《黄精多糖在制备具有辅助抑制结肠癌功效的功能食品中的应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《黄精多糖在制备具有辅助抑制结肠癌功效的功能食品中的应用.pdf（10页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410274076.3 (22)申请日 2014.06.19 A23L 29/30(2016.01) C08B 37/00(2006.01) (73)专利权人 无限极 （中国） 有限公司 地址 529156 广东省江门市新会区会城镇七 堡工贸城北区三号 (72)发明人 梁明 王培培 马方励 胡明华 (74)专利代理机构 广州知友专利商标代理有限 公司 44104 代理人 李海波 CN 101837091 A,2010.09.22, CN 103638352 A,2014.03.19, 孙晓娟 . 黄精、 巴戟天、 白芷有效成分体外抗。
2、 肿瘤作用的研究 .中国优秀硕士学位论文 医药 卫生科技辑 .2012, 第 2 页第 2.1.1 小节、 第 4 页 第 2.4.3 小节、 第 5 页第 4 节 . (54) 发明名称 黄精多糖在制备具有辅助抑制结肠癌功效的 功能食品中的应用 (57) 摘要 本发明公开了黄精多糖在制备具有辅助抑制 结肠癌功效的功能食品中的应用， 其中黄精多糖 优选通过以下方法制备获得 ： 以黄精为原料， 经 含沸水提取、 去蛋白、 透析和乙醇处理工序制备获 得， 所述的黄精多糖具有调节肿瘤微环境的作用， 本发明中的黄精多糖可以通过抑制肿瘤新生血管 生成、 免疫抑制、 抗氧化及抑制结肠癌成纤维细胞 生长等多。
3、途径调节肿瘤微环境， 表明其具有良好 的辅助抑制结肠癌肿瘤作用。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 曾舟 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 104106763 B 2016.06.01 CN 104106763 B 1.黄精多糖作为唯一具有辅助抑制结肠癌功效的活性成分在制备具有辅助抑制结肠 癌功效的功能食品中的应用； 所述的黄精多糖具体通过以下方法制备获得： 以黄精为原料， 用沸水多次提取后， 合并 提取液， 将提取液浓缩得浓缩液， 在浓缩液中加入三氯乙酸水溶液进行去蛋白处理， 去蛋白 后将反应液进行中和、 扎袋。
4、透析处理， 将透析袋内反应液进行浓缩、 离心处理， 取上清液加 入乙醇进行醇沉、 干燥处理， 即得黄精多糖； 透析时透析袋的截留分子量为3500Da。 2.根据权利要求1所述的黄精多糖作为唯一具有辅助抑制结肠癌功效的活性成分在制 备具有辅助抑制结肠癌功效的功能食品中的应用， 其特征是： 所述的辅助抑制结肠癌功效 是指通过抑制结肠癌肿瘤新生血管生成、 免疫抑制、 抗氧化及抑制结肠癌成纤维细胞生长 功效， 调节结肠癌肿瘤微环境， 从而起到辅助抑制结肠癌功效。 3.根据权利要求1所述的黄精多糖作为唯一具有辅助抑制结肠癌功效的活性成分在制 备具有辅助抑制结肠癌功效的功能食品中的应用， 其特征是： 沸水。
5、提取时， 提取次数为1 5 次， 每次提取时沸水的用量为黄精总质量的520 倍， 每次提取时间为1.55 h。 4.根据权利要求1所述的黄精多糖作为唯一具有辅助抑制结肠癌功效的活性成分在制 备具有辅助抑制结肠癌功效的功能食品中的应用， 其特征是： 去蛋白时采用三氯乙酸水溶 液， 所述三氯乙酸水溶液的质量百分含量为35%， 处理时间为36 h。 5.根据权利要求1所述的黄精多糖作为唯一具有辅助抑制结肠癌功效的活性成分在制 备具有辅助抑制结肠癌功效的功能食品中的应用， 其特征是： 乙醇处理时采用体积百分含 量为7095% 的乙醇水溶液。 6.根据权利要求1所述的黄精多糖作为唯一具有辅助抑制结肠癌功。
6、效的活性成分在制 备具有辅助抑制结肠癌功效的功能食品中的应用， 其特征是： 所述功能食品的剂型为胶囊 型、 片剂、 粉剂、 颗粒剂或口服液。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104106763 B 2 黄精多糖在制备具有辅助抑制结肠癌功效的功能食品中的 应用 技术领域 0001 本发明属于多糖技术领域， 具体涉及一种黄精多糖在制备具有辅助抑制结肠癌功 效的功能食品中的应用。 背景技术 0002 恶性肿瘤是当前危害人类健康的严重疾病， 化学治疗是应用于恶性肿瘤全身治疗 的主要方法之一， 但大部分抗肿瘤化学药物在杀死肿瘤细胞的同时， 也严重损伤了正常细 胞， 因此寻找高效低毒的抗肿瘤药物。
7、具有重要意义。 而近年来的研究发现， 多糖就具有显著 地抗肿瘤活性并且对人体的毒副作用相对较小， 对多糖的生物活性研究在医学领域已经成 为国内外专家学者研究的热点。 近年发现一些多糖及其复合物对多种疾病， 如免疫紊乱、 癌 症、 糖尿病、 高血压、 肝炎、 血栓、 肺炎、 病毒等都具有显著疗效， 并且参与细胞各种生命现象 的调节。 大量药理和临床试验表明多糖类化合物是优良的免疫调节剂， 能增加巨噬细胞和 白细胞的吞噬功能、 诱导产生细胞坏死因子 （TNF） 和白细胞素， 从而提高人体的免疫功能， 并且对正常细胞几乎无毒副作用。 0003 黄精是一种常用中药， 黄精以根茎入药。 具有补气养阴， 。
8、健脾， 润肺， 益肾功能， 用 于治疗脾胃虚弱， 体倦乏力， 口干食少， 肺虚燥咳， 精血不足， 内热消渴等症， 目前尚无以黄 精为原料制备多糖， 并用于一种辅助抑制结肠癌方面的产品开发。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供黄精多糖在制备具有辅助抑制结肠癌功效的功能食品中 的应用。 0005 其中所述的辅助抑制结肠癌功效是指通过抑制肿瘤新生血管生成、 免疫抑制、 抗 氧化及抑制结肠癌成纤维细胞生长等作用调节肿瘤微环境， 达到辅助抑制结肠癌肿瘤的功 效。 0006 作为本发明的一种实施方式， 本发明中的黄精多糖优选通过以下方法制备获得： 以黄精为原料， 经含沸水提取、 去蛋白、 透析和乙醇。
9、处理工序制备获得， 所述的黄精多糖具 有调节肿瘤微环境的作用。 0007 作为本发明的一种优选的实施方式， 本发明所述的黄精多糖具体通过以下方法制 备获得： 以黄精为原料， 用沸水多次提取后， 合并提取液， 将提取液浓缩得浓缩液， 在浓缩液 中加入三氯乙酸水溶液进行去蛋白处理， 去蛋白后将反应液进行中和、 扎袋透析处理， 将透 析袋内反应液进行浓缩、 离心处理， 取上清液加入乙醇进行醇沉、 干燥处理， 即得黄精多糖。 0008 本发明在黄精多糖的制备过程中， 各工序的具体参数优选如下： 0009 沸水提取时， 提取次数为1 5 次， 每次提取时沸水的用量为黄精总质量的520 倍， 每次提取时间。
10、为1.55 h。 0010 沸水提取时， 沸水的用量优选为黄精总质量的520 倍， 提取次数较佳为3 次， 其 说 明 书 1/5 页 3 CN 104106763 B 3 中第一次提取时， 沸水的用量优选为原料黄精总质量的1020 倍， 提取25 h； 第二次提取 时， 沸水的用量优选为原料黄精总质量的1020 倍， 提取1.5 5h； 第三次提取时， 沸水的用 量优选为原料黄精总质量的1020倍， 提取1.5 5 h。 0011 将提取液优选浓缩至原提取液总体积的约1/10得浓缩液。 0012 本发明所述的三氯乙酸水溶液的质量百分含量优选为35%， 去蛋白处理时间优选 为36 h， 三氯乙。
11、酸水溶液的体积优选与浓缩液的体积相同。 0013 中和处理时可以采用质量百分含量为10%的氢氧化钠水溶液。 0014 扎袋透析处理时优选采用截留分子量3500Da的透析袋进行透析处理。 0015 乙醇进行醇沉处理时优选采用体积百分含量优选为70 95%的乙醇水溶液。 0016 浓缩可以采用多种现有技术中的浓缩方式， 其中以真空浓缩最佳。 真空浓缩时温 度优选为40。 0017 本发明中的黄精多糖， 可以直接口服， 也可以制成药剂学上所说的多种剂型， 如胶 囊型、 片剂、 粉剂、 颗粒剂或口服液等， 食用后具有辅助抑制结肠癌肿瘤的功效。 0018 因此， 本发明所述功能食品的剂型优选为胶囊型、 。
12、片剂、 粉剂、 颗粒剂或口服液等。 0019 与现有技术相比， 本发明具有如下优点： 0020 （1） 本发明中的黄精多糖， 其纯度和活性高， 可以通过抑制肿瘤新生血管生成、 免 疫抑制、 抗氧化及抑制结肠癌成纤维细胞生长等多途径调节肿瘤微环境， 其具有良好的辅 助抑制结肠癌肿瘤作用； 0021 （2） 本发明中的黄精多糖的制备方法， 工艺简单稳定高效， 适合工业化生产， 成本 低； 0022 （3） 本发明中的黄精多糖， 可以用于制备具有辅助抑制结肠癌肿瘤功效的功能食 品。 附图说明 0023 图1是本发明实施例4中黄精多糖可抑制BMP2诱导的带有BRE报告基因的荧光素酶 的活性； 0024。
13、 图2是本发明实施例5中黄精多糖可抑制TGF 诱导的带有SMAD2/3/4报告基因活 性； 0025 图3是本发明实施例6中黄精多糖可抑制带有NF- B报告基因的荧光素酶的活性； 0026 图 4是本发明实施例7中黄精多糖可抑制Cocl2诱导的带有HRE报告基因的荧光素 酶的活性； 0027 图5 是是本发明实施例8黄精多糖可抑制结肠癌成纤维细胞生长。 具体实施方式 0028 下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明， 但不以任何形式限制本发明。 0029 以下实施例中采用的各原料， 如无特殊说明， 均为市售产品。 0030 实施例1 0031 本实施例中的黄精多糖， 通过以下方法制备获得： 。
14、取黄精原料， 采用沸水提取， 第 一次提取时， 水的用量为原料总质量的20倍， 煮沸5 h过滤 ； 第二次提取时， 水的用量为原 说 明 书 2/5 页 4 CN 104106763 B 4 料总质量的20倍， 煮沸3 h过滤； 第三次提取时， 水的用量为原料总质量的10倍， 煮沸2 h过 滤， 合并滤液， 真空浓缩至原来体积的大约1/10， 下同。 将浓缩液进行三氯乙酸除蛋白处理， 加入同体积 （下同） 的30%三氯乙酸(质量百分比)， 处理时间为4 h后， 用 10% NaOH （质量百 分比） 中和， 下同， 中和后将反应液置于透析袋中扎袋透析， 透析时透析袋的截留分子量通 常约为350。
15、0Da， 下同， 然后将透析袋内液浓缩， 离心， 取上清液加入34倍体积的85%乙醇水 溶液 （体积百分含量） 进行醇沉淀处理， 取沉淀物经含真空干燥 （约40， 下同） 处理得黄精 多糖组分。 0032 实施例2 0033 本实施例中的黄精多糖， 通过以下方法制备获得： 取黄精原料， 采用沸水提取， 第 一次提取时， 水的用量为黄精原料总质量的15倍， 煮沸5 h过滤 ； 第二次提取时， 水的用量 为黄精原料总质量的15倍， 煮沸3 h过滤； 第三次提取时， 水的用量为黄精原料总质量的10 倍， 煮沸3 h过滤， 合并滤液， 真空浓缩。 将浓缩液进行三氯乙酸除蛋白处理， 加入同体积的 25%。
16、三氯乙酸(质量百分比)， 处理时间为3 h后， 用 10% NaOH （质量百分比） 中和， 中和后将 反应液置于透析袋中扎袋透析， 然后将透析袋内液浓缩， 离心， 取上清液加入34倍体积的 70%乙醇水溶液 （体积百分含量） 进行醇沉淀处理， 取沉淀物经含真空干燥处理得黄精多糖 组分。 0034 实施例3 0035 本实施例中的黄精多糖， 通过以下方法制备获得： 取黄精原料， 采用沸水提取， 第 一次提取时， 水的用量为黄精原料总质量的10倍， 煮沸3 h过滤 ； 第二次提取时， 水的用量 为黄精原料总质量的20 倍， 煮沸3 过滤h； 第三次提取时， 水的用量为黄精原料总质量的10 倍， 。
17、煮沸5 h过滤， 合并滤液， 真空浓缩， 将浓缩液进行三氯乙酸除蛋白处理， 加入同体积的 15%三氯乙酸(质量百分比)， 处理时间为5 h后， 用 10% NaOH （质量百分比） 中和， 中和后将 反应液置于透析袋中扎袋透析， 然后将透析袋内液浓缩， 离心， 取上清液加入34倍体积的 95%乙醇水溶液 （体积百分含量） 进行醇沉淀处理， 取沉淀物经含真空干燥处理得黄精多糖 组分。 0036 实施例4 黄精多糖可抑制BMP2诱导的带有BRE报告基因的荧光素酶的活性 0037 C2C12细胞株购自中科院细胞库， C2C12- pGF1-BRE细胞株由中国科学院上海药物 研究所丁侃实验室构建， 保。
18、存于液氮中。 C2C12- pGF1-BRE细胞用含10 % Gibco胎牛血清 DMEM 培养基培养， 置于37饱和湿度、 含5% CO2的恒温箱中培养， 以1104细胞/孔的密度 接种于96孔板内， 每孔100 L 。 贴壁24 h后吸去60 L培养基， 加配置好相应浓度的样品50 mL(实施例1中的黄精多糖)， 终浓度分别为0.5 mg/mL、 0.1 mg/mL、 0.02 mg/mL， 10 LBMP2 调整至终浓度200 ng/mL。 同时设空白组和BMP2组对照。 给药16 h后吸去培养基， 加20 L Reporter Lysis 1X Buffer， 将溶解的细胞裂解液20 。
19、L转移至白板， 加入40 L luciferase底物， 于3分钟内读板， 读取RLU值。 采用SPSS 统计软件进行统计学处理。 数据均 以均数标准差( .x s) 表示， 两组间比较采用独立样本t 检验， 多组间比较采用单因素 方差分析。 0038 实验结果如图1所示， 黄精多糖在0.1mg/mL低浓度下具有抑制BMP2诱导的带有BRE 报告基因的荧光素酶的活性， 且该活性随多糖浓度增加而显著增加， 表明该多糖在该活性 方面具有剂量依赖性。 已知肿瘤新生血管生成在肿瘤的发生发展过程中起着关键作用， 而 说 明 书 3/5 页 5 CN 104106763 B 5 BMP2信号通路在肿瘤新生。
20、血管生成过程中起关键作用。 该多糖可显著抑制BMP2信号通路， 表明该多糖具有潜在的调节肿瘤微环境功效。 0039 实施例5黄精多糖可抑制TGF 诱导的带有SMAD2/3/4报告基因活性 0040 HEK293T细胞株购自中科院细胞库， HEK293T-pGF1-SMAD2/3/4细胞株由中国科学 院上海药物研究所丁侃实验室构建， 保存于液氮中。 HEK293T-pGF1-SMAD2/3/4细胞用含10% Gibco胎牛血清DMEM 培养基培养， 置于37饱和湿度、 含5% CO2的恒温箱中培养， 以2104 细胞/孔的密度接种于96孔板内， 每孔100 L。 贴壁24 h后吸去60 L培养基。
21、， 加配置好相应 浓度的样品50 mL(实施例1中的黄精多糖)， 终浓度分别为0.5 mg/mL、 0.1 mg/mL、 0.02 mg/ mL， 10 LTGF 1调整至终浓度50 ng/mL。 同时设空白组和TGF 1组对照。 给药16hr后吸去培 养基， 加20 L Reporter Lysis 1X Buffer， 将溶解的细胞裂解液20 L转移至白板， 加入 40 L luciferase底物， 于3分钟内读板， 读取RLU值。 采用SPSS 统计软件进行统计学处理。 数据均以均数标准差( .x s) 表示， 两组间比较采用独立样本t 检验， 多组间比较采用 单因素方差分析。 004。
22、1 实验结果如图2所示， 黄精多糖在0.5 mg/mL低浓度下具有抑制TGF 诱导的带有 SMAD2/3/4信号通路， 且该活性随黄精多糖浓度增加而显著增加， 表明该多糖在该活性方面 具有剂量依赖性。 已知肿瘤新生血管生成在肿瘤的发生发展过程中起着关键作用， 而TGF 诱导的SMAD2/3/4信号通路在肿瘤新生血管生成过程中起关键作用。 该多糖可显著抑制该 信号通路， 表明该多糖具有潜在的调节肿瘤微环境功效。 0042 实施例6 黄精多糖能抑制带有NF- B报告基因的荧光素酶的活性 0043 THP-1细胞株购自中科院细胞库， THP-1/pGF1-NF- B细胞株由中国科学院上海药 物研究所。
23、丁侃实验室构建， 保存于液氮中。 THP-1/pGF1-NF- B细胞用含10%胎牛血清RPMI- 1640培养基培养。 置于37 饱和湿度、 含5% CO2的恒温箱中培养， 以5104细胞/孔的密度 接种于96孔板内， 每孔50 L容积。 加入受试样品50 L （实施例1中的黄精多糖） ， 终浓度分 别为0.5 mg/mL、 0. L mg/mL、 0.02 mg/mL， 同时设立空白组和LPS对照组。 加入LPS溶液10 L， 终浓度为1 g/mL， 置于37饱和湿度、 含5% CO2的恒温箱中培养过夜。 培养过夜后， 每空 加入100 L Bright-GloTM Luciferase 。
24、Assay System底物， 于酶标仪读板， 读取RLU值。 0044 0045 采用SPSS 统计软件进行统计学处理。 数据均以均数标准差( .x s) 表示， 两 组间比较采用独立样本t 检验， 多组间比较采用单因素方差分析。 0046 实验结果如图3所示， 该多糖在0.5 mg/mL低浓度下具有较好的抑制NF- B信号通 路的活性。 已知NF- B是参与一系列基因表达调控的关键性核转录因子， 其在癌症的起源、 发展、 血管新生及转移中具有重要作用， 并与癌症耐药性的产生密切相关。 NF- B激活后通 过不同的途径参与这些过程， 而阻断NF- B的作用可抑制癌症的发生。 因此， 该多糖可。
25、通过 抑制NF- B信号通路， 从而发挥潜在的抑制肿瘤活性。 0047 实施例7 黄精多糖能抑制Cocl2诱导的带有HRE报告基因的荧光素酶的活性 0048 HEK293T细胞株购自中科院细胞库， HEK293T-pGF1-HRE细胞株由中科院上海药物 所丁侃实验室构建， 保存于液氮中， 用含10% Gibco胎牛血清DMEM 培养基培养。 HEK293T- pGF1-HRE细胞以2104细胞/孔的密度接种于96孔板内， 每孔100 L。 贴壁24 h后吸去60 说 明 书 4/5 页 6 CN 104106763 B 6 L培养基， 加配置好相应浓度的样品 （实施例1中的黄精多糖） 50L，。
26、 终浓度分别为0.5mg/mL、 0.1mg/mL、 0.02 mg/mL， 10L Cocl2调整至终浓度250 M。 同时设空白组和Cocl2组对照。 给 药16 h后吸去培养基， 加20L Reporter Lysis 1X Buffer， 于-80冰箱冻存至读板。 从- 80冰箱移出待检测板， 将溶解的细胞裂解液20L转移至白板， 加入40 Lluciferase底 物， 于3分钟内读板， 读取RLU值。 采用SPSS 统计软件进行统计学处理。 数据均以均数标准 差( .x s) 表示,两组间比较采用独立样本t 检验， 多组间比较采用单因素方差分析。 0049 黄精多糖活性测定结果如图。
27、4所示， 黄精多糖在0.5 mg/mL的浓度下可能抑制 Cocl2诱导的带有HRE报告基因的荧光素酶的活性， 证明其具有潜质的抗氧化活性。 0050 实施例8 黄精多糖能抑制结肠癌成纤维细胞生长 0051 结肠癌相关成纤维细胞系CT26-CAF由中国科学院生物物理研究所构建。 将细胞接 种于96孔板， 细胞密度为1104/孔。 将实施例1中的黄精多糖溶于DMEM+/+培养基中， 使其 浓度为1.0 mg/mL。 培养4天， 采用CCK检测试剂盒 （北京庄盟生物公司） 测定细胞生长状态。 每种多糖样本量为3。 0052 统计学分析： 计量数据多组间比较采用方差分析， 首先对数据进行方差齐性检验，。
28、 计算Levene统计值， 若方差齐， 则进行组间多重比较， 方法为LSD和Dunnett， 若方差不齐， 则 采用校正方法Dunnett t。 统计软件为SPSS17.0， 显著性水平为 =0.05。 0053 实验结果如图5所示， 该黄精多糖在0.5 mg/mL的浓度下可显著抑制结肠癌CT26- CAF的生长。 CT26-CAF在结肠癌起着重要调控作用， 可促进结肠癌细胞的生长。 该多糖可通 过抑制结肠癌CT26-CAF的生长， 起到调节结肠癌微环境的功效。 0054 综上实验证明本发明中的黄精多糖可通过抑制肿瘤新生血管生成、 免疫抑制、 抗 氧化及抑制结肠癌成纤维细胞生长等多途径调节肿瘤。
29、微环境， 并进一步发挥潜在的抗结肠 癌肿瘤活性， 从而可以将黄精多糖通过常规工艺， 制成药剂学上所说的多种剂型， 用于制备 具有辅助抑制结肠癌功效的功能食品， 功能食品的剂型可以为胶囊型、 片剂、 粉剂、 颗粒剂 或口服液等。 0055 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围。 说 明 书 5/5 页 7 CN 104106763 B 7 图1 图2 说 明 书 附 图 1/3 页 8 CN 104106763 B 8 图3 图4 说 明 书 附 图 2/3 页 9 CN 104106763 B 9 图5 说 明 书 附 图 3/3 页 10 CN 104106763 B 10 。