， 在 24 26， 光照 1500 2500lx 条件下进行增殖培养，。
15、 获得丛生苗 ； 所述芽增殖培养基为添加 6-BA0.5 2.0mg/L、 NAA0.05 0.2mg/L 和谷氨酰胺 80 120mg/L 的 MS 基本培养基 ； 0010 （3） 壮苗培养 ： 将步骤 （2） 获得的丛生苗切割成单个， 并转接到壮苗培养基中， 在 24 26， 光照 1500 2500lx 条件下培养 15 25 天， 发育成 3 5cm 的分化苗 ； 所述壮 苗培养基为添加 6-BA0.5 2mg/L 和 NAA0.1 0.3mg/L 的 MS 基本培养基 ； 0011 （4） 分化苗的生根 ： 将经壮苗培养的分化苗从基部切下， 将芽苗基部切口在 30 50mg/L 的。
16、 NAA 水溶液中浸泡 20 40min， 然后直接扦插入已消毒的移栽基质中， 再在移栽 基质中施以 1/4MS 无机盐含量的培养基作为养分， 扦插苗盖上薄膜， 保持湿度 90% 以上， 置 通风阴凉处， 在 24 26、 光照 1500 2500lx 条件下培养 10 20 天后长出 3 6 条细 根， 形成完整植株， 最终的生根率为 90 95% ； 所述移栽基质为细沙、 腐殖土与谷糠灰按照 质量比 5 ： 2 ： 2 的比例配置而成， 所述移栽基质的消毒方法为 ： 采用体积浓度 0.5% 福尔马林 水溶液均匀喷洒基质， 塑料薄膜覆盖 3 5 天后揭开薄膜再曝晒基质 1 3 天， 完成对移。
17、栽 基质的消毒， 或者采用体积浓度 0.5% 福尔马林水溶液均匀喷洒基质， 塑料薄膜覆盖 3 5 天后揭开薄膜再在烘箱中 60下烘 2 天， 完成对移栽基质的消毒。 0012 进一步， 步骤 （1） 所述丛生芽诱导培养基优选为添加 6-BA2.0mg/L 和 NAA0.3mg/L 的 MS 基本培养基。 0013 进一步， 步骤 （2） 所述的芽增殖培养基优选为添加 6-BA1.5mg/L、 NAA0.1mg/L 和谷 氨酰胺 100mg/L 的 MS 基本培养基。 0014 进一步， 步骤 （3） 所述壮苗培养基优选为添加6-BA1.0mg/L和NAA0.2mg/L的MS培 养基。 0015。
18、 进一步， 所述的 MS 基本培养基终浓度组成为 ： NH4NO31.65 克 / 升、 KNO31.9 克 / 升、 CaCl22H2O0.44 克 / 升、 MgSO47H2O0.37 克 / 升、 KH2PO40.17 克 / 升、 KI0.83 毫克 / 升、 H3BO35.2 毫克 / 升、 MnSO44H2O22.3 毫克 / 升、 ZnSO47H2O3.6 毫克 / 升、 Na2MoO42H2O0.25 毫克 / 升、 CuSO4 5H2O0.025 毫克 / 升、 CoCl2 6H2O0.025 毫克 / 升、 Na2EDTA37.3 毫克 / 升、 FeSO47H2O27.8。
19、 毫克 / 升、 肌醇 100 毫克 / 升、 甘氨酸 2 毫克 / 升、 盐酸硫胺素 0.1 毫克 / 升、 盐酸吡哆醇 0.5 毫克 / 升、 烟酸 0.5 毫克 / 升、 蔗糖 20 40 克 / 升、 琼脂粉 3 12 克 / 升， 溶剂为水， pH 为 5.6 6.0。 0016 更进一步， 本发明所述一种山胡椒组织培养方法推荐按照以下步骤进行 ： 0017 （1） 野外选种， 选择浙江临安山胡椒基地中长势良好、 无病虫害的山胡椒。 0018 （2） 无菌材料的获得 ： 切取上述山胡椒幼嫩的腋芽， 用自来水冲洗 1h， 在体积浓 度 1% 洗洁精的水溶液中振摇 3min， 无菌水冲净。
20、。在超净工作台上用体积浓度 75% 乙醇水 溶液浸泡 40s 进行表面灭菌， 然后用 100ml 的混合消毒液消毒 25min， 所述混合消毒液为 99.5ml 的 84 消毒液与 0.5ml 的吐温 20 的混合液， 无菌水冲洗 4 遍后， 将嫩芽分切成 1cm 的 节段， 然后将节段接种到装有丛生芽诱导培养基的培养瓶中， 封口膜封住瓶口后， 置于培养 箱中， 在25， 光照2000lx条件下培养20天 ； 所述丛生芽诱导培养基为MS基本培养基添加 6-BA2.0mg/L 和 NAA0.3mg/L， MS 基本培养基中蔗糖 30g/L、 琼脂粉 6g/L、 溶剂为水， pH5.8。 0019。
21、 （3） 芽的分化和增殖 ： 观察步骤 （2） 所述 25， 光照 2000lx 条件下培养 20 天后 的节段， 切口部位开始膨大， 出现绿色突起， 30 天后出现芽分生组织 （即不定芽） ， 再培养 15 说 明 书 CN 102668980 B 4 3/10 页 5 天， 当不定芽长到3cm时， 将不定芽切下转接到芽增殖培养基中在25， 光照2000lx条件下 进行增殖培养， 建立丛芽增殖体系， 获得丛生苗 ； 所述的芽增殖培养基为添加 6-BA1.5mg/ L、 NAA0.1mg/L、 谷氨酰胺 100mg/L 的 MS 基本培养基， MS 基本培养基中蔗糖 30g/L、 琼脂粉 6g。
22、/L、 溶剂为水， pH5.8。 0020 （4） 壮苗培养 ： 将丛生苗切割成单个， 转入壮苗培养基中， 分化苗基本不发生分化， 而以较快速度加粗伸长生长， 在 25， 光照 2000lx 条件下培养 20 天， 发育成 4cm 的健壮无 根苗， 获得分化芽 ； 所述壮苗培养基为添加 6-BA1.0mg/L、 NAA0.2mg/L 的 MS 基本培养基， MS 基本培养基中蔗糖 30g/L、 琼脂粉 6g/L、 溶剂为水， pH5.8。 0021 （5） 分化苗的生根 ： 将经壮苗培养的分化苗从基部切下， 将芽苗基部切口在 40mg/ L 的 NAA 水溶液中浸泡 30min， 然后直接扦插。
23、入已消毒的移栽基质中， 再在移栽基质中施以 1/4MS 无机盐 （包含 MS 大量元素、 微量元素和铁盐） 的培养基作为养分， 扦插苗盖上薄膜， 保 持湿度 90% 以上， 置通风阴凉处， 在 25、 光照 2000lx 条件下培养 15 天后长出 5 条细根， 形成完整植株， 最终的生根率为 92%。所述移栽基质为细沙、 腐殖土与谷糠灰按照质量比 5 ： 2 ： 2 的比例配置而成， 所述移栽基质的消毒方法为 ： 采用体积浓度 0.5% 福尔马林水溶液均 匀喷洒基质， 塑料薄膜覆盖 4 天后揭开薄膜再曝晒基质 2 天， 完成对移栽基质的消毒。 0022 本发明所述 MS 基本培养基包含大量元。
24、素、 微量元素、 铁盐、 有机物、 蔗糖和琼脂 粉。 所述大量元素组成是在配置1升 （1000毫升） 培养基时， 加硝酸铵(NH4NO3)1.65克、 硝酸 钾 （KNO3） 1.9 克、 氯化钙 （CaCl22H2O） 0.44 克、 硫酸镁 （MgSO47H2O） 0.37 克、 磷酸二氢钾 （KH2PO4） 0.17克。 所述微量元素组成是在配置1升 （1000毫升） 培养基时， 加碘化钾 （KI） 0.83 毫克、 硼酸 （H3BO3） 5.2 毫克、 硫酸锰 （MnSO4 4H2O） 22.3 毫克、 硫酸锌 （ZnSO4 7H2O） 3.6 毫克、 钼酸钠 （Na2MoO42H2O。
25、） 0.25 毫克、 硫酸铜 （CuSO45H2O） 0.025 毫克、 氯化钴 （CoCl26H2O） 0.025 毫克。所述铁盐元素组成是在配置 1 升 （1000 毫升） 培养基时， 加乙二胺四乙酸二钠 （Na2EDTA） 37.3 毫克， 硫酸亚铁 （FeSO47H2O） 27.8 毫克。所述有机物组成是在配置 1 升 （1000 毫升） 培养基时， 加肌醇 100 毫克、 甘氨酸 2 毫克、 盐酸硫胺素 （VB1） 0.1 毫克， 盐酸吡 哆醇 （VB6） 0.5 毫克， 烟酸 （VB5） 0.5 毫克。蔗糖浓度是 20 40 克 / 升， 琼脂粉浓度是 3 12 克 / 升。 00。
26、23 本发明所述山胡椒幼嫩腋芽选自浙江临安山胡椒基地中长势良好、 无病虫害的山 胡椒。 0024 本发明所述 1/4MS 无机盐含量的培养基是指将 MS 基本培养基中大量元素、 微量 元素和铁盐的含量降低为 1/4 的含量， 有机物、 蔗糖和琼脂粉均不添加， 即终浓度组成为 ： NH4NO30.4125 克 / 升、 KNO30.475 克 / 升、 CaCl22H2O0.11 克 / 升、 MgSO47H2O0.0924 克 / 升、 KH2PO40.0425 克 / 升、 KI0.2075 毫克 / 升、 H3BO31.3 毫克 / 升、 MnSO44H2O5.575 毫克 / 升、 Zn。
27、SO47H2O0.9 毫克 / 升、 Na2MoO42H2O0.0625 毫克 / 升、 CuSO45H2O0.00625 毫克 / 升、 CoCl26H2O0.00625 毫克 / 升、 Na2EDTA9.325 毫克 / 升、 FeSO47H2O6.95 毫克 / 升， 溶 剂为水， pH 为 5.6 6.0。 0025 本发明所述洗洁精是市售的各种洗洁精， 作为清洗剂使用时通常以体积比 1 ： 100 添加水。 0026 与现有技术相比， 本发明的有益效果主要体现在 ： 0027 （1） 以嫩芽为外植体， 应用组织培养的方法进行快速繁殖， 克服了山胡椒常规育种 说 明 书 CN 1026。
28、68980 B 5 4/10 页 6 周期长、 繁殖系数低等缺点 ； 该方法还具有生产出的种苗病毒少 , 遗传性稳定等特点 ； 0028 （2） 改进外植体消毒方法 ： 用毒性小并且易降解的 84 消毒液代替传统的不可降解 的氯化汞消毒剂， 氯化汞属于重金属有相当大的腐蚀性， 并含有剧毒 ； 长期接触更可能引起 皮肤过敏或肾病综合症， 进入环境对人类食物链也有相当大的破坏性， 采用 84 消毒液对生 态环境更安全环保 ； 0029 （3） 对培养基进行了改良， 添加了谷胺酰胺植物营养调节剂， 大大提高了山胡椒芽 分化和增殖率 ； 0030 （4） 改进了组培程序， 省略诱导生根的环节， 具体做。
29、法是把高度达 4 5 厘米的健 壮的芽苗从基部切下， 将芽苗基部切口在 30 50mg/L 的 NAA 溶液中浸泡后， 直接扦插入已 消毒的细沙中， 并施以 1/4MS 无机盐含量的培养基作养分 ； 所述改进可以减少综合生产成 本， 并提高了其性状的稳定性， 可实现育苗的工厂化大批量生产， 可有效解决山胡椒的优质 种苗的供应问题。 （四） 附图说明 0031 图 1 山 胡 椒 不 定 芽 在 未 添 加 谷 氨 酰 胺 的 芽 增 殖 培 养 基 （MS+6-BA1.5mg/ L+NAA0.1mg/L） 上生长 （20 天） 情况 ； 0032 图 2 山胡椒不定芽在添加谷氨酰胺 （100m。
30、g/L） 的芽增殖培养基 （MS+6-BA1.5mg/ L+NAA0.1mg/L） 上生长 （20 天） 情况 ； 0033 图 3 山胡椒不定芽在液体芽增殖培养基 （琼脂 0g/L） 上生长情况 ； 0034 图 4 山胡椒不定芽在半固体芽增殖培养基 （琼脂 6g/L） 上生长情况 ； 0035 图 5 山胡椒不定芽在固体芽增殖培养基 （琼脂 12g/L） 上生长情况。 （五） 具体实施方式 0036 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述， 但本发明的保护范围并不仅限于 此 ： 0037 本发明所述 MS 基本培养基包含大量元素、 微量元素、 铁盐、 有机物、 蔗糖和琼脂 粉 ： 所述大。
31、量元素组成是在配置 1 升 （1000 毫升） 培养基时， 加硝酸铵 (NH4NO3)1.65 克、 硝 酸钾 （KNO3） 1.9 克、 氯化钙 （CaCl22H2O） 0.44 克、 硫酸镁 （MgSO47H2O） 0.37 克、 磷酸二氢 钾 （KH2PO4） 0.17 克 ； 所述微量元素组成是在配置 1 升 （1000 毫升） 培养基时， 加碘化钾 （KI） 0.83 毫克、 硼酸 （H3BO3） 5.2 毫克、 硫酸锰 （MnSO44H2O） 22.3 毫克、 硫酸锌 （ZnSO47H2O） 3.6 毫克、 钼酸钠 （Na2MoO42H2O） 0.25 毫克、 硫酸铜 （CuSO4。
32、5H2O） 0.025 毫克、 氯化钴 （CoCl26H2O） 0.025 毫克 ； 所述铁盐元素组成是在配置 1 升 （1000 毫升） 培养基时， 加乙二 胺四乙酸二钠 （Na2EDTA） 37.3 毫克， 硫酸亚铁 （FeSO47H2O） 27.8 毫克 ； 所述有机物组成是 在配置 1 升 （1000 毫升） 培养基时， 加肌醇 100 毫克、 甘氨酸 2 毫克、 盐酸硫胺素 （VB1） 0.1 毫克， 盐酸吡哆醇 （VB6） 0.5 毫克， 烟酸 （VB5） 0.5 毫克 ； 蔗糖浓度是 20 40 克 / 升， 琼脂粉 浓度是 3 12g/L， 溶剂为水， pH 为 5.6 6.0。
33、。 0038 所述 1/4MS 无机盐含量的培养基终浓度组成为 ： NH4NO30.4125 克 / 升、 KNO30.475 克 / 升、 CaCl2 2H2O0.11 克 / 升、 MgSO4 7H2O0.0924 克 / 升、 KH2PO40.0425 克 / 升、 KI0.2075 毫 克 / 升、 H3BO31.3 毫 克 / 升、 MnSO44H2O5.575 毫 克 / 升、 ZnSO47H2O0.9 毫 克 / 升、 说 明 书 CN 102668980 B 6 5/10 页 7 Na2MoO42H2O0.0625 毫克 / 升、 CuSO45H2O0.00625 毫克 / 升。
34、、 CoCl26H2O0.00625 毫克 / 升、 Na2EDTA9.325 毫克 / 升、 FeSO47H2O6.95 毫克 / 升， 溶剂为水， pH 为 5.6 6.0。 0039 实施例 1 0040 （1） 野外选种 ： 选择浙江临安山胡椒基地中长势良好、 无病虫害的山胡椒。 0041 （2） 无菌材料的获得 ： 切取上述山胡椒幼嫩的腋芽， 用自来水冲洗 0.5h， 在体积浓 度为 1% 洗洁精 （传化洗洁精） （体积比 W/W） 的水溶液中振摇 2min， 无菌水冲净。在超净工 作台上用体积浓度 70% 乙醇水溶液浸泡 30s 进行表面灭菌， 然后用混合消毒液 100ml 消毒 。
35、20min( 所述混合消毒液是 99.5ml 的 84 消毒液与 0.5ml 的吐温 20 的混合液 )， 无菌水冲 洗3遍后， 将嫩芽分切成0.5cm的节段， 然后将节段接种到装有丛生芽诱导培养基的培养瓶 中， 盖上瓶盖并用封口膜封住瓶口， 置于培养箱中， 在 24， 光照 1500lx 条件下培养 15 天。 所述丛生芽诱导培养基为 MS 基本培养基添加 6-BA1.0mg/L 和 NAA0.1mg/L， MS 基本培养基 中蔗糖 20g/L、 琼脂粉 3g/L、 溶剂为水， pH5.6。 0042 （3） 芽的分化和增殖 ： 观察步骤 （1） 所述 24， 光照 1500lx 条件下培养。
36、 15 天后 的节段， 切口部位开始膨大， 出现绿色突起， 20 天后出现芽分生组织 （即不定芽） 。再培养 10 天， 当不定芽长到2cm时， 将不定芽切下转接到芽增殖培养基中在24， 光照1500lx条件下 进行增殖培养， 建立丛芽增殖体系， 获得丛生苗。 所述的芽增殖培养基为添加6-BA0.5mg/L、 NAA0.05mg/L、 谷氨酰胺 80mg/L 的 MS 基本培养基， MS 基本培养基中蔗糖 20g/L、 琼脂粉 3g/ L、 溶剂为水， pH5.6。 0043 （4） 壮苗培养 ： 将步骤 （3） 获得的丛生苗切割成单个， 转入壮苗培养基中， 分化苗 基本不发生分化， 而以较快。
37、速度加粗伸长生长， 在 24， 光照 1500lx 条件下培养 15 天， 发 育成 3cm 的健壮无根苗， 获得分化芽。所述壮苗培养基为添加 6-BA0.5mg/L、 NAA0.1mg/L 的 MS 基本培养基， MS 基本培养基中蔗糖 20g/L、 琼脂粉 3g/L、 溶剂为水， pH5.6。 0044 （5） 分化苗的生根 ： 将经壮苗培养的分化苗从基部切下， 将芽苗基部切口在 30mg/ L 的 NAA 水溶液中浸泡 20min， 然后直接扦插入已消毒的移栽基质中， 在移栽基质中施以 1/4MS 无机盐 （包含 MS 大量元素、 微量元素和铁盐） 含量的培养基作为养分， 扦插苗盖上薄 。
38、膜， 保持湿度 90% 以上， 置通风阴凉处。在 24、 光照 1500lx 条件下培养 10 天后分化苗平 均长出 3 条细根， 形成完整植株 , 最终的生根率为 90%。移栽基质按细沙 ： 腐殖土 ： 谷糠灰 的质量比为 5 ： 2 ： 2 配制。移栽基质的消毒方法采用体积浓度 0.5% 福尔马林水溶液均匀喷 洒基质， 塑料薄膜覆盖 3 天后揭开薄膜再曝晒基质 1 天进行消毒。 0045 实施例 2 不同的消毒剂对山胡椒外植体生长的影响 0046 分别用质量浓度10%的过氧化氢 （H2O2） 水溶液、 质量浓度0.1%的氯化汞 （HgCl2） 水 溶液及实施例 1 中的混合消毒液 ( 所述。
39、混合消毒液是 99.5ml 的 84 消毒液与 0.5ml 的吐温 20 的混合液 ) 对山胡椒的外植体材料 （即腋芽） 进行消毒， 其它操作同实施例 1。分别将节 段接种到装有丛生芽诱导培养基的培养瓶中， 封口膜封住瓶口后， 置于培养箱中。在 24， 光照1500lx条件下进行培养15天后， 观察统计不同消毒剂对山胡椒芽诱导和生长的影响， 结果见表 1 所示。结果表明， 混合消毒液和质量浓度 0.1%HgCl2的消毒效果基本相同， 质量 浓度 10% 的过氧化氢消毒效果稍差， 污染率达到 25%， 生长缓慢。但是质量浓度 0.1%HgCl2 消毒对芽的诱导有影响， 诱导率仅 88%， 而且外。
40、植体有发褐现象， 芽的生长也比较慢， 可能是 HgCl2毒害细胞对芽的诱导有一定的影响。而混合消毒液污染率仅达 15%， 但是芽诱导率高 说 明 书 CN 102668980 B 7 6/10 页 8 达98%， 并且外植体呈绿色， 出现芽点早， 生长较快。 说明混合消毒液对山胡椒外植体的消毒 和芽诱导效果最佳。 0047 表 1 不同的消毒剂对山胡椒外植体生长的影响 0048 0049 实施例 3 不同激素组合对山胡椒芽的诱导影响 0050 将山胡椒腋芽分别接种在添加了不同浓度 6-BA 和 NAA 的 MS 基本培养基 （即丛生 芽诱导培养基） 中， 其它操作同实施例 1， 山胡椒不定芽生。
41、长结果见表 2 所示。结果表明， 不 同激素组合的培养基均可以不同程度地影响芽的形成， 但是激素配比浓度过高和过低， 对 山胡椒芽的诱导均不利， 会出现黄白芽、 生根和玻璃化现象。其中以培养基 MS+6-BA2.0mg/ L+NAA0.3mg/L 对山胡椒芽的诱导为最好， 诱导出的再生芽最多， 芽绿色， 生长快， 芽大而健 壮， 无生根和玻璃化现象， 平均芽长 1.75cm， 芽诱导率达 100%。 0051 表 2 不同激素浓度对山胡椒芽的诱导影响 0052 0053 说 明 书 CN 102668980 B 8 7/10 页 9 0054 实施例 4 谷氨酰胺对山胡椒芽诱导和增殖的影响 0。
42、055 将山胡椒的不定芽分别接种到添加了不同浓度谷氨酰胺的芽增殖培养基中， 其它 操作同实施例 1， 获得丛生苗， 谷氨酰胺对山胡椒芽诱导和增殖的影响结果如表 3 所示。结 果发现， 山胡椒不定芽在未添加谷氨酰胺的芽增殖培养基中， 均呈现苗纤弱而小， 叶黄化， 增殖少， 生长慢的现象， 即使在优化的芽增殖培养基 MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.1mg/L 中， 未添 加谷氨酰胺， 增值率最高仅达 193% （见图 1） 。添加谷氨酰胺 80 100mg/L 均能促进山胡椒 芽的增殖， 其中谷氨酰胺的添加浓度 100mg/L 对芽增殖效果较好， 在优化的芽增殖培养基 MS+6-BA1.5。
43、mg/L+NAA0.1mg/L 中添加 100mg/L 的谷氨酰胺， 增值率可以达到 270%， 苗较大， 叶绿色， 健壮而且增殖多， 生长旺盛 （见图 2） 。 0056 表 3 谷氨酰胺对山胡椒芽诱导和增殖的影响 0057 说 明 书 CN 102668980 B 9 8/10 页 10 0058 实施例 5 不同浓度琼脂对山胡椒芽诱导和增殖的影响 0059 将山胡椒的不定芽分别接种到添加了不同浓度琼脂粉的芽增殖培养基中， 其它操 作同实施例 1， 观察在不同硬度的培养基中山胡椒的芽生长状况， 获得丛生苗， 结果见表 4 所示。结果表明， 在液体状态的芽增殖培养基 （琼脂浓度 0g/L） 。
44、中芽增殖率仅达 200%， 并且 苗纤弱， 有黄化现象， 苗生长不整齐 （见图 3） 。固体状态的芽增殖培养基 （琼脂浓度 9g/L、 12g/L） ， 因为培养基太硬的缘故， 造成分化苗发黄白色， 生长较慢， 其中琼脂浓度 12g/L 的 培养基对山胡椒芽增殖率仅达到 210%（见图 5） 。半固体状态 （琼脂浓度 6g/L） 对山胡椒的 芽增殖较好， 芽增殖率达到 290%， 并且苗健壮而整齐 （见图 4） 。 0060 表 4 不同浓度琼脂对山胡椒芽诱导和增殖的影响 说 明 书 CN 102668980 B 10 9/10 页 11 0061 0062 实施例 6 0063 （1） 野外。
45、选种， 选择浙江临安山胡椒基地中长势良好、 无病虫害的山胡椒。 0064 （2） 无菌材料的获得 ： 切取上述山胡椒幼嫩的腋芽， 用自来水冲洗 1h， 在体积浓 度 1% 洗洁精 （传化洗洁精） （体积比 W/W） 的水溶液中振摇 3min， 无菌水冲净。在超净工作 台上用体积浓度 75% 乙醇水溶液浸泡 40s 进行表面灭菌， 然后用 100ml 的混合消毒液消毒 25min， 所述混合消毒液为 99.5ml 的 84 消毒液与 0.5ml 的吐温 20 的混合液， 无菌水冲洗 4 遍后， 将嫩芽分切成 1cm 的节段， 然后将节段接种到装有丛生芽诱导培养基的培养瓶中， 封 口膜封住瓶口后，。
46、 置于培养箱中， 在 25， 光照 2000lx 条件下培养 20 天 ； 所述丛生芽诱导 培养基为 MS 基本培养基添加 6-BA2.0mg/L 和 NAA0.3mg/L， MS 基本培养基中蔗糖 30g/L、 琼 脂粉 6g/L、 溶剂为水， pH5.8。 0065 （3） 芽的分化和增殖 ： 观察步骤 （2） 所述 25， 光照 2000lx 条件下培养 20 天后 的节段， 切口部位开始膨大， 出现绿色突起， 30 天后出现芽分生组织 （即不定芽） ， 再培养 15 天， 当不定芽长到3cm时， 将不定芽切下转接到芽增殖培养基中在25， 光照2000lx条件下 进行增殖培养， 建立丛芽。
47、增殖体系， 获得丛生苗 ； 所述的芽增殖培养基为添加 6-BA1.5mg/ L、 NAA0.1mg/L、 谷氨酰胺 100mg/L 的 MS 基本培养基， MS 基本培养基中蔗糖 30g/L、 琼脂粉 6g/L、 溶剂为水， pH5.8。 0066 （4） 壮苗培养 ： 将丛生苗切割成单个， 转入壮苗培养基中， 分化苗基本不发生分化， 而以较快速度加粗伸长生长， 在 25， 光照 2000lx 条件下培养 20 天， 发育成 4cm 的健壮无 根苗， 获得分化芽 ； 所述壮苗培养基为添加 6-BA1.0mg/L、 NAA0.2mg/L 的 MS 基本培养基， MS 基本培养基中蔗糖 30g/L。
48、、 琼脂粉 6g/L、 溶剂为水， pH5.8。 0067 （5） 分化苗的生根 ： 将经壮苗培养的分化苗从基部切下， 将芽苗基部切口在 40mg/ L 的 NAA 水溶液中浸泡 30min， 然后直接扦插入已消毒的移栽基质中， 再在移栽基质中施以 1/4MS 无机盐 （包含 MS 大量元素、 微量元素和铁盐） 的培养基作为养分， 扦插苗盖上薄膜， 保 持湿度 90% 以上， 置通风阴凉处， 在 25、 光照 2000lx 条件下培养 15 天后长出 5 条细根， 形成完整植株， 最终的生根率为 92%。所述移栽基质为细沙、 腐殖土与谷糠灰按照质量比 5 ： 2 ： 2 的比例配置而成， 所述移栽基质的消毒方法为 ： 采用体积浓度 0.5% 福尔马林水溶液均 说 明 书 CN 102668980 B 11 10/10 页 12 匀喷洒基质， 塑料薄膜覆盖 4 天后揭开薄膜再曝晒基质 2 天， 完成对移栽基质的消毒。 0068 实施例 7 0069 （1） 野外选种， 选择浙江临安山胡椒基地中长势良好、 无病虫害的山胡椒。 0070 （2） 无菌材料的获得 ： 切取上述山胡椒幼嫩的腋。