技术领域
本发明涉及使用包含气体微泡、乳液微滴及其簇(cluster)的双相微 粒系统的超声(ultrasound，US)介导的治疗剂递送，例如药物、基因、 纳米颗粒或放射性同位素的递送。因此，本发明涉及簇组合物(cluster composition)和药物组合物及其用于递送治疗剂和作为用于超声成像之 造影剂(contrastagent)的用途。本发明还涉及用于递送这样的治疗剂的 方法以及所述组合物的用途。
背景技术
成功的药物治疗的前提条件是药物到达其靶病理部位(pathology) 且对健康组织的毒性有限。然而，一些药物显示出严重限制其临床效用的 低治疗指数。在过去几十年中，制药工业通过用于靶向/定位药物递送(应 用例如纳米颗粒、微泡或脂质体平台)的多种方法，已经花了相当多的资 源来试图解决这一难题。通过向所涉病理部位或器官定位递送药物，使全 身性暴露尽可能小(降低了毒性)，并且使局部浓度提高，并因此使效力 提高。
尽管付出了显著的努力，但是在临床医学中的受控药物递送基本上仍 没有得到解决。近年来，研究与开发已特别关注外部的活化药物递送系统。 热、光、超声、电场和磁场已被用作用于活化体内药物制剂系统以使药物 在体内靶位置释放和递送的外部能源。关于最近的综述，参见Timko等 [B.P.Timko等，Remotelytriggerabledrugdeliverysystems，Adv.Mater. 22(2010)4925-4943]。
在过去二十年中，已经对使用超声的药物递送越来越感兴趣。关于最 近的综述，参见Castle等[Castle等，AmJPhysiolHeartCircPhysiol， 2013年2月1日，304：H350-H357]。许多方法都是基于类似于那些用作 医疗成像应用的超声造影剂的微泡的用途，用于释放并入的或附接的药物 和/或用于增强全身性(共)施用之药物的摄取。
微泡具有通过例如声孔效应(sonoporation)等机制改变组织和细胞 膜结构的潜能，因此，增强了所释放或共施用的药物向靶组织的外渗。应 用超声使得存在于微循环中的微泡振荡并诱导提高脉管系统局部渗透性 的公认机制，使得药物加速扩散进入组织间隙中[O`Neill，BE和Li，KC， Int.J.Hyperthermia，2008年9月；24(6)：506-520]。已知几种机制诱导 这样的生物效应，所述机制包括声孔效应和用于胞内递送的内吞作用、内 皮的破坏和/或开口增大/开窗孔(fenestrationpore)(可逆的)修饰或血 管内皮的改变，或增强运输和扩散的其他机制，例如辐射力和微流。机制 的相对重要性和确切性质以及与超声剂量学的关系需要进一步研究和阐 明。也推动近期的工作来解决跨血脑屏障的药物递送和递送至实体瘤的问 题。血脑屏障的特征在于抑制较大的分子通过到达组织间隙的紧密血管内 皮连接。通常肿瘤脉管系统更易“漏”，但是会受到可阻止药物通过肿瘤 块的较高的间质液压和胶体渗透压的影响。根据肿瘤的类型，确定的化疗 剂的摄取可高度可变并且这种摄取差异可导致治疗效果的可变性。虽然已 清楚地证明了体内微泡介导的递送机制，但是仍然存在提高方法安全性问 题的相关生物效应。所有的可能性均涉及微泡空化(cavitation)机制， 并且特别是已观察到了微出血和不可逆的血管损伤。对于解决应用到血脑 屏障的技术，也存在与递送足够的超声能量至目的病理区域相关的问题， 特别是在如果覆盖的颅骨保持完整且不被取出的情况下。
超声/微泡介导的药物递送的最基本形式是微泡制剂与全身性施用的 药物一起施用(例如增强靶病理部位的摄取)。此类方法的一个实例最近 已经进入临床试验[Kotopoulis等，MedPhys.，40(7)(2013)]，其中，对于 胰腺癌的治疗，商用US造影剂Sonovue(BraccoSpa.)与吉西他滨共施 用，接着进行US辐照。
除了共施用的方法，开发了三大类微泡技术用于药物递送[Geers等， JournalofControlledRelease164(2012)248-255]：(1)载药微泡；(2)由 纳米液滴原位形成的微泡；及(3)靶向微泡(例如，具有用于靶向细胞 表面受体的附接配体的微泡)。然而，多年来，人们已经认识到所有这些 方法都有根本的局限性，这有效地阻碍了向临床实践的转变。最大的限制 可能是可并入微泡系统的药物的量。薄的稳定化壳或膜运载有限的用于药 物装载的体积，并且已经估计为了获得普通化疗药物的治疗剂量，需要数 升的常规US造影剂[Geers等，JournalofControlledRelease164(2012) 248-255]。此外，对于将所述药物载荷附接和/或并入微泡系统，可需要对 药物进行化学修饰，这潜在地改变生物学活性。
微泡也是自由流动血的示踪剂，它们一旦被引爆就释放其有效载荷 (payload)，药物将立即开始随血液流动而洗出。正如所指出的，更基本 的微泡方法包括与常规的药物制剂共注射。虽然这样的概念没有低药物载 荷的限制，但是微泡是微米尺寸的，并因此保留在血管空间中，因此生物 效应(例如用于促进增强摄取的声孔效应)将局限于血管内皮。此外，微 泡较小，并且通常不与血管壁接触，这限制了用于增强药物摄取的生物效 应的程度和范围。
另一种不同的方法使用纳米乳液技术。已经描述了声微滴蒸发 (acousticmicrodropletvaporisation，ADV)技术被用于许多应用，包括 药物递送和栓塞治疗[Stanley，S.等，Microcirculation19：501-509(2012)， Reznik，N.，Phys.Med.Biol.57(2012)7205-7217]。这些微滴足够小(通常 小于200nm)从而可通过增强渗透性和保留(enhancedpermeabilityand retention，EPR)效应从(肿瘤)血管中渗出，并且具有克服载药微泡循 环时间短的优点。通过超声辐照装置可诱导其在体内汽化(液相到气相的 转变，即，相转变(phaseshift))。然而，这些纳米微滴的缺点是需要非 常高的声功率来促进纳米微滴中的油相转变为气相，并提供气体微泡。在 医学US中，通常通过“机械指数”(mechanicalindex，MI)描述声功率。 该参数被定义为在超声场中的峰值负压(peaknegativepressure，PNP) (额定为0.3dB/cm/MHz)除以超声场的中心频率(Fc)(以MHz计)的 平方根[AmericanInstituteofUltrasoundinMedicine.AcousticOutput MeasurementStandardforDiagnosticUltrasoundEquipment.第1版.第2 版.Laurel，MD：AmericanInstituteofUltrasoundinMedicine；1998， 2003]。
M I = P N P F C . ]]>
医学US成像过程中的监管要求是使用低于1.9的MI。在用微泡造 影剂进行US成像中，推荐使用低于0.7的MI以避免有害的生物效应， 例如微出血和不可逆的血管损伤，并且认为使用低于0.4的MI是“最佳 实践”[Miller等，JUltrasoundMed2008；27：611-632，AIUMConsensus ReportonPotentialBioeffectsofDiagnosticUltrasound]。
对于ADV，通常来说，在3.5MHz需要施加MI＞4以促进油有效的 相转变，这些功率远高于医学超声成像的监管要求(MI＜1.9)且远高于 推荐的MI＜0.7MI，并带来提高方法的安全性问题的显著相关的生物效 应，特别是微出血和不可逆的血管损伤。此外，它们倾向于在相转变事件 后几乎立即重新浓缩为微滴；因此，用于改善药物生物利用度的潜在声孔 效应机制是有限的。
在一定程度上，靶向微泡可改善药物递送至靶病理部位的特异性和/ 或声孔作用生物效应的程度，但是技术是复杂的，并且同样，这些努力已 出现有限的成功和向临床用途的转变。
也已经提出了作为本发明现有技术的上所述方法的替代方法。注意， 在下面给出的现有技术的简要综述中，保留了这些专利中所使用的术语。 这可能与本发明中所使用的并在6至7页中详述的定义略有偏离。
WO98/17324，“Improvementsinorrelatingtocontrastagents”，提 出了组合制剂，其包含1)微泡组分和2)“可扩散组分”，例如，以水包 油乳液的形式，所述“可扩散组分”在体内能够扩散进入微泡组分中，暂 时增大其尺寸。简言之，该专利教导了超声的应用，在共施用这两种组分 后，活化双相(气体/液体)系统，接着可扩散组分从液体向气体相转变 并产生暂时截留在微脉管系统中的大的相转变气泡，因此可用作沉积示踪 剂、US造影剂。对于可扩散组分，该专利教导了使用基本不溶于水和不 与水混溶的油并且其在体温下作为气体存在或显示出显著的蒸汽压。WO 98/17324指出使用所提出的系统通过将治疗组分附接至微泡组分而用于 药物递送的可能性。该专利还指出在同时施用之前混合两种组分的可能 性，但指出随后通常需要在高压或低温下储存所述混合物以避免微泡在施 用前的自发生长。
WO98/51284，“Novelacousticallyactivedrugdeliverysystems”，提 出了治疗递送系统，其包含微泡，其中气泡包含油、表面活性剂和溶解于 油层的治疗剂。简言之，该专利教导了超声的应用，在施用后，将会破坏 微泡并诱导其药物载荷的定位释放。它也教导了优选使用熔点在-20℃至 42℃之间的油。油组分作为治疗剂的载体(溶剂)而存在，并且具有所讨 论的熔点范围，这些油不用作如WO198/17324中所教导的“可扩散组分”。
WO99/53963“Improvementsinorrelatingtocontrastagents”进一 步建立在WO98/17324中详述的发明的基础上。简言之，该专利教导了 如果将两种组分配制成使微泡和可扩散组分对彼此有亲和力(例如由于吸 引的静电力)，那么WO98/17324中所公开类型的制剂的效力可被大幅提 高。WO99/53963还指出使用所提出的系统通过将治疗组分附接至微泡组 分而用于药物递送的可能性。如WO98/17324中那样，该专利指出在同 时施用之前混合两种组分的可能性，但指出随后通常需要在高压或低温下 储存所述混合物以避免微泡在施用前的自发生长。
WO98/17324和WO99/53963两者一致地描述了两种不同的组分， 即分散气体(微泡)组分和可扩散组分(微滴乳液)的施用(同时、分开 或依次)。
WO98/17324和WO99/53963两者都没有描述将治疗剂装载至可扩 散(微滴乳液)组分。
WO98/17324和WO99/53963两者都没有描述在相转变事件的活化 后，使用US声波作用来促进药物从血管腔隙外渗至靶组织。
然而，上面引用的现有技术表示利用这样的微泡对目前研发技术的潜 在改进，并没有向临床实践转化，并且对于超声介导的药物递送的改进方 法仍然具有强烈的需求。
定义
在本文中使用术语“微泡”或“常规的造影微泡”来描述直径为0.2 至10微米(通常地，平均直径为2至3μm的微泡。“常规的造影微泡” 包括市售药剂例如Sonazoid(GEHealthcare)、Optison(GEHealthcare)， Sonovue(BraccoSpa.)、Definity(LantheusMedicalImagin)、 Micromarker(VisualSonicsInc.)和PolysonL(MiltenyiBiotecGmbH)。
在本文中使用术语HEPS/PFB微泡来描述用2mL的水重构第一组分 (参见实施例1)而形成的微泡。
在本文中使用术语“相转变气泡”、“大的相转变气泡”、“大的活化气 泡”和“活化气泡”来描述在US诱导簇组合物的活化后形成的大(＞10μm) 气泡。
在本文中使用术语“微滴”来描述直径为0.2至10μm的乳液微滴。
在本文中使用术语“乳液”来描述微泡的水性混悬液或分散体。
在本文中使用术语“表面活性剂”来描述降低两种液体(例如，在微 滴的分散体中用作稳定剂)或气体和液体(例如，用作微泡的分散体中的 稳定剂)之间表面张力的化合物。
在本文中使用术语“纳米颗粒”来描述线性尺寸小于200nm的颗粒。
“受声波作用(insonation)”或“US辐照”是用来描述暴露于超声 或用超声进行治疗的术语。
在本文中使用术语“沉积示踪剂”是与活化的相转变气泡相关使用， 在暂时地机械地截留微循环中的大气泡的意义上，这意味着相转变气泡在 组织中的局部沉积将反映在活化气泡沉积的时间内流过组织微循环的血 液量。因此，截留的“沉积”相转变气泡的数目将与沉积时间内的组织灌 注线性相关。
在本文中使用术语“相转变(过程)”来描述物质从液态到气态的相 变。具体地，簇组合物的微滴的油组分从液体到气体之状态变化的转变(过 程)。
术语“双相”是指包含两种相态(具体是液态和气态)的系统，例如 簇组合物的微泡(气态)和微滴(液态)组分。
在本文中术语“治疗递送/治疗剂”和“药物递送/药物”两者都应当 理解为包括药物分子、纳米颗粒和纳米颗粒递送系统、基因以及放射性同 位素的递送。
在本文中使用术语“第一组分”来描述分散的气体(微泡)组分。
在本文中使用术语“第二组分”来描述包含可扩散组分的分散油相(微 滴)组分。
在本文中使用术语“簇组合物”来描述由第一(微泡)组分和第二(微 滴)组分的组合而形成的组合物。
在本文中使用术语“可扩散组分”来描述在体内能够扩散进入第一组 分的微泡并暂时增大其尺寸之第二组分的油相的化学组分。
在本文中使用术语“装载容量”来描述可并入药物递送载剂的药物的 量(容量)。
本文中使用的术语“药物组合物”具有其常规含义，并且特别是以适 于哺乳动物施用的形式，尤其是通过肠胃外注射。术语“以适于哺乳动物 施用的形式”意指组合物是无菌的、无热原的、没有能产生过度毒性或不 良作用的化合物，并在生物相容的pH(约pH4.0至10.5)下配制。配制 这样的组合物以使得沉淀不与生物流体(例如，血液)发生接触，仅包含 生物相容性赋形剂，且优选是等渗的。
在本文中术语“声学测量(Sonometry)(系统)”是指使用声学技术 动态地测量活化相转变气泡的尺寸并对其进行计数的测量系统。
在本文中使用术语“反应性”来描述第一组分中的微泡和第二组分中 的微滴在混合后形成微泡/微滴簇的能力。
本文中的术语“微泡/微滴簇”或“簇”是指通过静电吸引力永久地 以单一颗粒的、凝集的实体形式结合在一起的微泡和微滴的群体。
本文中的术语“成簇”是指第一组分中的微泡和第二组分中的微滴形 成簇的过程。
本文中术语“活化”是指通过US辐照诱导微泡/微滴簇的相转变。
缩略语
Hd：汉森距离(Hansendistance)
ADV：声微滴汽化
ANOVA：方差分析
a.u：任意单位
b.p：沸点
b.w：体重
C：圆度
C1：第一组分
C2：第二组分
dCldFEt：二氯二氟乙烷
CltFPr：氯三氟丙烷
COO：连续心输出量
CV：交叉验证
dB：分贝
dClMe：二氯甲烷
DiR：近红外荧光染料
DP：簇组合物或药物组合物
DSPC：1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱。
e.g.：例如
FPIA：流动颗粒图像分析
HEPS：氢化卵磷脂酰丝氨酸纳
HIFU：高强度聚焦超声(highintensityfocusedultrasound)
i.v：静脉内
LogP：(辛醇/水)分配系数的对数(以10为底)，亲脂性的量度
LogS：水溶解度(以gr/100mL计)的对数(以10为底)
M：摩尔/升
MI：MI
NA：不适用
NR：尼罗红荧光染料
PBS：磷酸盐缓冲盐水
PCA：主成分分析
PFB：全氟丁烷
pFMCP：全氟甲基环戊烷
PLSR：偏最小二乘回归
QC：质量控制
R：簇组合物的反应性
SA：硬脂胺
tClMe：三氯甲烷
TIC：时间强度曲线
TRIS：2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1，3-二醇
US：超声
v.p：蒸汽压
V/V：体积/体积
～：约
发明概述
本发明人意外地发现可通过使用双组分、双相微泡/微滴制剂系统来 实现药物递送，其中在施用之前，第一组分中的微泡通过静电引力物理地 附接至第二组分中微米尺寸的乳液微滴。与WO99/53963中的教导相反， 我们发现在施用之前将第一组分与第二组分混合是这类微泡/微滴簇高效 形成的前提条件，并且所述簇组合物可在环境条件下稳定。所述簇容易用 低功率的超声(即，MI小于1.9，优选小于0.7且最优选小于0.4)体内 活化，这诱导了可扩散组分的液体-气体转变(相转变)。可向微滴的油相 中添加治疗剂和/或作为常规药物制剂共施用。大的活化气泡暂时留在微 脉管系统中，并且可通过进一步应用超声而用于促进靶组织的药物摄取。
本发明的药物递送技术与现有的超声介导的药物递送技术以及以上 概述的现有技术显著不同。相对于标准微泡方法的主要改进/新颖性要素 是：
●药物装载容量的显著提高，其中大的(微米尺寸的)乳液微滴的整 个体积可用于药物有效载荷，相对于现有技术方法的微泡组分仅有 薄的稳定化膜。
●活化的相转变气泡的尺寸比典型的微泡大约10倍；将活化的气泡 截留在微脉管系统中；暂时阻止血流，避免了药物的快速洗出；活 化气泡和内皮之间紧密接触；在活化后US治疗过程中有更大数量 级的生物效应，避免了空化机制。
相对于声微滴汽化(acousticmicrodropletvaporization，ADV)方法 的主要改进/新颖性要素是：
●产生相转变事件需要显著更低的声功率；本发明通常需要0.2至0.4 的MI，相对于ADV通常为＞4。
●活化的气泡的寿命显著更长，没有迅速再浓缩；
●在血管腔隙中的活化相对于在组织中的活化。
●活化的相转变气泡的尺寸比为ADV的典型微泡大约10倍；截留活 化气泡，避免药物的迅速洗出；活化气泡与内皮之间紧密接触；在 活化后US治疗过程中生物效应数量级更大，避免了空化机制。
相对于WO98/1732和WO99/53963中描述的相转变方法的主要改进 /新颖性要素是：
●在施用之前在单个的组合簇组合物中形成稳定的微泡/微滴簇，随后 沉积容量提高～10倍。
●药物装载容量显著提高，其中大的(微米尺寸的)乳液微滴的整个 体积可用于药物有效载荷，相对于微泡组分仅具有薄的稳定化膜。
●活化后持续应用声能量以促进药物递送。
现已确定了用于药物递送的簇组合物、药物组合物和用于递送的方法 是使用本发明的相转变技术在体内从所施用的含微泡/微滴簇的组合物产 生大的相转变气泡，并且其促进相关的和/或预施用和/或共施用和/或后施 用的治疗剂的递送。
发明详述
在第一方面，本发明提供了簇组合物，其包含在水性生物相容性介质 中的簇混悬液，其中所述簇的直径为1μm至10μm，圆度＜0.9，并且包 含：
(i)第一组分，其包含气体微泡和稳定所述微泡的第一稳定剂；以及
(ii)第二组分，其包含含有油相的微滴和稳定所述微滴的第二稳定剂， 其中所述油包含能够扩散进入所述气体微泡以至少暂时地提高其尺寸 的可扩散组分，其中，所述第二组分任选地还包含第一治疗剂；
其中所述第一和第二组分的所述微泡和微滴具有相反的表面电荷并通 过吸引性静电相互作用形成所述簇。
簇组合物(即，第一和第二组分的组合)包含气体微泡和油微滴的簇， 即，单独的微泡和微滴的混悬液或分散体与稳定的微泡/微滴簇。簇组合 物是为了向哺乳动物对象施用(例如，静脉内)。实施例1中描述了用于 定量检测和表征所述簇的分析方法。
在本文中，术语“簇”是指微泡和微滴通过静电吸引力永久地以单一 的颗粒的、凝聚的实体的形式结合在一起的群体。簇组合物中簇的含量和 尺寸在将第一和第二组分体外结合后的一段时间内(例如，＞1小时)基 本稳定，即，它们不会自发崩解，形成更大的聚集体或自发活化(相转变)， 并且在稀释后的一段时间内甚至在持续搅拌期间基本稳定。因此，能够用 需要稀释和/或搅拌的多种分析技术来检测并表征簇组合物中的簇。
簇通常包含至少一个微泡和一个微滴，通常包含2至50个单独的微 泡/微滴，直径通常为1至10μm，并因此可以在脉管系统中自由流动。 通过圆度参数可对簇进行进一步表征并且从单独的微泡和微滴中分离。二 维形式的圆度(例如，微泡、微滴或微泡/微滴簇的投影)是与该形状具 有相同面积的圆的周长除以该形状实际周长的比。使用用于计算和报告圆 度的数种数学算法。通常来说，为了提供对正圆形的小偏差敏感的响应， 计算并报告平方圆度(也称为“高灵敏度圆度”)。该术语(C)具有其在 图像分析领域中的常规意义[Wojnar，L等，PracticalGuidetoImage Analysis，ASMInternational，2000，第157-160页]并且是圆在二维中的数 学定义，表示为：
C＝4πA/P2
其中A是该形状的二维投影面积，P是该形状的二维的投影周长。因 此，正圆(即，球形微泡或微滴的二维投影)的理论圆度值为1，任何其 他几何形状(例如，簇的投影)的圆度小于1。在本文中，使用如上所定 义的圆度(C)。
正如所指出的，与WO99/53963中的教导相反，本发明人已发现在 施用之前将第一组分与第二组分混合是这样的微泡/微滴簇高效形成的前 提条件并且簇组合物可在环境条件下稳定。此外，本发明人已发现簇组合 物中聚集形式的微泡和微滴使得在体内有效活化(相转变)并沉积脉管系 统中的活化气泡。如在实施例1和2中所详述的，我们还发现，与同时共 施用两个单独的微泡和微滴组分相比，改造本发明的簇的多个方面，特别 是其浓度和尺寸，可实现使沉积和药物递送容量提高～10倍。
根据本发明，如实施例2和5-1中所示出的，认为通过＜0.9的圆度定 义的尺寸范围为1至10μm内的簇特别有用。这个尺寸范围内的簇活化 之前在脉管系统中自由流动，其容易被US辐照活化，并且其产生足够大 而能在微脉管系统中暂时沉积和停留的活化气泡。
已发现，在簇中存在微泡使得诊断频率范围(1-10MHz)内超声能 量的高效地能量转移，即活化，并且使得乳液微滴在低的MI(低于1.9 且优选低于0.7并且更优选低于0.4)下汽化(相转变)以及汽化的液体 扩散进入微泡和/或在蒸气泡和微泡之间融合。然后活化的气泡由基质气 体(例如，血液气体)向内扩散进一步膨胀达到直径大于10μm，优选大 于20μm。簇的活化和相转变气泡的产生过程中所涉及的确切机制还需要 进一步的研究和阐明。
还已经发现，这些簇的形成是高效相转变事件的前提条件，并且其数 目和尺寸特性与组合物的效力(即，其在体内形成大的活化(即，相转变) 气泡的能力)密切相关。可通过多种制剂参数控制数目和尺寸特性，所述 参数例如但不限于：第一组分的微泡和第二组分的微滴之间的吸引力的强 度(例如，微泡和微滴之间的表面电荷的差异)；微泡和微滴的尺寸分布； 微泡和微滴之间的比例；以及水性基质的组成(例如，缓冲液浓度，离子 强度)(参见实施例1和2)。
可通过改变乳液中微滴的尺寸分布和簇的尺寸特征来改造活化气泡 的尺寸(参见实施例1)。通过应用外部的超声能量(例如来自临床超声 成像系统)在成像控制之下活化簇以产生大的气泡。通常来说，产生的大 的相转变气泡的直径为10μm或更大(参见实施例1、2、3和4)。刚好 在诊断成像暴露极限内(MI＜1.9)的低MI能级足以活化簇，这使得该技 术与其他可用的相转变技术(例如，ADV)显著不同。
由于大尺寸的活化气泡，所以它们暂时停留在微脉管系统中，并且可 通过活化所述簇的超声能量的空间定位沉积而在空间上定位于目的组织 或器官中(参见实施例4和7)。所产生的大的活化气泡(直径为10μm 或更大)在低超声频率(1MHz或更小)具有声共振。已发现，低频超 声的应用接近大的活化气泡的共振频率(即，频率分量为0.05至2MHz， 优选0.1至1.5MHz，最优选0.2至1MHz)，可用于产生机械和/或热生 物效应机制，从而提高脉管系统的局部渗透性和/或声孔效应和/或内吞作 用，并因此提高药物递送和保留(参见实施例8)。
应理解，在US辐照期间的递送机制与向常规的自由流动的微泡(例 如用于US成像的造影剂)应用US诱导的那些递送机制显著不同。但是， 大的相转变微泡被截留在血管区段中并且微泡表面与内皮紧密接触，微米 尺寸的微泡是自由流动的且(通常)离脉管系统壁相对较远(参见实施例 4)。此外，本发明的活化气泡的体积通常是常规微泡体积的1000倍。在 相等的MI时，以接近两种气泡类型的共振的频率接受声波作用(对于相 转变微泡为0.5MHz和对于常规的造影剂微泡为5MHz)，已经显示在振 荡期间相转变气泡的绝对体积位移比常规造影微泡几乎大三个数量级。因 此，相转变气泡的受声波作用将会产生完全不同水平的生物力学效应，与 常规造影微泡受声波作用过程相比，具有明显更大的效应尺寸(effect size)和穿透深度。在自由流动的常规造影微泡中观察到的生物效应很可 能依赖于空化机制，随之带来安全性问题，例如微出血和不可逆转的脉管 系统损伤。可以以较温和的方式(较低MI，例如＜0.4)振荡更大的相转 变气泡，从而避免空化机制，但是仍诱导了足以增强从脉管系统摄取药物 并且进入靶组织的机械功(参见实施例8)。
大的相转变气泡的截留还将作为沉积失踪物。这进一步允许对活化的 簇的数目和组织灌注进行定量，并允许对组织脉管系统进行造影剂成像以 确定待治疗的病变的的空间范围(参见实施例7)。
簇组合物，即，包含第一和第二组分的组合，由改造成以受控的方式 聚集并相转变的双相微颗粒系统组成。可将药物并入低沸点微米尺寸的第 二组分的油微滴，其由例如带正电荷的磷脂膜所稳定。施用前，将第二组 分的载药油微滴与第一组分中微米尺寸的气体微泡混合。这样的气体微泡 可由例如但不限于以下组成：带负电荷的磷脂膜稳定的低溶解度的全氟化 碳气体核芯。
当在靶病理部位处暴露于超声(标准的医学成像频率和强度)时，微 泡向附接的油微滴转移声能并作为油的“种子”以进行液体到气体相转变 (汽化)。在此过程中，药物载荷从油相释放，或在活化气泡的表面上显 现。所得气泡由于油的汽化，经历初始的迅速膨胀，随后，由于血液气体 向内扩散而膨胀较慢，达到至少10μm直径或更大，优选至少20μm直 径或更大，并且临时阻止微循环(遇见动脉和毛细血管网)，暂时停止血 流，持续约1分钟或更长，优选2-3分钟或更长，最优选3-6分钟或更长， 使所释放或显现的药物保持高浓度并接近靶病理部位(参见实施例4和 7)。
或者，如果没有将治疗剂并入乳液微滴的油相，那么可以单独施用治 疗剂，例如与簇组合物共施用或在簇组合物之前或之后施用。在这种情况 下，可以以任何方便的方式施用治疗剂，所述方式包括但不限于：可注射 或口服形式，例如作为常规的药物制剂，例如泰素(Taxol)、健择(Gemzar) 或其他市售化疗药。或者，治疗剂既可包含在油相中也可作为单独的组分 施用。活化相转变技术产生大的相转变气泡，其被截留在目的部位，暂时 阻止了血流流动，其包含单独施用的治疗剂。在截留后，进一步应用超声 促进药物向靶组织外渗。
本发明的第一组分包含微泡，所述微泡类似于那些在市场上批准用于 一些临床应用的常规超声造影剂，例如Sonazoid、Optison、Definity或 Sonovue，或用于临床前应用的类似试剂，例如Micromarker和PolysonL。 第一组分是包含分散的气体和稳定所述气体的物质的可注射水性介质。任 何生物相容性气体均可存在于气体分散体中，本文所使用的术语“气体” 包括在37℃正常人体体温下，至少部分地，例如基本上或完全以气态(包 括蒸气)形式的任何物质(包括混合物)。因此，气体可以包括例如空气； 氮气；氧气；二氧化碳；氢气；惰性气体，例如氦气、氩气、氙气或氪气； 硫氟化物，例如六氟化硫、十氟化二硫或三氟甲基五氟化硫；六氟化硒； 任选卤代的硅烷，例如甲基硅烷或二甲基硅烷；低分子量烃(例如，含有 多达7个碳原子)，例如烷烃，例如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷或戊烷；环 烷烃，例如环丙烷、环丁烷或环戊烷；烯烃，例如乙烯、丙烯、丙二烯或 丁烯；或炔烃，例如乙炔或丙炔；醚，例如二甲醚；酮；酯；卤代低分子 量烃(例如，含有多至7个碳原子)；或任何前述的混合物。有利地的是， 在卤代气体中至少一些卤素原子是氟原子；因此，生物相容性卤代烃类气 体可例如选自：溴氯二氟甲烷、氯二氟甲烷、二氯二氟甲烷、溴三氟甲烷、 氯三氟甲烷、氯五氟乙烷、二氯四氟乙烷、氯三氟乙烯、氟乙烯、乙基氟、 1，1-二氟乙烷和全氟化碳。代表性的全氟化碳包括全氟烷烃，例如全氟甲 烷、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷(例如全氟正丁烷，任选地与其他异 构体(例如全氟异丁烷)混合)、全氟戊烷、全氟己烷或全氟庚烷；全氟 烯烃，例如全氟丙烯、全氟丁烯(例如，全氟丁-2-烯)、全氟丁二烯、全 氟戊烯(例如，全氟戊-1-烯)或全氟-4-甲基戊-2-烯；全氟炔烃，例如全 氟丁-2-炔；和全氟环烷烃，例如全氟环丁烷、全氟甲基环丁烷、全氟二 甲基环丁烷、全氟三甲基环丁烷、全氟环戊烷、全氟甲基环戊烷、全氟二 甲基环戊烷、全氟环己烷、全氟甲基环己烷或全氟环庚烷。其他卤化的气 体包括甲基氯；氟化的(例如，全氟化的)酮，例如全氟丙酮；和氟化的 (例如，全氟化的)醚，例如全氟化二乙醚。
鉴于含有这类气体的微泡在血流中公认的高稳定性，使用全氟化的气 体(例如，六氟化硫)和全氟化碳(例如全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷 和全氟己烷)是特别有利的。具有使其在血流中形成高度稳定的微泡之物 理化学特性的其他气体也同样有用。最优选地，分散的气体包含六氟化硫、 全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷、全氟己烷、氮气、空气或其混合物。
分散的气体可以以任何适当的形式存在，例如使用任何合适的含气体 超声造影剂制剂作为含气体组分，例如Sonazoid、Optison、Sonovue或 Definity或临床前剂例如Micromarker或PolySonL。第一组分将也含有 为了稳定微泡分散体的物质，在本文本中称为“第一稳定剂”。这样的制 剂的代表性实例包括通过第一稳定剂稳定的(例如，至少部分封装的)气 体的微泡，所述稳定剂为例如抗聚结表面膜(例如，明胶)、成膜蛋白质 (例如，白蛋白，例如人血清白蛋白)、聚合物材料(例如，合成的可生 物降解的聚合物、弹性界面的合成聚合物膜、微粒可生物降解的聚醛、聚 氨基酸-多环酰亚胺的微粒N-二羧酸衍生物)、非聚合的和不可聚合的成 壁材料，或表面活性剂(例如聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物表面活性剂， 例如Pluronic、聚合物表面活性剂或成膜表面活性剂(例如磷脂))。优选 地，所述分散的气体是磷脂、蛋白质或聚合物稳定的气体微泡的形式。特 别有用的表面活性剂包括包含具有整体净负电荷的分子的磷脂，例如天然 存在的(例如，来自大豆或卵黄的)、半合成的(例如，部分或完全氢化 的)和合成的磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸和/或心 磷脂。或者，为了稳定而施加的磷脂可携带整体中性电荷，并向其添加负 的表面活性剂，例如脂肪酸，例如，添加磷脂酰胆碱的棕榈酸，或为带不 同电荷磷脂的混合物，例如磷脂酰乙醇胺和/或磷脂酰胆碱和/或磷脂酸。
用于静脉内注射的分散气体组分的微泡尺寸应优选小于7μm，更优 选小于5μm，且最优选小于3μm以便无阻碍地通过通过肺系统，即使在 微泡/微滴簇中也是如此。
对于第二组分，“可扩散组分”是适当的气体/蒸汽、挥发性液体、能 够产生气体的挥发性固体或其前体，例如，在施用后，主要的要求是该组 分应具有或能够在体内产生足够的气体或蒸气压(例如，至少50torr， 且优选大于100torr)以便能够促进气体或蒸气分子向内扩散进入分散的 气体。优选地，在合适的水性介质中将“可扩散组分”配制为微滴的乳液 (即稳定化的混悬液)，因为在这样的系统中，可扩散组分的水相中的蒸 气压与纯组分材料的蒸气压基本上相等，即使在非常稀的乳液中也是如 此。
这样的微滴中的可扩散组分在处理和储存温度下有利地为液体，如果 水相含有适当的防冻材料，温度可低至例如-10℃，然而在体温下其为气 体或呈现明显的蒸汽压。合适的化合物可例如选自在专利WO-A-9416379 (其内容通过引用并入本文)中给出的可乳化的低沸点液体的多个列表。 可乳化的可扩散组分的具体实例包括：脂族醚，例如乙醚；多环油或醇， 例如薄荷醇、樟脑或桉叶醇；杂环化合物，例如呋喃或二氧六环；饱和的 或不饱和的、直链的或支链的脂肪烃，例如，正丁烷、正戊烷、2-甲基丙 烷、2-甲基丁烷、2，2-二甲基丙烷、2，2-二甲基丁烷、2，3-二甲基丁烷、1- 丁烯、2-丁烯、2-甲基丙烯、1，2-丁二烯、1，3-丁二烯、2-甲基-1-丁烯、2- 甲基-2-丁烯、异戊二烯、1-戊烯、1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、丁烯炔、1- 丁炔、2-丁炔或1，3-丁二炔；脂环族烃，例如环丁烷、环丁烯、甲基环丙 烷或环戊烷；和卤代的低分子量烃(例如，含有多至7个碳原子)。代表 性的卤代烃包括：二氯甲烷、甲基溴、1，2-二氯乙烯、1，1-二氯乙烷、1- 溴乙烯、1-氯乙烯、乙基溴、乙基氯、1-氯丙烯、3-氯丙烯、1-氯丙烷、 2-氯丙烷和叔丁基氯。有利地的是，至少一些卤素原子是氟原子，例如， 二氯氟甲烷、三氯氟甲烷、1，2-二氯-1，2-二氟乙烷、1，2-二氯-1，1，2，2-四氟 乙烷、1，1，2-三氯-1，2，2-三氟乙烷、2-溴-2-氯-1，1，1-三氟乙烷、2-氯-1，1，2- 三氟乙基二氟甲基醚、1-氯-2，2，2-三氟乙基二氟甲基醚、部分氟化的烷烃 (例如，五氟丙烷例如1H，1H，3H-五氟丙烷、六氟丁烷、九氟丁烷例如 2H-九氟-叔丁烷和十氟戊烷例如2H，3H-十氟戊烷)、部分氟化的烯烃(例 如七氟戊烯例如1H，1H，2H-七氟戊-1-烯和九氟己烯例如1H，1H，2H-九氟 己-1-烯)、氟化醚(例如，2，2，3，3，3-五氟丙基甲基醚或2，2，3，3，3-五氟丙基 二氟甲基醚)，且更优选全氟化碳。全氟化碳的实例包括：全氟烷烃，例 如全氟丁烷、全氟戊烷、全氟己烷(例如，全氟-2-甲基戊烷)、全氟庚烷、 全氟辛烷、全氟壬烷和全氟癸烷；全氟环烷烃，例如全氟环丁烷、全氟二 甲基-环丁烷、全氟环戊烷和全氟甲基环戊烷；全氟烯烃，例如全氟丁烯 (例如，全氟丁-2-烯或全氟丁-1，3-二烯)、全氟戊烯(例如，全氟戊-1-烯) 和全氟己烯(例如，全氟-2-甲基戊-2-烯或全氟-4-甲基戊-2-烯)；全氟环 烯烃，例如全氟环戊烯或全氟环戊二烯；和全氟化醇，例如全氟叔丁醇。
在本发明中特别有用的是水溶解度低于1·10-4M，更优选低于1·10-5M的可扩散组分(参见实施例5-3)。然而，应注意，如果使用可扩散组 分和/或潜溶剂的混合物，该大部分混合物可含有具有较高水溶解度的化 合物(参见实施例5-4)。
应理解，根据本发明可使用两种或更多种可扩散组分的混合物(如果 期望的话)；本文提及的“可扩散组分”将被理解为包括这样的混合物。 还应理解，可将药物并入到可扩散组分中，并且为了提高该系统的药物装 载容量也可使用在下文中描述的潜溶剂。
第二组分将还含有为了稳定微滴分散体的物质，在本文中称为“第二 稳定剂”。第二稳定剂可以是与用于稳定气体分散体相同或不同的任何材 料(例如表面活性剂、聚合物或蛋白质)。任何这样的材料的性质可显著 地影响分散的气相的生长速率等因素。通常来说，例如选自EP-A-0727225 (其内容通过引用并入本文)给出的广泛列表中的多种表面活性剂可以是 可用的。可用的表面活性剂的代表性实例包括脂肪酸(例如，直链饱和的 或不饱和的脂肪酸，例如含有10至20个碳原子)和碳水化合物及其甘油 三酸酯、磷脂(例如，卵磷脂)、含氟磷脂、蛋白质(例如，白蛋白，例 如人血清白蛋白)、聚乙二醇和聚合物，例如嵌段共聚物表面活性剂(例 如，聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，例如普朗尼克(Pluronics)、延展性 的聚合物，例如酰氧基酰基聚乙二醇，例如聚乙二醇甲基醚十六酰氧基- 十六烷酸酯，例如其中聚乙二醇部分的分子量为2300、5000或10000)， 和含氟表面活性剂(例如，以商品名Zonyl和Fluorad市售的，或在 WO-A-9639197中描述的，其内容通过引用并入本文)。特别可用的表面 活性剂包含具有整体中性电荷分子的磷脂，例如，二硬脂酰-sn-甘油-磷酸 胆碱。
可以理解，为了促进有吸引性的静电相互作用以实现第一组分中的微 泡与第二组分中的乳液微滴之间成簇，它们应具有相反的表面电荷。因此， 如果第一组分的微泡带负电荷，第二组分的微滴应带正电，或反之亦然。 为了促使油微滴具有合适的表面电荷，可向稳定化结构中添加阳离子型表 面活性剂。可以使用多种阳离子物质，例如至少在一定程度上疏水的和/ 或基本上不溶于水的具有碱性氮原子的化合物，例如伯胺、仲胺或叔胺和 生物碱。特别可用的阳离子型表面活性剂是硬脂胺。
还应理解，可根据组分的形式以多种方式来实现第一和第二组分的混 合；例如，混合两种流体组分，将干粉形式的一种组分与流体形式的一种 组分重构，在用流体(例如注射用水或缓冲溶液)重构之前混合两种干粉 形式的组分。此外，应理解，其他组分也可影响微泡和微滴在混合后形成 簇的能力，所述其他组分包括但不限于：微泡/微滴的表面电荷水平、两 种组分中微泡/微滴的浓度、微泡/微滴的尺寸、离子组成和浓度、赋形剂 的组成(例如，缓冲液或张力组分)和浓度等(参见实施例1)。组分和 组合物的这种特性也可影响所产生的簇的尺寸和稳定性(体外和体内二 者)并且可以是影响生物属性(例如，效力和安全性)的重要因素。还应 理解，簇组合物中并非所有的微泡/微滴都可以以簇的形式存在，但大部 分微泡和/或微滴可以以游离(非成簇的)形式与微泡/微滴簇群体同时存 在。此外，混合两种组分的方式可影响以下这些方面，包括但不限于：在 均质化(例如，柔和的手动均质化或强烈的机械均质化)过程中施加的剪 切应力(shearstress)和均质化的时间范围。
用于静脉内注射的乳液中可分散的可扩散组分的微滴尺寸应优选小 于7μm，更优选小于5μm，最优选小于3μm，并且大于0.5μm，更优 选大于1μm以促进无阻碍地通过肺系统，但仍保持足以用于药物装载和 将活化的气泡保留在微脉管系统中的体积。
体内的分散的气相的生长可例如伴随有任何封装材料(其中这种封装 材料有足够的柔韧性)的膨胀和/或从向生长的气液界面施用的材料提取 过量的表面活性剂。然而，封装材料的拉伸和/或材料与超声的相互作用 可显著提高其孔隙率。然而，迄今为止，在许多情况下发现封装材料的这 种破坏可导致回声反射通过向外扩散而迅速损失，因而暴露了气体溶解， 我们已经发现当按照本发明使用组合物时，暴露的气体显示出显著的稳定 性。同时，不希望受理论计算的束缚，我们相信对例如通过可扩散组分产 生的过饱和环境造成的微泡坍塌，暴露的气体(例如以自由的微泡形式) 可以是稳定的，这提供了向内的气压梯度以抵消微泡气体向外扩散的趋 势。由于基本上不存在密封材料，暴露的气体表面可导致活化的气泡呈现 出特别有利的声学特性，如在典型的诊断成像频率下通过高反向散射和低 能量吸收所证明的(例如，通过高反向射式：衰减比所表示的)；这种回声 效应可能会持续一段显著的时间，即使是在持续的超声辐照时也是如此。
簇的微泡组分的声共振在诊断频率范围(1-10MHz)内。利用例如 在常规医用超声腹部和心脏应用中使用的标准诊断超声成像脉冲在中等 范围至低机械指数下(MI低于1.9且优低于0.7，且优选低于0.4)容易 获得簇的活化。通过采用成像脉冲使用毫米空间分辨率范围内的临床成像 系统可实现使活化簇相转变以产生更大的(10μm或更大的直径)相转变 气泡。活化后，微滴中的油便汽化，释放治疗剂(如果包含治疗剂的话) 从而以游离药物的形式环绕流体，或作为结晶药物(以颗粒形式)，或在 活化的气泡上显现/与活化的气泡表面缔合。活化的气泡截留在微脉管系 统中，暂时停止了血液流动并使微脉管系统中的药物保持高浓度。在截留 后进一步应用超声促进递送机制提高向组织递送药物的效率。在低MI下 (低于约0.1的簇活化阈值)簇不被活化，这允许进行标准的医疗超声造 影剂的成像，例如，以确定肿瘤微血管病理部位而无需活化簇。使用成像 脉冲在医学超声成像控制下的活化允许被超声场询问的组织区域中空间 靶向地活化簇。活化后所产生的大的相转变气泡由于其尺寸(10μm或更 大的直径)而暂时截留在微脉管系统中。所产生的大的相转变气泡是乳液 微滴汽化的体积(来自3μm直径微滴油的30μm气泡直径)的约1000 倍。这些大的相转变气泡的散射截面要比活化之前簇中包含的微米尺寸的 微泡的散射截面大几个数量级。因此，大的相转变气泡产生大量反向散射 信号并且在与诊断成像系统的基本成像模式中容易成像(参见实施例2 和7)。大的相转变气泡的机械共振频率也比活化之前簇中包含的微泡的 共振频率低一个数量级(1MHz或更小)。与大的相转变气泡的共振频率 相称的声场的应用在医学诊断范围内在MI下产生相对较大半径的振荡。 因此，可以应用低频率(0.05至2MHz，优选0.1至1.5MHz且最优选 0.2至1MHz)超声来产生增强所释放或共施用的药物的摄取的生物效应 机制。利用活化的气泡的共振效应使得与其他技术相比，在较低的声强度 和较低的频率下允许更好地控制这些生物效应的启动。再加上在成像控制 下(使得空间靶向组织中大的活化气泡)，相转变气泡被活化并沉积在组 织微脉管系统以及其停留时间延长的事实，这允许更高效且受控地执行药 物递送机制。利用沉积的大相转变气泡的共振特性所需要的较低频率和低 声功率具有打开血脑屏障的巨大潜在优势。较低频率场大幅地降低了其他 方法目前所遇到的热效应问题并且不需要去除颅骨来避免这些问题。
待递送的治疗剂(也称为“药物”)可选自药物分子、纳米颗粒和纳 米颗粒递送系统、基因和放射性同位素。其被溶解或以其他方式并入(例 如，分散)第二组分的油相中，或者作为替代地作为单独的组分施用。药 物类别的实例包括但不限于：基因(用于基因治疗)、化学治疗剂、免疫 治疗剂(例如，用于癌症治疗或器官移植治疗)、产生血管发生的药物(例 如以刺激新血管的生长)、通过血脑屏障的药物(例如治疗癌症或神经疾 病，例如帕金森病和阿尔茨海默病)。
对于化学治疗剂，实例药物包括但不限于以下药物类别：烷化剂，例 如环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、苯丁酸氮芥、美法仑；蒽环类， 例如柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、戊柔比星； 细胞骨架干扰剂(紫杉烷类)，例如紫杉醇和多西他赛；埃博霉素类；组 蛋白去乙酰化酶抑制剂，例如伏立诺他、罗米地辛；拓扑异构酶I和II 的抑制剂，例如伊立替康、拓扑替康、依托泊苷、替尼泊苷、他氟泊苷 (Tafluposide)；激酶抑制剂，例如硼替佐米、埃罗替尼、吉非替尼、伊 马替尼、维罗非尼、维莫德吉(Vismodegib)；单克隆抗体，例如贝伐单 抗、西妥昔单抗、伊匹单抗、奥法木单抗、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)、 帕尼单抗、利妥昔单抗；核苷酸类似物及前体类似物，例如阿扎胞苷、硫 唑嘌呤、卡培他滨、阿糖胞苷、去氧氟尿苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基 脲、巯嘌呤、甲氨蝶呤，硫鸟嘌呤；肽类抗生素，例如博来霉素、放线菌 素；基于铂的药剂(Platinum-basedagent)，例如卡铂、顺铂、奥沙利铂； 类视黄醇类，例如维甲酸、阿利维甲酸、蓓萨罗丁；长春花生物碱类及其 衍生物，例如长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨。
如实施例5中所指出的，在本发明中，优选LogS小于-2的疏水性药 物。
在本发明的一个实施方案中，将药物溶解于包含可扩散组分的油微滴 中。为了溶解足够量(例如按质量计大于0.5％或优选按质量计大于2％) 的药物，可向主要油组分中添加一种或更多种溶剂(潜溶剂)。优选地， 溶剂的化学反应性应是惰性的，例如但不限于：未取代的烷烃和醚、氢化 的氟碳化合物(hFC)和全氟化的(pF)烷烃(pFC)、pF-环烷烃、pF- 醚、氢化氟醚(hFE)、pF-氧杂环戊烷、pF-呋喃、pF-吡喃、二乙基硅烷。 优选地，潜溶剂应限于IHC类2、3和4，具有低毒性可能性的溶剂和没 有充分毒理学数据的溶剂，例如但不限于：丙酮、乙醇、乙酸乙酯、2- 丙醇、1，1-二甲氧基甲烷、异丙醚、三氯乙酸等。可能的优选溶剂的另一 些实例包括但不限于：二甲基亚砜(DMSO)、氧杂环丁烷(三甲撑氧)、 1-氯-2-氟乙烷、二甘醇单乙醚、亚甲基二氯(二氯甲烷)、亚甲基三氯(三 氯甲烷)、3-氟氧杂环丁烷、呋喃聚醇醚(glycofurol)、二氯乙烯、1，3-二 氟丙烷、2-氯-1，1-二氟乙烷、1-氯-2，2-二氟乙烷、1，2，2-四氟乙基氟甲基醚、 甲基异丙醚、1-丙醇、丙二醇、2-丙醇、1-戊醇、1-丁醇、2-丁醇、1，3-丁 二醇和异丁醇。
为了优化药物装载容量，可特别可用的是同时使用两种或更多种潜溶 剂。特别可用的潜溶剂包括亚甲基二氯、亚甲基三氯和2-氯-1，1-二氟乙烷。
为了定量组合物所释放的以及递送至组织区域的药物的量，通常可用 医疗超声成像系统在期望的空间位置测量活化后簇组合物所产生的大的 相转变气泡的声信号。例如，使用计算机处理通过合适的软件算法和支持 方法记录并解释声信息。因此，在一个实施方案中，本发明提供了通过由 相转变技术活化释放的大的相转变气泡所产生的声学特征的分析对所释 放的药物的量进行定量的方法。因此，通过对大的活化气泡的声学特征处 理来对所递送的药物量进行定量。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于作为多药物治疗方案一部分 的药物的递送方法。
在再一个实施方案中，本发明提供了包括使用低MI造影剂成像模式 (MI＜0.15)来对微泡组分(即分散的气体)进行成像的步骤，而不需活 化簇以确定治疗的病理区域的方法。因此，因为簇在低MI(低于活化阈 值)下未被活化，所以在活化步骤之前可进行标准的医疗超声造影剂成像， 例如，以确定肿瘤微血管病理部位而无需活化簇。
在又一个实施方案中，本发明提供了使用活化气泡的沉积示踪剂特性 和超声成像来确定治疗的病理区域以及对灌注进行定量。除了使用低MI 造影剂成像模式来对微泡组分进行成像(无需活化簇)以确定治疗的病理 区域外，该方法可包括使用活化气泡的沉积示踪剂特性来确定治疗的病理 区域以及对灌注进行定量。
在本发明的又一个实施方案中，在(施用簇组合物)之前和/或同时 和/或之后施用治疗剂。施用簇组合物并进行活化步骤。簇组合物的活化 产生截留在目的部分而暂时停止血液流动的大的相转变气泡。在截留后进 一步应用超声促进了生物学机制，例如提高脉管系统的渗透性，因此提高 摄取和/或分布，从而提高之前和/或同时和/或之后施用的药物的效力。
在本发明的又一个实施方案中，以装载进第二组分的乳液微滴中和作 为单独组分两种形式给予治疗剂。
在本发明的另一个实施方案中，通过对大的活化气泡的声学特征的处 理来对被治疗的组织区域的灌注进行定量。
在本发明的又一个实施方案中，通过对反向散射信号的处理从组织区 域的声学特征中全部或部分地分离大的相转变气泡的声学特征，并用于改 进对所递送的药物和/或被治疗的组织的灌注的定量。
在本发明的又一个实施方案中，向含有大的活化气泡的组织区域施加 高功率的超声(高强度聚焦超声，HIFU)[Lukka，H.等，ClinicalOncology 23(2011)117-127]。大的相转变气泡的存在提高了使用超声热疗和/或组织 消融之热递送的局部速率。
在本发明的又一个实施方案中，向含有大量相转变气泡的组织区域施 加高功率超声以裂解细胞(例如癌细胞)，从而引起对癌组织的全身性免 疫应答。
因此，本发明的簇组合物可以用作药物组合物。
在第二方面，本发明提供了药物组合物，其包含
(i)第一个方面中所定义的簇组合物，
(ii)任选的第二治疗剂，其以与(i)的混合物或作为与(i)分开的 组分的形式提供；
其中所述药物组合物包含至少一种治疗剂。
在第二方面的第一个实施方案中，在药物组合物的簇组合物中的治疗 剂不存在，而是作为单独的组分提供。
在第二方面的第二个实施方案中，在药物组合物的簇组合物中第一治 疗剂存在，并且第二治疗剂也存在并作为单独的组分提供。
在第三方面，本发明提供了超声造影剂，其包含第一方面中所述的簇 组合物或第二方面中所述的药物组合物。
在第四方面，本发明提供了向哺乳动物对象递送至少一种治疗剂的方 法，其包括以下步骤：
(i)向哺乳动物对象施用在第二方面中所限定的药物组合物；
(ii)任选地使用超声成像对所述药物组合物的微泡进行成像以确定 所述对象中进行治疗的目的区域；
(iii)通过对所述对象中目的区域进行超声辐照来活化步骤(i)的所 述簇组合物的第二组分的可扩散组分的相转变，以使：
(a)所述簇的微泡被步骤(iii)的所述可扩散组分扩大以产生 扩大的气泡，所述扩大的气泡由于其暂时阻止所述目的区域的 微循环而定位在所述目的区域；和
(b)步骤(iii)的所述活化促进步骤(i)中施用的所述治疗剂 的外渗。
(iv)任选地，通过进一步超声辐照促进步骤(i)中施用的所述治疗 剂的进一步外渗。
在这种情况下，在步骤ii、iii和iv中可以使用任何机械指数的超声。 然而，在步骤ii中优选MI＜0.15，并且在步骤iii和iv中优选MI＜0.7。在 这种情况下，在步骤ii、iii和iv中，可以使用0.05到30MHz之间任何 频率的超声。然而，在步骤ii和iii中优选1-10MHz范围内的频率，并 且在步骤iv中优选0.05-2MHz范围内的频率。
优选地，经胃肠外(优选静脉内)向所述哺乳动物对象施用药物组合 物。施用途径也可选自：动脉内、肌内、腹膜内或皮下施用。在第五方面， 本发明提供了治疗哺乳动物对象的方法，其包括第四方面所限定的递送方 法。
本发明还涉及本发明的药物组合物的用途或在哺乳动物对象的治疗 中本发明的递送方法。
在第六方面，本发明提供了治疗哺乳动物对象的方法，其包括向目的 区域施用本发明的簇组合物或本发明的药物组合物以及施加高强度聚焦 超声(HIFU)。
在第七方面，本发明提供了本发明的簇组合物或本发明的药物组合物 作为超声造影剂或药物的用途。在第八方面，本发明提供了超声成像的方 法，其包括对先前施用本发明的超声造影剂的哺乳动物对象进行成像。
在第二至第八方面中，可以使用与第一方面所述的相同组分和实施方 案。
实施例
以下非限制性实施例用于举例说明本发明。为简单起见，在以下所有 实施例中，用C1表示第一组分，用C2表示第二组分，用DP(药品)表 示簇组合物，即由第一和第二组分的组合形成的组合物。
实施例1提供了用于表征和定量DP中微泡/微滴簇的分析方法的说 明，并解释了相关的响应和属性，包括浓度、尺寸和圆度。实施例1还提 供了用于表征和定量活化气泡的尺寸和浓度的分析方法的详情。此外，以 将预混合的与共注射的DP的特性进行比较的方式呈现了有关制备后簇稳 定性的数据。实施例1还详述了用于受控地操纵DP中的簇含量及尺寸的 改造步骤。
实施例2提供了以在微循环中沉积大的活化气泡的能力而阐明簇特 性对产品效力之两项体内研究的结果。实施例2进一步分析了这些数据并 断定由圆度小于0.9所限定的、尺寸为3μm至10μm的簇都有助于簇组 合物的效力。实施例2还将产品效力的结果与WO99/53963中所报道的结 果进行了比较，并表明本发明使得沉积的相转变气泡的量提高了10倍。
实施例3提供了证明体内活化气泡的尺寸和动态的研究结果。这证实 了体外分析的结果，示出了约20μm平均活化气泡尺寸。
实施例4提供了通过肠系膜组织的活体镜检法证明活化气泡的沉积 性质之体内研究结果。实施例4还提供了US辐照后有关大的活化气泡的 体积振荡(volumeoscillation)的理论计算并将这些与常规的造影微泡的 体积振荡进行了比较。结论认为由本发明的大的活化气泡所提供的绝对体 积振荡比常规的造影微泡大三个数量级。
实施例5提供了有关C1和C2的多种制剂研究的结果。结果表明当 使用市售的微泡制剂Sonazoid、Optison、Sonovue、Micromarker和 Polyson作为C1时，本发明教导的概念是有功能的；因此，证明可开发 一系列的微泡组分用于本发明中。用这些试剂中的一些所制备的簇组合物 的结果证明低至约1μm直径的簇可被活化，从而有助于组合物的整体效 力。实施例5还研究了一系列用于C2的可扩散组分并表明通过使用低水 溶解度的全氟化烃可避免混合C1和C2后的自发活化，并且使用这样的 化合物还提高US活化后形成大的相转变气泡的能力。此外，实施例5提 供了有关C2的药物载荷的研究数据以及部分卤化的烃作为潜溶剂以促进 此类装载的用途。
实施例6提供了用装载有尼罗红荧光染料的C2所制备的活化气泡的 荧光显微镜检的结果。结果表明，活化后，所装载的物质在活化气泡的表 面均匀地显现，因此将与内皮壁紧密接触并且易于外渗。
实施例7提供了表明在鼠癌症模型中活化气泡的沉积性质之US成像 造影研究，并且将其特性与常规的HEPS/PFB微泡(C1)进行比较的结 果。结果表明，在施用DP和随后的活化后，大的相转变气泡沉积在肿瘤 微循环中并保持静止几分钟。在活化后1.5分钟没有观察到造影水平的变 化。相反，HEPS/PFB微泡显示出迅速洗出的自由流动造影并且在不到1 分钟后完全回到基线。
实施例8提供了递送共施用的和装载的化合物的研究结果。在第一研 究组中，示出了施用DP和随后的活化以及进一步US辐照使得肌肉组织 中的摄取提高了2倍。使用相同的US辐照步骤，在仅施用HEPS/PFB微 泡(C1)后没有观察到摄取的提高。用DP，在仅活化后肿瘤中的摄取就 提高了2倍且在US进一步辐照后提高了3.4倍。在第二研究组中，示出 了施用DP和随后的活化使肿瘤对CW800IR染料的摄取(随着发光强度 的提高)提高了约30％。而进一步的US辐照使肿瘤摄取提高了约60％。 在第三研究组中，研究了施用装载有DiR荧光染料的DP、随后的活化和 进一步的US辐照。结果显示在经处理的肿瘤组织中荧光强度有强烈的显 著提高，表明装载进C2组分的荧光染料的释放和摄取。
实施例9提供了C1和C2的制备说明。根据药典(Ph.Eur./USP)， 三个连续批次的C1和C2通过了无菌测试。
附图简述
图1-对于第一组分的微泡和第二组分的微滴之间三个水平的静电 吸引，第一组分(微泡，虚线)、第二组分(微滴，点划线)、第一和第二 组分的总和(双点划线)以及簇组合物(实线)的库尔特计数器(Coulter counter)分析的结果。Y轴是计数浓度(a.u.)，x轴是直径(以μm计)。 具有1.5％SA的低吸引力(上图)、具有3％SA的中等吸引力(中间的图) 和具有5％SA的高吸引力(下图)。如可观察到的，系统中的颗粒总数的 损失(由白色箭头指示)从在1.5％SA时可以忽略的值提高至5％SA处 的大于50％。此外，簇组合物的尺寸分布的大末端拖尾(由黑箭头指示) 随着静电引力的提高而提高，表明微泡/微滴簇的含量提高。
图2-对簇组合物的流动颗粒图像分析的结果。代表性选择了显示出 微泡/微滴簇的5μm至10μm颗粒的显微照片。
图3-对第一组分(微泡，上图)和第二组分(微滴，下图)的显微 镜检查和图像分析结果。编号1的图框示出了微泡/微滴的尺寸分布，其 中y轴是检测的数目，x轴是直径(以μm计)。编号2的图框示出了微 泡/微滴的圆度分布，其中y轴是圆度并且x轴是检测的数目。编号3的 图框示出了尺寸(x轴)相对于圆度(y轴)的散点图，其中每个检测按 尺寸/圆度矩阵(circularitymatrix)绘制为单个点。图框3中的灰色区域 表示＞3μm，圆度＜0.9的检测。右(大)图示出了代表性选择的微泡/微滴 的单个检测的显微照片。如从上图中可观察到，第一组分中的微泡显示具 有约2.8μm中值直径的相当窄的尺寸分布，以及约0.98中值圆度的窄的 圆度分布。小于1％的检测包含在直径＞3μm且圆度＜0.9的扇区中且所有 这些都是单个微泡。如从下图中可以观察到，第二组分中的微滴显示出约 3.0μm中值直径的相当窄的尺寸分布以及约0.96中值圆度的窄的圆度分 布。小于1％的检测包含在直径＞3μm且圆度＜0.9的扇区中且所有这些都 是单个微滴。
图4-在US诱导相转变活化之前(上图)和之后(下图)，簇组合 物的显微镜检查及图像分析结果。编号1的图框示出了所检测颗粒的尺寸 分布，其中y轴是检测点的数目，x轴是直径(以μm计)。编号2的图 框示出了圆度分布，其中y轴是圆度，x轴是检点的数目。编号3的图框 示出了尺寸(x轴)相对于圆度(y轴)的散点图，其中各个检测按尺寸/ 圆度矩阵绘制为单个点。上图，图框3的灰色区域表示＞3μm，圆度＜0.9 的检测。上图，右(大)框示出了在直径＞3μm且圆度＜0.9扇区中代表性 选择的单个检测的显微照片。与图3相比，非活化簇组合物中的颗粒在尺 寸上显示出长末端拖尾，在圆度上为低末端拖尾，如尺寸与圆度散点图中 所观察到的明显的脊，这表明存在微泡/微滴簇。约6％的检测包含在直径 ＞3μm且圆度＜0.9的扇区。在这些中，95％以上是微泡/微滴簇(即，小 于5％的单个微泡或微滴)。下图，右(大)图示出了代表性选择的大的 活化气泡的单个检测的显微照片。如可观察到的，在US辐照后，簇组合 物中的簇进行相转变以产生包含在约10μm至100μm之间的大的相转变 气泡群体，平均直径约20μm。
图5-从图4中显示的簇组合物的结果中分离的微泡/微滴簇的相对 尺寸分布(上)和圆度分布(下)。如可观察到的，簇组合物中的簇的直 径为～3μm至～10μm，并且由圆度＜0.9表征。
图6-声学测量分析的响应。左图：在声学测量计测量室中的体积分 数(y轴)相对于活化后的时间(x轴)。右图：活化气泡的体积加权(A) 和平均直径数目加权(B)(y轴)相对于活化后的时间(x轴)。
图7-簇组合物的稳定性。来自FPIA分析(空心圆，左轴)的5μm 至10μm之间簇的浓度和来自声学测量分析每微滴体积的活化气泡体积 (实心圆，右轴)相对于制备后的时间。
图8-来自声学测量分析的活化气泡之体积加权的中值直径(y轴， μm)相对于来自库尔特分析的簇组合物的反应性(x轴，％)。
图9-簇组合物的效力与反应性。Y轴示出了经静脉内在左心室中的 施用簇组合物并活化后，狗心肌(灰度等级单位)US信号的线性增强。 X轴示出了来自库尔特分析的簇组合物的反应性(％)。这些结果证明最 佳反应性在30％至60％之间。
图10-簇组合物的簇尺寸与反应性。Y轴示出了对于不同尺寸级别： ＜5μm(虚线)、5μm至10μm(实线)、10μm至20μm(点划线)和20 μm至40μm(虚线-点-点线)观察到的簇含量(以平均值％计)。X轴示 出了来自库尔特分析的簇组合物的反应性(％)。这些结果表明随着反应 性提高以及在高反应性下中小尺寸簇的消耗，朝向更大的簇移动。
图11-簇组合物的效力相对于簇浓度和活化气泡体积。左手侧图：Y 轴示出了经静脉内向左心室中施用簇组合物并活化后，来自狗心肌(灰度 等级单位)US信号的线性增强。X轴示出了在来自FPIA分析在施用的 簇组合物中，5μm至10μm之间的簇的浓度(百万/mL)。右手侧图：Y 轴示出了经静脉内向左心室中施用簇组合物并活化后，狗心肌(灰度等级 单位)US信号的线性增强。X轴示出了来自声学测量分析在施用的簇组 合物中的活化气泡体积(μL/mL)。在这两幅图中的灰色区域表明WO 99/53963中所报道的心肌增强的范围。这些结果表明所研究的体外参数是 组合物效力的良好预测物，并且本发明所教导的簇组合物相对于WO99/ 53963中所教导的簇组合物效力提高了10倍。
图12-经静脉内向左心室中施用簇组合物并活化后，狗心肌(灰度 等级单位)US信号的线性增强，多种尺寸级别的簇对线性增强所作贡献 进行多变量的主成分分析(principalcomponentanalysis，PCA)的结果。 在表7和8中详述了对30个样品的数据进行PCA；Y轴示出了计算的相 关系数，即，簇尺寸级别(X-变量)＜5μm、5μm至10μm、10μm至20 μm和20μm至40μm对心肌增强的贡献。右手侧图：Y轴示出了使用来 自左手侧图模型计算的心肌增强(GS单位)，X轴示出了对于每个样品 (R＝0.85)测量的心肌增强。这些结果表明，中小尺寸的簇(＜10μm) 对簇组合物的效力做出显著贡献，然而较大簇(＞10μm)则没有。
图13-分离自具有46％反应性的簇组合物(表4的3号样品)结果之 微泡/微滴簇的相对尺寸分布(上)和圆度分布(下)。如可观察到的，簇 组合物中簇的直径为～3μm至～10μm，并且由＜0.9的圆度表征。
图14-在经静脉内施用簇组合物并在心室活化后，动脉血中活化气 泡的体积分数(y轴，ppm)相对于时间(x轴，秒)。
图15-左上显微照片示出了肠系膜中簇组合物注射并活化后17秒大 鼠肠系膜的图像，相转变气泡暂时停留在微脉管系统中阻断血液流动。在 图(左下)中示意性地示出了由虚线矩形框指示的区域。相转变气泡的轮 廓已被放大5倍。用A标记相转变气泡的轮廓，用C标记20微米的比例 尺。用B标记并按比例显示的3μmHEPS/PFB微泡显然太小而不能像与 活化的相转变气泡的相同方式阻塞血管。(右上)和(右下)分别示出了 注射后5分19秒和5分45秒时肠系膜的同一区域。在完全除去 (dethatching)之前，相转变气泡收缩并沿血管树间歇向下移动，被重新 建立的血流洗出。
图16-用A标记30微米直径的相转变气泡，用B标记3微米直径 的HEPS/PFB微泡，以10微米比例尺标度。同样通过按比例绘制用虚线 绘制较小和较大的直径来描绘对US受声波作用模拟响应的最小和最大直 径。体积的绝对变化提高了约3个数量级，这是因为与HEPS/PFB微泡 相比，相转变气泡的受声波作用对这两种气泡类型周围组织的机械作用方 面有根本性区别。
图17-油相水溶解度对自发和US活化的气泡生长的影响。左手侧 图：Y轴示出了对混合第一组分和第二组分后(即，在簇组合物中)自发 形成的大的相转变气泡的量的显微镜检查得分(0＝没有观察到或有非常少 数的气泡＞15μm，1＝观察到中等数目的气泡＞15μm，2＝观察到大量数 目的气泡＞15μm)。X轴示出了第二组分中油相的摩尔水溶解度。右手侧 图：Y轴示出了在US活化簇组合物后形成的大气泡的量的显微镜检查得 分(0＝观察到没有或有非常少数的气泡＞15μm，1＝观察到中等数目的气 泡＞15μm，2＝观察到大量数目的气泡＞15μm)。X轴示出了第二组分中 油相的摩尔水溶解度。这些结果表明，随着第二组分中油相的水溶解度的 提高，自发的活化水平提高，而US诱导的活化水平降低。
图18-装载有DiR染料、尼罗红染料和紫杉醇的第二组分的显微照 片，示出了装载分子无沉淀的迹象的稳定乳液，微滴直径在1μm至5μm 的尺寸范围内。
图19-来自簇组合物的活化相转变气泡的交集的荧光显微检查的显 微照片，其中第二组分中的微滴中装载有5mg/mL的尼罗红染料。如可 观察到的，活化后装载进微滴中的分子染料在活化气泡的表面上显现，因 此将与内皮壁紧密接触，并易于外渗。
图20-左手侧图像示出了在小鼠的后肢中PC-3皮下肿瘤的典型超 声图像。白色虚线表示肿瘤组织的位置。与周围组织(例如皮肤和肌肉) 相比，通常肿瘤的内部是低回声的。右手侧图像示出了经静脉内注射簇组 合物并活化后，与左图像所显示的相同的PC-3肿瘤的典型超声图像。在 肿瘤内部清楚地示出了另外的造影回波(contrastechoe)沉积在组织中， 并在肿瘤组织中保持静止几分钟。
图21-在施用簇组合物并活化后(A)以及在相同的肿瘤中测量的仅 有等效剂量的HEPS/PFB微泡后(B)的PC-3肿瘤中造影增强的典型时 间强度曲线(timeintensitycurve，TIC)。在覆盖肿瘤中心的目的区域内 将线性化的反向散射强度进行平均。y轴是平均的线性化反向散射的值， 且x轴是所述视频序列中的视频帧数。以每秒10帧的速度获得该视频。 如可观察到的，簇组合物在约20秒后在高水平达到散射强度峰值，并且 研究时间跨度内仍然稳定。相反，仅施用HEPS/PFB微泡，相转变气泡 在较低水平达到散射强度峰值并且在约1分钟后耗尽回到基线。
图22-共施用LiCorCW800EPR剂和簇组合物的典型落射荧光图 像。第1组的动物(左图)没有接受US辐照，而第3组的动物(右图) 接受了US活化以及随后的低频US辐照。箭头指示了肿瘤的位置，在每 只动物上，两个肿瘤都具有大约相同的尺寸和位置。用相同的扫描仪设置 拍摄图像并用相同荧光强度的线性灰度等级进行直接比较。与没有接受超 声辐照的肿瘤相比，接受超声活化以及随后US辐照的肿瘤的荧光强度明 显提高，这证明当用簇组合物处理时，CW800染料的摄取显著提高。
图23-处理后1分钟至9小时，肿瘤荧光强度与未处理对照腿强度 之比。y轴是肿瘤强度与未处理对照腿强度之比。x轴是时间(以分钟计)。 与第1组(菱形；没有进行活化，没有随后的US辐照)相比，第2组中 初始摄取在统计上显著提高(正方形，仅进行活化)，与第1组和第2组 相比，第3组中初始摄取和摄取率在统计学上显著提高(圆圈；进行活化 和随后的US辐照)。
图24-整合了在处理后1分钟至1小时肿瘤区的平均强度与未处理 的腿的平均强度之比。组A、B和C分别为“没有进行活化，没有随后的 US辐照”、“只进行活化”和“进行活化和随后的US辐照”。组A和B之 间以及组B和C之间所观察到的摄取提高在统计学上是显著的。
图25-簇组合物处理后的典型落射荧光图像，其中第二组分中的微 滴装载有10mg/mL的DiR染料。上部图像(A)来自第1组动物，接受 没有进行活化或随后没有向左侧荷瘤腿进行US辐照。下部图像(B)来 自第2组的动物，其中簇组合物被活化，随后向左侧荷瘤腿进行US辐照。 用箭头指示肿瘤的位置。所观察到的荧光强度差异清楚地证明在进行活化 和随后的US辐照后装载的分子染料的释放和组织摄取，如通过表22中 给出的统计学分析所示。
实施例1(E1)-本发明的分析工具和基本特征
E1-1介绍
在组合C1和C2后形成的(即，DP中存在的)微泡/微滴簇对于组 合物的关键质量属性(即，递送药物的功能性)至关重要。因此，以有关 浓度和尺寸来表征和控制形成的簇的分析方法是评估本发明以及进行药 物质量控制(QualityControl，QC)的必要工具。已经确定了可应用于 此目的三种不同的分析工具：库尔特计数、流动颗粒图像分析(Flow ParticleImageAnalysis，FPIA)和显微镜/图像分析。在下本中，简单地 解释了这三种分析方法和合适的响应，按照这些特征的受控改造的一些方 面，举例说明了C1、C2和DP的一些基本特征。
除了用于表征簇组合物中的簇的这些技术之外，已经开发了研究体外 簇活化(即，在US辐照后产生大的活化气泡)的分析方法。在E1-6中 详述了这种方法“声学测量”。来自声学测量分析的主要报告响应是活化 气泡的数目和体积以及其尺寸分布两者相对于活化后的时间。在E1-5中 详述了还可通过显微镜/图像分析研究活化响应。
E1-2所研究的组分和组合物
除了E5-2之外，在所有实施例中所研究的所有组合物中，第一组分 (C1)由通过氢化卵磷脂酰丝氨酸钠(HEPS-Na)膜所稳定并嵌入冻干 的蔗糖中的全氟丁烷(PFB)微泡组成。HEPS-Na携带负电荷的头部基 团，因此微泡带有表面负电荷。每小瓶C1包含约16μL或2·109个微泡， 平均直径约2.0μm。
在所有实施例中所研究的所有组合物中，第二组分(C2)由具有3％ mol/mol硬脂胺(SA)(添加以提供正表面电荷)之1，2二硬酯酰-sn-甘油 -3-磷酸胆碱(DSPC)膜稳定化的全氟甲基环戊烷(pFMCP)微滴组成。 C2中的微滴分散在5mMTRIS缓冲液中。在这些研究中所研究的C2的 标准制剂含有约4μL或0.8·109个微滴/mL，平均直径为约1.8μm。
在某些情况下，为了阐明对簇特性的影响，以受控方式改变多种制剂 变量，例如SA含量、微滴尺寸、微滴浓度、TRIS浓度和pH。在已使用 这样的样品的情况下，本文中详述了这些方面。
通过用2mL的C2重构C1小瓶，随后手工均质化30秒而无菌地制 备簇组合物(DP)。使用无菌的一次性使用的注射器和针头从C2的小瓶 中抽出2mL。通过C1小瓶的塞子添加注射器的内容物，并将所得的DP 均质化。
如实施例9中详述的制备C1和C2。
在某些情况下，为了比较本发明的簇组合物相对于常规造影微泡的效 果，用纯水代替C2来制备C1以产生HEPS/PFB微泡的水性分散体。
E1-3库尔特计数
库尔特计数是对大于1μm的颗粒物进行定量和尺寸表征的最广泛使 用的分析技术之一，并且已显示适用于药用药品的QC[Sontum，PC.和 Christiansen，C.，J.Pharm.Biomed.Anal.第12卷，第10期，1233-1241 (1994)]。简言之，在无颗粒的水性电解质(通常为磷酸盐缓冲盐水，PBS) 中稀释/分散小等量份的分析物(例如C1、C2或DP)，并通过连续搅拌 而均质化。然后通过仪器中的孔吸出一部分稀释样品，在仪器上连续测量 电阻率。通过孔吸出的每个颗粒将导致电阻率相对于所述颗粒体积成比例 地改变。在分析的过程中，该仪器通过孔吸出已知体积的电解质，对每个 电阻率脉冲进行测量并计数，并将结果呈现为所测量的颗粒的计数浓度相 对于尺寸。对于所报道的分析，使用设置有50μm孔径的Coulter MultisizerIII或IV(BeckmanCoulterLtd.)(测量范围为1μm至30μm)。 在IsotonII(PBS电解质，BeckmanCoulterLtd.)中稀释合适的样本体 积并在整个分析中通过继续搅拌均质化。
库尔特计数适于对C1和C2中微泡和微滴浓度和尺寸分布进行定量， 以及用于表征DP中的颗粒。因为簇中两个或更多个微泡/微滴被计数为单 个颗粒，在组合两种组分后，簇的形成将导致1)系统中颗粒总数目降低 和2)向更大的尺寸转变。在示出了作为单独组分的C1和C2、C1和C2 的总和(即，组合的组合物，在混合后没有形成簇)和DP的浓度和尺寸 分布的图1中举例说明了这些影响。图示出了在稳定化膜中使用具有 1.5％、3.5％和5.5％SA(带正电荷的表面活性剂)的C2制剂的结果。 SA的量影响微滴的表面电荷(ζ电位)以及C2中的微滴和C1中的微泡 之间吸引性静电力的强度，因而影响混合后形成簇的能力。对于1.5％、 3.5％和5.5％的SA制剂，测得这三个样品中微滴的ζ电位分别为+22mV、 +35mV和+43mV。用相同的C1制剂制备所有样品。测得C1中微泡的 ζ电位为-57mV。如图1所示，两种组分之间表面电荷的较大差异(即， 较大的静电吸引力)导致更多更大的簇形成。用1.5％SA制剂，DP中的 浓度和尺寸与C1和C2的理论总和相比没有显著性改变，因此，没有观 察到簇形成的证据。另一方面，3.5％的SA制剂在浓度方面显示出轻微但 是显著性的降低和大的末端拖尾的提高，5.5％的SA制剂显示了显著成簇 的证据，计数浓度显著降低，明显向更大的末端拖尾转变。因此，微泡和 微滴之间的吸引力需要超过一定的阈值以便在组合C1和C2后形成稳定 的簇。
这些测量值的特别有用的响应是簇组合物的反应性(R)，定义如下：
R＝(CC1+CC2-CDP)·100/(CC1+CC2)
其中CC1、CC2和CDP是分别在C1、C2和DP中观察到的计数浓度 (在C1中，然后在2mL纯水中重构后)。因此，这种反应性是在DP中 以簇形式包含的C1和C2中有多少单个的微泡和微滴的量度。反应性还 与这些簇有多大(即，多少个单个的微泡和微滴构成单个簇)相关性，对 于更多的细节参见E2-5。例如，如果没有成簇，那么CDP＝CC1+CC2且 R＝0％，如果簇组合物中的所有微泡和微滴形成单个大簇，那么CDP为～0 和R为～100％。从C1(在2mL水中重构后)、C2与DP的库尔特分析， 可容易地计算出R。
即使库尔特分析适于表征DP中总颗粒浓度和尺寸分布，但其本身没 有区分微泡、微滴或簇；对所有的实体进行计数和按尺寸分为“颗粒”。 为了具体地区分和表征簇，显微镜技术是必要的。
E1-4流动颗粒图像分析
流动颗粒图像分析(FPIA)是完全自动化的显微镜和图像分析技术 [Sontum，PC.和Martinsen，E.，Eur.Conf.DrugDeliv.Pharm.Tech.， Seville(Spain)，第47页，#25(2004)的摘要]。简言之，将分析物(例如 C1、C2或DP)的小等量份稀释/分散于无颗粒的水性稀释剂(水或PBS) 中，并通过连续搅拌来均质化。然后通过仪器中的测量池(measuringcell) 吸取已知部分的稀释样品，通过具有频闪光源的CCD照相机拍摄固定的 一组显微照片。自动分离并通过图像分析软件来分析每帧中的颗粒，并计 算每个颗粒的多种形态学参数。此外，报道了颗粒浓度。本发明特别感兴 趣的是区别游离的微泡或微滴与其簇之间的参数。为此，颗粒尺寸被描述 为圆形等效直径，且其圆度已被用作标准响应。将圆形等效直径定义为与 检测到的颗粒具有等效面积的圆的直径。术语“圆度”(C)具有其在图 像分析领域的常规意义并在第12页进行了定义。
除了数值响应，仪器提供不同尺寸级别(＜5μm、5μm至10μm、10μm 至20μm、20至40μm)代表性选择的显微照片。对于所报道的分析，使 用设置有高功率场(20×)且测量范围为0.7μm至40μm的Sysmex2100 仪器(MalvernInstrumentsLtd.)。将合适的样品体积在水中稀释，并在 整个分析中通过持续搅拌来均质化。
在图2中示出了来自由用含3.5％硬脂胺的C2制成的DP样品分析， 尺寸级别在5μm和10μm之间的单个簇的代表性选择的显微照片。如可 观察到的，在该尺寸级别中，所有的117个检测，除一个外(即＜1％) 都是微泡/微滴簇。表1表明在图1中可视化的具有可变数量硬脂胺(1.5％ 至5.5％)的样本在不同尺寸级别中所观察到簇的计数浓度。如可看出， 证实了图1中的结果，1.5％硬脂胺的簇浓度是可以忽略的，在3.5％时观 察到相当数量的小尺寸(即＜5μm)和中等尺寸(即5-10μm)的簇，并 且在5.5％时观察到小簇浓度的降低，以及中等的和大的(即，＞10μm) 簇浓度升高。
表1.在微滴的稳定化膜中不同量的硬脂胺(SA％)所形成的三个级别的 静电吸引下，簇组合物中多个尺寸级别的微泡/微滴簇的反应性(R)和浓 度(百万/mL)。
SA％ R(％) ＜5μm 5-10μm 10-20μm 20-40μm 1.5 4 6.5 0.0 0.0 0.0 3.5 21 112.6 3.8 0.1 0.0 5.5 50 84.7 14.0 2.3 0.1
E1-5显微镜检/图像分析
作为FPIA分析的替代选择，采用配有图像分析软件的更加手工的显 微镜检技术。为此，使用具有20×物镜，测量范围为1.8μm至100μm的 MalvernMorphologyG3系统(MalvernInstrumentsLtd.)。在一些情况 下，使用测量范围μm0.5μm至40μm的50×物镜。简言之，将分析物(例 如C1、C2或DP)的小等量份稀释/分散于无颗粒的水性稀释剂(例如， 水或PBS)中并均质化。然后将经稀释的样品引入到显微镜通道载玻片 (channelslide)(IBIDIμ-slide，IBIDIGMBH)，已知通道高度400μm 并置于显微镜下方。仪器自动扫描载玻片的预置区域并通过CCD照相机 拍摄一组固定的显微照片。自动分离并通过图像分析软件来分析每帧中的 颗粒，并计算每个颗粒的多种形态学参数。报告颗粒的总数，并从已知的 扫描区域和已知的通道高度，可以计算分析物中颗粒的浓度。至于FPIA 分析，报告圆形等效直径和颗粒圆度。可显示所有检测到的颗粒的显微照 片并通过手动、目视检查来进行评价。因此，可从例如游离的微泡分离所 有的簇，且对于每个样品中的簇可以构建完整的簇尺寸和圆度分布。
该方法还可用于表征活化的气泡群体，即，超声活化后的簇组合物。 为此，将显微镜载玻片浸入37℃的水中并在0.8的标称MI下，用ATL3-2 换能器(中心频率2.25MHz)进行10秒受声波作用。在活化后立即将载 玻片放置在显微镜下，并重复该分析。
活化前和活化后，对于C1和C2，该分析的输出的典型实例示于图3， 对于DP示于图4。如从圆度相对于直径散点图可以观察到，C1和C2显 示基本上球形颗粒的窄的尺寸分布，而非活化的DP含有由微泡/微滴簇的 存在而引起的具有更低圆度之材料的脊。所有显微照片的目测表明在纯净 的C1和C2样品中没有观察到微泡/微泡或微滴/微滴聚集体；所有检测到 的颗粒是由单个球状实体构成。US辐照后DP的样品的结果清楚地表明， 所述簇已被活化，并已相转变至大的(＞10μm)气泡，在纯净的C1或 C2样品单独等效受声波作用后没有观察到大气泡。图5示出了从图4的 DP的样品分离的整个簇群体的结果。如可以观察到的，簇包含在～3μm 至～10μm之间并通过圆度＜0.9来表征。
E1-6声学测量
为了研究和证明组合物中存在的微泡/微滴簇被活化后所产生的大的 相转变气泡的特性，开发了在相关的体外系统中可以确定活化后活化的气 泡浓度、尺寸和动力学的分析方法。下文中详细地描述了用于体外测量活 化气泡的尺寸的方法，其随时间得到活化气泡浓度的测量值以及在直径4 至80微米的尺寸分布。在覆盖活化气泡生长和溶解的时间段内，每隔15 秒进行测量。
声学传输技术被用于体外测量活化的大气泡群体的尺寸分布动力学。 声学技术需要在一定的频率范围内进行衰减测量，所述频率比用于常规成 像的频率(1-10MHz)低一个数量级(约0.2MHz)。随后转化为活化气 泡尺寸信息，这是基于气泡共振理论以及使用标准技术所得的第一类弗雷 德霍姆积分方程(Fredholmintegralequation)的解。使用相关的速度弥 散(velocitydispersion)数据来提供用其评估转换过程性能的定量的质量 度量。该技术是基于声纳文献中描述的测量海洋上层气泡群体尺寸的方 法，为了适用于当前的问题而进行了一些非实质性修改。
为了获得关于活化气泡尺寸的信息，测量主要声学特性作为频率的函 数。然后，转换该数据来提供尺寸信息。转换需要活化气泡与入射声场相 互作用的精确模型。在文献中，起泡液体中的许多传播非线性压力波的模 型是可用的。本文中我们限制了对低振幅声波的传播的测量，这有效地将 测量置于线性区域内，因此采用线性模型。我们还对Foldy近似法适用的 气泡密度进行限制考虑和测量[Phys.Rev.B，第67卷，第107-119页， 1945]。相关理论在[J.Acoust.Soc.Am85，第732-746页，1989]中提出。
低频率(PanametricsVideoscanSN：267202part#V1012，0.25MHz 中心频率)的宽带脉冲直接穿过样品池，从钢板反射出(离低频换能器约 25cm)上，穿过样品而传播返回并被同一换能器接收。因此，脉冲两次 穿过样品池。样品池的内部尺寸为：宽7.4cm，厚3.1cm，高10.3cm， 得到236.28cm3的总体积容量。池是封闭的且不包含顶部空间以使其可保 持受控的气体饱和度。选择37℃为进行测量的温度以模拟体温。体内血 液中的气体饱和度约为：动脉血98kPa，静脉血90kPa。加上全身超压 (～100mmHg)，这提供了约85％的体内气体饱和度环境。将样品池的气 体饱和度控制在85％以模拟体内的环境。进行温和地搅拌以确保充分混 合。使用聚酯膜(Mylarmembrane)来提供声学透明窗。低频源无法活 化所述簇。通过高频换能器提供活化。低频脉冲的带宽能够覆盖直径尺寸 范围为4μm至80μm的活化气泡。
在Hadamard意义上，转换过程是不适定的，因此需要优化数据信 噪比。因此，尽可能平均实际的可能性是适当的。在10MHz采样频率至 标称8位记录了200个连续的rfA线信号并且包含一个测量数据集。将 传送换能器的脉冲重复频率设置为200Hz，因此数据捕获需要一秒钟。 每15秒记录一次数据集，并下载至用于后续数值转换的PC。45个这样 的测量数据集构成一个运行，总计跨度11分钟。
转换测量的主声学特性以得到活化的气泡浓度和尺寸分布信息是基 于由Commander和McDonald提出的简单的有限元解法(finiteelement solution)[JAcoust.Soc.Am.89.第592-597页，1991]。所使用的转换算 法的详细信息可见于[“Solvingleastsquaresproblems”，PrenticeHall，第 23章，第161页，1974]。
从声学测量值，可以计算出作为频率的函数的声衰减和速度二者。速 度数据可被认为独立于衰减数据。只有衰减数据被用于计算活化气泡的尺 寸分布，速度数据可被用作估计的活化气泡尺寸分布的独立检验的基础。 含气泡液体的速度在共振频率附近高度分散。这种现象可用于导出‘质量 (quality)’度量以便定量地推断估计的活化气泡尺寸分布的准确性或可 信度[IEEEJ.ofOceanicEngineering，第23卷，第3期，1998]。
上面详述的方法学的主要报告是活化气泡数目和体积浓度以及数目 和体积加权的气泡直径，两者都是相对于活化后的时间。
应用声学测量分析，对E1-2中详述的簇组合物的样品进行分析。图 6(左手边)示出了测量池中活化气泡体积浓度(％v/v)(y轴)并且图6 (右手边)示出了加权平均直径的数目和体积(y轴)，两者都是活化后 时间(x轴)的函数。质量度量确认了上述的尺寸分布是稳健的。如从图 6中可观察到，产生的结果证实了组合物中的簇在期望的MI范围内被活 化并在所期望的尺寸范围以及相关的体外测量系统的动力学内引起气泡 生长。
在以下的实施例中，从该分析评估的主要响应是每微滴体积或每DP 体积的峰值活化气泡体积以及在峰值活化体积的体积加权平均直径。
E1-7簇组合物中簇的稳定性
DP中的簇是通过微泡和微滴之间的静电吸引力形成并保持的。这些 力是有限的，并且簇在形成后受到多种途径/影响(例如机械应力或热(布 朗)运动)后可能破碎。
为了精确和准确地表征，重要的是在分析的时间内簇仍然保持稳定。 已经用上述所有方法研究了这种稳定性。为了评估稳定性，在其中覆盖＞5 分钟时间跨度内，在单个DP样品上重复3至5种分析物。已经观察到在 这些重复之间浓度或尺寸二者均没有显著变化，这证明在所述的分析条件 下，即在PBS或水稀释后，并在连续地均质化(搅拌)下，微泡、微滴 和簇可稳定＞5分钟。
对于用作医用药物产品，至关重要的是将产品的重要特征保持能够使 用的一段时间。已经用多种技术(包括FPIA和声学测量)研究了在制备 后DP的稳定性。图7示出了在环境室温和压力下储存的两个DP样品中， 来自FPIA分析的5μm至10μm之间的簇浓度和来自声学测量分析的每 微滴体积的峰值活化体积相对于制备后的时间。在FPIA分析过程中没有 观察到自发活化的证据。如可从图7中观察到，在DP制备后1小时的时 间段内观察到簇含量和活化气泡体积可忽略的变化。
E1-9制剂方面
可以开发许多不同的制剂方面用于控制DP中的簇含量和尺寸，并用 于实现最佳性能。可用于改造簇含量和尺寸分布的参数包括但不限于：微 泡和微滴之间表面电荷的差异(例如，E1-3中所示的SA％)、C2的微滴 尺寸、pH值、C2中TRIS的浓度以及微泡和微滴的浓度。此外，组分的 化学降解(例如，在高温下长期储存过程中)可影响DP制备期间C1和 C2形成簇的能力。以下给出了这些方面的简要描述。
微滴尺寸-通过离心和在不同的离心时间后受控地除去上清液和/ 或沉淀物而由单批原料乳液制备具有可变微滴尺寸的C2样品。在调整尺 寸后，将所有样品的浓度调节至微滴的相同体积浓度(约4μL微滴/mL)。 制备微滴尺寸为1.8μm、2.4μm和3.1μm体积中值直径的C2样品并用 于与单批C1小瓶制备DP并通过库尔特计数法测定反应性。发现反应性 随着微滴尺寸的降低而提高，从3.1μm的27％至2.4μm的49％和1.8μm 的78％。降低微滴尺寸从而提高了混合C1和C2后簇的形成。
pH-制备两小瓶DP以使达到pH6.6以及制备两小瓶以使达到pH 6.1。对于pH6.6和pH6.1的样品，通过库尔特计数法测定的所得反应性 分别为30％-32％和51％-52％。pH的降低由此提高了簇的形成。
TRIS浓度-对于来自同一批C2的三个样品，TRIS的浓度在1mM 至10mM之间变动。使用单一批次的C1，每个样品均用于制备DP并通 过FPIA分析测量所有样品5μm至10μm之间的簇的浓度。发现簇的形 成随着TRIS浓度的提高而降低，C2中TRIS从1mM提高至10mM， 簇浓度从6.7百万/mL降低至3.7百万/mL。
微滴浓度-组合C1和C2后形成的簇也是两种组分中微泡和微滴的 浓度的函数，即，微泡与微滴之比。从直观的角度来看，很可能在两种组 分所带总表面电荷完全平衡的系统中，结果将是所有微泡和所有微滴将形 成一些非常大的簇(即，导致系统的整体坍塌)。我们已发现为了产生受 控的且靶向的成簇(其中几乎所有的微滴都包含在簇形式中)，并且形成 的簇具有可接受的尺寸，微泡所带的总电荷应超过微滴所带的总电荷。无 论如何，微滴/微泡之比必须还高于某个阈值以便形成大量的簇。表2中 的结果示出了当与C1中固定浓度的微泡一起用来制备DP时，C2中的微 滴浓度(8μl微滴/mL)的效果。如可以看出，我们发现随着添加到固定 量的微泡中微滴浓度的提高，在反应性方面成簇的大幅增长以及平均簇直 径的大幅增长。
表2.来自库尔特分析的反应性(R)和用具有可变微滴浓度(C)的C2 制成的簇组合物中显微镜检/图像分析的平均簇直径。
C(μl/mL) R(％) 平均簇直径(μm) 1.0 8 4.9 1.5 26 NA 3.0 46 5.8 6.0 74 NA 9.0 93 8.5
热降解-在稳定C2中微滴的磷脂膜中的SA组分在高温长期储存后 易于热降解，在降解过程中失去其正电荷。因此，当与C1组合时形成微 泡/微滴簇的能力下降。将C1的两个样品置于受控的储存条件下，于4℃ 和30℃下保持3个月，并用于制备DP，通过FPIA分析测量DP上5μm 至10μm之间的簇的含量。对于4℃和30℃下储存的样品，所观察到的 簇含量分别为29.6百万/mL和0.2百万/mL。
E1-10活化气泡的尺寸
活化气泡的尺寸对于所施用组合物的生物属性(例如，安全性和有效 性方面)可以是重要的。然而，自然地取决于在C2中微滴的尺寸，活化 的气泡尺寸也与簇尺寸密切相关。图8示出了对在表4、E2-3中详述的样 品进行测量依据库尔特分析的反应性和依据声学测量的活化气泡直径之 间的协方差(covariance)。如可以看出，活化的气泡直径从在低反应性(即， 来自小的簇)的约20μm增大到高反应性(即，来自大的簇)的约50μm。
实施例2(E2)-对簇属性与产品效力的体内研究
E2-1简介
在E1中已经示出了如何测量本发明(即，簇组合物中的簇)的重要 特征，以及如何操作和控制这些特征，目前的实施例研究了对于最佳的体 内效力应以哪些簇特性为目标。为了实现这一目的，分别进行了两种广泛 的体内研究(研究A和研究B)，其中在开胸的狗心肌模型中测定了施用 具有不同特征的许多DP样品后获得的US造影增强。经静脉内注射以及 在左心室中活化组合物后，观察到US信号的心肌增强。在活化后，大的 相转变气泡被截留在心肌毛细血管网中，并且US造影增强是所沉积的活 化气泡的量的直接度量，并因此是所施用样品效力的度量。
E2-2所研究的组分和组合物
在E1-2中描述了在本实施例中所研究的组合物中的第一组分(C1)。
在本实施例中所研究的所有组合物中的第二组分(C2)由具有硬酯 胺(SA)(添加以提供正表面电荷)的1，2二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 (DSPC)膜所稳定的全氟甲基环戊烷(pFMCP)微滴组成。C2中的微 滴分散在TRIS缓冲液中。
为了获得簇组合物(DP)制剂变量(例如SA含量、微滴尺寸、微 滴浓度)的簇特性方面的显著差异，如在E1中所述，以受控的方式改变 TRIS浓度和pH。
在研究A中，如表3中所详述，微滴尺寸、SA含量(％mol/mol) 和pH在一系列的15个样品中均不同。对于这些样品，将微滴和TRIS 浓度保持恒定在约4μl/mL和5mM。
表3.在研究A中所研究的C2组分特性的差异
在研究B中，微滴和TRIS浓度以及微滴直径在一系列的15个样品 中均不同。此外，一个样品在40℃下储存3个月后发生热降解。在表4 中详细说明了所研究的C2样品。对于这些样品，将pH保持恒定在6.2 并且SA含量保持恒定在3％。
表4.研究B中所研究的C2组分特征的差异
1样品#13使用前在40℃下储存3个月。
E2-3体外表征
在表3和4中详述的所有样品均用于制备和表征DP，如在El中详 述的。对于所有样品，通过FPIA分析确定簇的含量和尺寸，通过声学测 量确定活化气泡的含量和尺寸。此外，对于表3中详述的样品，通过库尔 特计数法测定反应性。
E2-4体内方法
对于这两种研究，应用了以下的体内方法。
动物处理：
动物(杂种狗或混种狗)在实验当天早晨到达。并未适应环境。用戊 巴比妥(12-25mgkg-1i.v.)和芬太尼(1.5-2.5μgkg-1)诱导麻醉并插入气 管内导管。将动物转移到手术台，并装上体积受控的机械室空气通气(New England改进的101大型动物通气机)。当需要时，在一段时间内给予富 含O2的空气，但是，在受试物质注射前10分钟至注射后11分钟的时间 间隔内不给予。
麻醉：
通过注射器输液泵(IVAC型号P2000)受控通过静脉内连续输注芬 太尼(20μgkg-1h-1)以及通过滴水线(dripline)通过静脉内连续输注戊 巴比妥(10mgkg-1h-1)将动物全身麻醉。可将施用的麻醉剂的速率调整 为稍微偏离标称值以确保恒定的麻醉深度。通过生理学记录(心率，血压) 以及通过对动物的一般观察(肌肉活动、呼吸作用、反射的迹象)来监测 麻醉的深度。
体温：
体温由Harvard恒温反馈控制单元保持恒定在38°。
手术和仪器：
将用于压力测量的Swann-Ganz导管经股静脉和腹股沟切口插入肺 动脉。将全身动脉压力传感器导管经相同的切口插入股动脉。进行中线胸 骨切开术，并除去前面的心包膜。将心脏悬挂在心包支架上以避免压缩心 房和静脉。将0.8mmVenflonTM插管插入最接近肘关节的右头静脉以注射 受试物质。
生理学监测：
通过与定制的漂移补偿桥式放大器(MAX420，MaximIntegrated Products，SunnyvaleCA)连接的SensoNor840传感器(SensonorAS， Horten，Norway)测量动脉及肺动脉压力。在500Hz对放大器输出进行 取样，并供给8通道12位ADC卡(CIO-DAS08，计算机主板)从而通 过PC软件(TurboPascal5.0，BorlandInternational)进一步处理。连续 监测(CapnomacUltima呼吸气体分析仪)O2和CO2的吸入量和呼出量， 但不进行记录。
对于每次心跳，计算、显示并记录以下变量：a)收缩压、舒张压和 真平均全身动脉压(systemicarterialpressure，SAP)，b)真平均肺动脉 压(pulmonaryarterialpressure，PAP)和c)来自自动(通过软件)ECG r波形检测的瞬时心率。
成像：
通过ATLHDI-5000扫描仪对心脏的中线、乳头中间短轴切面成像。 使用P3-2传感器，在最高帧速率和最大输出功率(MI≈1.0)下，以具有 两个焦点区的常规基本B模式操作扫描仪。在传感器表面和心外膜之间 使用30mm硅酮橡胶软垫。所有的材料界面都覆盖基于水的声学接触凝 胶。
将图像的深度调整至包括整个心脏的最小值。使用50dB的动态范 围。在每个指定的时间点储存一对来自舒张末期和收缩末期的数字图像。 使扫描仪连续不断地运行，除了用于存储图像之电影回放(cine-loop)恢 复的短暂时期之外。在实验期完成后，将数字图像转移至磁光盘。进行屏 幕的PALVHS视频记录以证明该过程。动物的身份和所有的注射(注射 数、物质和剂量)均应在屏幕上进行注释。
注射技术和剂量：
在每次注射之前，用2mL的C2重构新的一小瓶C1。取出期望剂量 的DP(200μl)并用50mg/mLTRIS缓冲的甘露醇(10mM，pH7.4) 稀释至2.5mL。所施用的剂量相当于10μlDP/kgb.w，相当于标称的0.04 μlpFMCP微滴和0.08μlHEPS/PFB微泡/kgb.w。通过装有橡胶膜端口 的VenflonTM插管进行注射。在每次注射后，立即用5mL的等渗盐水冲 洗插管和端口死腔(deadspace)(约0.1mL)。
实验操作：
通过右头静脉注射DP，并在90秒、3、5、7和11分钟量化所产生 的心肌造影效果。每次注射前进行基线读数。注射之间允许至少20分钟 降低潜在的滞后效应(carry-overeffect)。
数据分析和报告：
对于每个指定的时间点，从前壁心肌中大的目的区读取心肌造影效果 (MathLab软件)，相对于时间进行制表并以图形示出。对于每次注射， 将90秒的造影效果用作效力的主要量度。以dB报告造影强度值并从这 些值计算线性增强(灰度等级单位，GS)。
E2-5研究A的结果
在表5中详述了对于所研究的15种组合物所观察到的体外表征和心 肌增强的结果。可以从该数据中提取阐明系统性质和特征的几个重要相关 性。
最重要的是，我们发现了反应性相对于增强相关关系中的最佳值，如 图9所示。该协方差清楚地表明DP中簇的形成存在最佳平衡。
其次，我们发现所形成的簇的尺寸也与系统的反应性有强关联，如图 10所示。如从该图中可观察到，在反应性相对较低的水平下(例如＜20％) 只形成小的簇(即，＜5μm)和中等尺寸的簇(即，5-10μm)。随着反应 性提高，开始形成更大的簇；在R＞约20％时，开始形成10μm至20μm 的簇，在R＞约50％时，开始形成20μm至40μm的簇。当更大的簇形成 时，是以损失较小的和中等尺寸的簇为代价；我们发现对于簇浓度＜5μm 和5μm-10μm，含量相对于反应性明显最佳。
在组合中，在图9和10示出的结果表明较大簇的形成不利于组合物 的效力，必须相应地平衡成簇电势。
虽然不希望被认为是理论推测，但是这些效果的可能原因可以是：1) 在较大的簇中包含的较大块防止或降低了活化效力或2)经静脉内注射 后，较大的簇仍然在肺循环中，因此不会到达进行活化的左心室。
表5.所研究组合物的体外表征和体内性能的结果-研究A(参见正文)
E2-6研究B的结果
表6中详述了对所研究的15种组合物所观察到的体外表征和心肌增 强的结果。从这些数据中可提取阐明该系统性质和特性的几个重要的相关 性。
在图11中示出了体外所观察到的5μm至10μm之间簇浓度和峰值 活化气泡体积相对于体内观察到的心肌增强之间的相关性。
在WO99/53963中给出的实施例20至27也设置了与E2-4中所述相 同的模型中的心肌增强数据并且应用的方法是相同的。此外，这两个研究 中每千克体重施用的气体和微滴体积方面的剂量也相当；WO99/53963使 用0.35μl气体和0.04μl微滴/kg.b.w，而在本实施例中有效剂量分别为 0.08μl气体和0.026至0.059μl微滴/kg.b.w。为了进行比较，于是所观察 到的以及在WO99/53963的实施例20至27中引用的增强范围已包含在图 11中。这些实施例中的增强以dB给出，因此，根据线性增强＝10(dB/10)， 已经从表4、WO99/53963第63页的实施例20至27引用的数据中重新计 算用于该比较的线性增强值。
如从图11可看出，体内增强与两种体外参数具有良好的相关性，证 明其相关性为体内性能的预测者；即，簇包含DP中的活性成分。此外， 在WO/9953963中报道的线性心肌增强最大值为51相对于在本研究中为 693。然后应用本发明的概念：通过在施用之前制备C1和C2的组合物， 从而形成微泡/微滴簇，而非由WO/9953963教导的共注射两种组分，使 得药效提高＞10倍。
表6.所研究的组合物的体外表征和体内性能的结果-研究B(参见正文)。
E2-7多变量分析、靶簇尺寸和圆度差异
对于E2-5和E2-6中所报道的所有数据，多种尺寸级别的簇含量和体 内增强的结果使得可在统计上评估多种簇尺寸级别对体内效力的贡献。为 此，进行了多变量的主要成分的分析。通过偏最小二乘回归(PLSR)测 定了多种簇尺寸级别的含量(X)与增强(Y)之间的相关性。PLSR算 法区别噪声以提取并确定真正的相关性。通过应用全交叉验证(CV)进 行PLSR模型的验证。CV方法选出一个样品，然后通过估计(预测)排 除样品的Y并与测量的Y进行比较来测试模型的精密度。对每个样品重 复该方法，因此模型的数目等于样本的数目。通过比较来自交叉验证的所 有模型，通过评估源于每个模型的回归系数的变化来确定X-变量的显著 性(p＝0.05)。最终的模型是由所有30个样品形成。
通过比较预测的增强和测量的增强来验证模型准确度和可靠性并通 过经典的统计质量估计(r、RMSEC、RMSEP)来验证可靠的模型。另 外的统计学参数例如模型杠杆(modelleverage)和样品到模型的距离的 评估认为没有影响模型解决方案的临界异常值。使用Unscrambler软件 v.9.8，CamoASA进行统计学分析。
图12中示出了该分析结果。如可观察到的，发现＜5μm的簇对心肌 增强具有统计学上显著的贡献，并且5μm至10μm之间簇贡献更强，这 证实了图11中显示的二维分析。10μm到20μm之间的簇对增强没有显 著贡献，20μm至40μm之间簇也如此，甚至表明后者具有负贡献，这证 实在图9和10中显示的结果。该结果表明较大的簇的形成降低了概念的 功能性，因为这种形成将功能性簇的浓度消耗至小于10μm。
表4中报道的介质反应性(R＝46％)样品表示应被靶向的具有簇属 性的DP。图13示出了该样品的簇尺寸和圆度分布。如可以看出，这种样 品中的簇在～3μm至～10μm之间并显示圆度低于0.9。
E2-8结论
根据在E1和E2中详述的数据和讨论，我们已经表明：
●在组合第一和第二组分后(即，在簇组合物或药物组合物中)微泡 /微滴簇的形成是其预期的体内功能性的前提条件。
●靶向的簇的属性在尺寸方面是小于10μm，并且可通过圆度＜0.9来 指示与游离微泡/微滴的区别。
实施例3(E3)-体内活化气泡尺寸
E3-1简介
为了研究和证明在活化组合物中存在的微泡/微滴簇后所产生的大的 相转变气泡的特性，开发了允许在相关动物模型中体内测定活化的气泡尺 寸和动力学的方法。
E3-2所研究的组分和组合物
在E1-2中详述了在这项研究中所研究的组合物。
E3-3方法
在狗模型中进行活化气泡尺寸分布和活化量(yieldofactivation)的 测量。这项研究经当地动物福利委员会批准。将插管置于主动脉中以使得 血流通过进行声学气泡尺寸测量的体外测量室。通过静脉内注射以10μl DP/kg.b.t施用化合物并通过临床超声扫描仪对心腔成像提供活化。
为了提供一致性数据，还通过在插管中进行声学活化，经左心房插管 施用化合物，从而提供了可与在向体外气泡尺寸测量系统中的相同施用 (在插管中活化)进行直接比较的数据。
开发数学模型来计算从体外测量室中进行的测量所释放的活化气泡 的体积。通过经插管向左心房注入活化的气泡，然后将该结果与在体外测 量系统中相同施用的结果进行比较来验证该模型的结果。
在每次给药之间至少允许有15分钟。用18G针头通过橡胶膜端口在 前肢上经VenflonTM静脉内插管进行注射。由于剂量水平低，在用甘露醇 /TRIS水溶液以1∶10稀释DP后进行所有的静脉内注射。在约5秒内进行 注射，随后用盐水冲洗。在某些情况下，通过短聚乙烯导管注射到心脏的 左心房，通过离体超声对药物进行预先活化或不进行预先活化。缓慢(20 秒)地进行左心房注射以模拟正常肺通道中丸剂的暂时分散。由于需要对 注入的样品进行稀释以便使离体超声暴露能透入流体，用等渗盐水再将心 房注射液稀释至20mL的总体积。
体温由Harvard恒温反馈控制单元(控制电加热毯的直肠温度传感 器)保持恒定在38度。将用于压力测量和监测心输出量(BaxterVigilance 连续心输出量(ContinuousCardiacOutput，CCO)监测器)的 Swann-Ganz导管经股静脉和腹股沟切口插入肺动脉。将全身动脉压力传 感器导管经相同的切口插入股动脉。将1.4mm的VenflonTM插管插入最 接近肘关节的右头静脉中以注入受试物质。进行中线胸骨切开术，并当进 入胸膜腔时向呼吸器出口施加PEEP。除去前心包膜，通过将余下的心包 膜的边缘与伤口边缘缝合而将心脏悬挂。左心房的心耳进行插管以用于绕 过肺循环注射活化的DP。
在完成了完整的手术止血后和在体外循环开始前，通过单次静脉内注 射肝素(1000i.u/kg体重)以使动物彻底止血。使体外分流(extracorporal shunt)和其相关的管道充满等渗盐水并且在与颈动脉连接之前将所有的 空气从该系统中排出并建立颈静脉导管。
通过将肺动脉压力传感器简略连接至腔室上的侧端口，定期检查声学 测量室内部的压力，使传感器与腔室保持同一高度水平。
在实验过程中没有观察到分流循环中流量或压力的显著偏差，并且在 实验后在分流装置的内部没有观察到纤维蛋白凝块沉积物。因此，抗凝作 用是充分的。
开发了流动系统的数学模型以便根据流入池中的流速和活化的气泡 半衰期以及推注半衰期评估测量池中的峰值浓度。然后可通过改变流动阻 力来调整流速以确保测量池中有足够的剂量。此外，数学模型从测量池中 所观察到的浓度来评估动脉血中活化气泡的浓度。
E3-4结果
图14示出了在校正心输出量、通过池的流量、通过池的时间和活化 的气泡寿命后动脉血液区室中的典型的活化气泡浓度-时间曲线。为了显 示清晰，只将前两分钟进行了绘制。x轴是时间(以秒计)和y轴是动脉 血中的活化气泡群体气体分数(以每百万份计)。
下表7示出了在经静脉内注射后在动脉条件(正常动脉血气饱和、约 60mmHg的液体静压力)下的体积加权的平均活化气泡直径。表中所有 观察值的平均值21.4μm。
表7.动脉条件下，体积加权的平均活化气泡直径
注射# 犬1 犬2 犬3 1 19.7μm 22.2μm 20.5μm 2 21.7μm 22.3μm 21.8μm 3 21.3μm 21.3μm 21.6μm
下表8示出了以声学测量室中气体体积分数衰变的半衰期给出的在 动脉和静脉压力下活化气泡收缩的速率。已经由动脉压的导管/传感器测 量计算了压力，并假设静脉(颈静脉)压力为0。注意到在动脉压力下衰 减更快，这是由在活化的气泡内所有气体的分压升高而引起的，产生更大 的向外气体扩散梯度。
表8.动脉和静脉腔压力和活化气泡的半衰期
动脉血中的活化气泡的直径为20至22微米，正好在预测的范围之内。 在将物质注入左心房并在左心室中活化后，活化的气泡变得稍大，直径为 22至25微米。已经通过与US辐照活化注入样品平行的体外分析获得所 有动物中正确的测量和计算的验证。
E3-5结论
实施例3证实了该组合物在所期望的MI范围内被活化并在静脉内施 用后在体内产生期望尺寸范围内的气泡生长和动力学。
实施例4(E4)-与常规的微泡相比，对活化气泡的沉积性质的活体内显 微镜检和对US辐照响应的建模
E4-1简介
为了进一步研究并证明在体内活化后产生的大气泡的特性，进行了通 过大鼠肠系膜的显微镜检直接观察微循环内的单个活化相转变气泡的研 究。此外，为了描述本发明的大的活化气泡与常规US造影微泡(例如， Sonazoid)的显著差异，进行了对US受声波作用之响应的理论建模。
E4-2所研究的组分和组合物
E1-2详述了这项研究中所研究的组合物。
E4-3方法
在该研究中使用雄性Wistar大鼠。以1mLDP/kgb.w.(即，4μL/kg b.w.微滴和8μL/kgb.w.微泡)静脉内施用组合物。进行全身麻醉并用静 脉内和肌内戊巴比妥钠来维持。对大鼠进行插管并将导管插入尾静脉或颈 静脉施用受试制剂。施加超声以活化肠系膜中的簇。通过垂直中线切口打 开腹部，然后将大鼠横向放置具有盖玻璃圆窗的塑料板上，并将从腹内取 出的肠系膜放置在盖玻璃窗口上。在37℃下，用Krebs-Ringer缓冲液灌 注伸展的肠系膜。在显微镜的物镜下直接向取出的肠系膜施加超声。使用 配备有线性探针(7.5L40)的超声扫描仪(Elegra；Siemens，Seattle，WA) 进行超声暴露。对应1.2的MI值，将输出功率设定为最大值。在超声换 能器和胸壁或肠系膜之间施加声纳凝胶。在S-VHS或DV带上记录图像 用于后续检查。
使用由LarsHoff开发并在AcousticCharacterisationofContrast AgentsforMedicalUltrasoundImaging，KluwerAcademicPublishers， 2001，第8章中描述的非线性气泡模型对受模拟声波作用后本发明的活化 气泡和常规HEPS/PFB微泡(用水重构的C1)的体积变化进行建模。对 于活化相转变气泡的模拟参数：在血液中，8个周期驱动脉冲，MI为0.2， 频率为0.5MHz，和30微米的静止直径(restingdiameter)。对于 HEPS/PFB微泡模拟参数：在血液中，8个周期驱动脉冲，MI为0.2和频 率为5MHz，和3μm静止直径。
E4-5结果
未进行超声活化：
使用了两只动物。在进行6次注射后，在肠系膜微循环中没有观察到 大的相转变气泡。
超声活化：
使用了三只动物。在所有注射后观察到大的活化气泡。仅在应用超声 后才观察到活化气泡。可以实时观察到活化的相转变气泡的生长阶段。在 几秒钟之内活化气泡的核沿着微脉管系统生长，血流被阻断。没有观察到 微血管的扩张。活化的气泡逐渐缩小，并在微脉管系统中间歇地推进。所 有活化的相转变气泡均比红细胞大并停留在微血管中且暂时阻止血流。所 有活化的气泡是非球形的，并且显现椭圆形，相对于微血管截面而形成。
图15示出了在肠系膜中活化的相转变气泡的视频帧：(左上)在微血 管中注射后17秒，阻断血流；分别为(右上)5分19秒，(右下)5分 45秒。活化的相转变气泡(由箭头表示)在其完全清除之前，逐渐缩小 并在微血管中通过间歇地停留和移动而前进。图15(左下)示出了在图 像(左上)指示的虚线矩形框的5倍放大示意图。用C中所示的20微米 比例尺示出了相转变气泡的轮廓(A)。假设气泡为圆柱形，测量长度为 30微米和宽度13微米，得到3982立方微米的体积，相当于20微米直径 的球形气泡，与在E3中详述的结果完全一致。按比例示出了HEPS/PFB 微泡(B)。这些常规的US造影微泡在微脉管系统中明显地自由流动并且 不与内皮壁接触。
模拟暴露于超声场时的气泡动力学：
结果示于图16。当响应于强劲的超声场而振荡时，相转变气泡的最 小直径为22.8微米且最大直径为36.4微米。当响应于强劲的超声场而振 荡时，HEPS/PFB微泡的最小直径为2.3微米且最大直径4.1微米。诱导 相转变气泡的绝对体积变化比HEPS/PFB微泡大约三个数量级。
E4-5结论
当应用超声活化时，观察到约20μm尺寸的活化相转变气泡。当不 应用超声活化时，则没有观察到活化相转变气泡。活化相转变气泡被暂时 (5-19分钟)沉积在微循环中，但是随着其尺寸变小而移动。
在US受声波作用过程中，相转变气泡的体积变化的模拟显示出比 HEPS/PFB微泡的响应大三个数量级，表明通过相转变气泡施加在组织上 更大数量级的机械功。
实施例5(E5)-制剂研究
E5-1简介
如从E1可明显看出，本发明人刻意选择将制剂研究集中在C2中的 变化上。这是为了研究对DP制备后形成簇的能力的一般作用，并由此获 得对簇特性的控制并阐明其重要性。有理由假设E1中所示的一般的制剂 外观/效果适用于很多种微泡/微滴制剂系统。为了显示该情况，对于制备 簇组合物和随后的活化，已经测试了六个市售的微泡制剂。
此外，在本实施例中阐明了本发明的两个重要方面：药物制剂在避免 自发活化(如WO99/53963中所示)方面的稳定性和用治疗剂装载微滴的 能力。
E5-2来自市售微泡制剂的簇组合物
为了显示本发明的概念适用于很多种微泡制剂，通过显微镜检/图像 分析测试了由E1-2中详述的C2和六种市售的微泡产品作为C1制成的 DP的簇含量，并通过声学测量测试了活化气泡体积和直径。在9中详述 了作为C1研究的微泡组分以及供应商、气体芯组成、稳定化膜和药用形 式。
表9.作为C1所测试的市售的微泡制剂
1制造商没有公开其精确的化学组成。
对于冻干形式，如在E1-2中详述的进行簇组合物的制备，用在各制 剂的包装插页中所详述的C2体积(对于Sonazoid为2mL，对于Sonovue 为5mL并且对于Micromarker为0.7mL)重构C1。对于Optison和 Definity，在隔离微泡后通过去除下层物(infranatant)来分离产品小瓶 中的微泡，并通过在均质化之前向小瓶中添加相同体积的C2来制备簇组 合物。对于Polyson，将0.5mL的均质化C1与0.5mL的C2混合。
表10中示出了各簇组合物中的簇含量以及活化气泡的体积和直径的 结果。E1-2中详述的C1组分与商用造影剂Sonazoid具有相同的配方和 形式，因此，可以预期当这两种试剂当用作C1时会产生具有相似特征的 簇组合物，如通过表11中所示的结果所证实的。在所研究的其他5种商 用微泡产品中，除Definity之外的所有产品均产生具有大量簇的簇组合 物，其在US辐照后被活化并显示出大的活化气泡体积。Micromarker、 Optison、Sonovue和Polyson，尽管在气体芯和稳定化膜的化学组成上显 示出大的差异，但是显示出的其各自簇组合物的特性与用E1-2详述的 Sonazoid和C1制备的那些相当。虽然不希望受到理论考虑的限制，但是 可以认为Definity微泡与C2中的微滴不能形成簇的原因是在稳定化膜中 使用了PEG-DDPE组分。该组分可在微泡的周围产生厚的致密水层(dens layerofwater)，从而屏蔽对C2的微滴的静电吸引。当使用测量范围为 0.5至40μm的50×物镜时，这项研究中一项另外的发现是在由Sonovue 和PolySonL制成的簇组合物中观察到大量小于3μm的簇。与在E1-2 中详述的C1、Sonazoid或Optison相比，这些微泡剂含有大量的小微泡。 在由Sonovue和PolySon制成的簇组合物中，观察到由～1μm的微泡 和～1μm的微滴形成的显著比例的簇，并且这些显然有助于US辐照后 的活化气泡体积。因此，根据本发明认为尺寸范围1至10μm的簇是有 功能的。
表10.使用多种市售微泡制剂作为C1制备的簇组合物的簇含量和活化气 泡体积
如上报道的这些结果表明在有关气体芯的组成和有关稳定化膜的组 成两个方面，本发明的概念适用于很多种C1制剂。
E5-3自发活化和US活化
制剂的基本性质指向系统的不稳定，即US诱导的由微泡和微滴组合 产生大的相转变气泡。在体内和靶位点(病理部位)，这种不稳定性必须 以受控的方式出现，制备DP后或施用后立即(即，没有声波作用)自发 生长(活化)对于本发明的功能是不利的。WO99/53963仅探讨了两种组 分的共施用，但指出如果组分在施用之前被混合，避免该系统的这种自发 活化很可能需要在C1和C2组合后在高压或低温下储存。本发明人曾试 图消除这些明显繁琐和限制性需求以提供在环境条件下稳定的制剂。如 WO99/53963中所指出的，基于理论评估，自发活化很可能是油相的沸点 (b.p.)和其蒸气压(v.p)的函数。然而，该专利的作者并没有确定这样 的可能性，即在组合C1和C2后，油相的水溶解度可能是自发不稳定和 气泡生长甚至更重要的贡献者。为了阐明这些关系以及为这一问题提供解 决方案，筛选了大量具有广泛b.p.、v.p.和水溶解度的微滴相组分(氟碳 油)并用于生产C2。然后将这些样品与C1组合，并评估自发活化的和 US活化的气泡的含量。下以描述了这些样品的制备和分析。
称量641mg的二硬酯酰磷脂酰胆碱(DSPC)和73mg的1，2-二硬脂 酰基-3-(三甲铵)丙烷氯化物(DSTAP)加入250mL圆底烧瓶中，并添加 50mL氯仿。将样品置于热自来水下加热直至获得澄清的溶液。在350 mmHg和40℃下，通过在旋转汽化器上蒸发至干燥以除去氯仿，随后在 50mmHg下在干燥器中进一步干燥过夜。此后，添加143mL水，并且 将烧瓶再次置于旋转汽化器上并通过最大旋转速度和80℃的水浴温度将 脂质再水化25分钟。将样品放置在冰箱中过夜。将脂质分散体转移到合 适的小瓶中并在冰箱中储存直至使用。
通过将1mL冷的脂质分散体的等量份转移至2mL色谱小瓶中来制 备乳液。向七个小瓶的每个瓶中添加100μL如表11所详述的氟碳油。在 CapMix(Espe，GmbH)上将色谱小瓶摇动75秒。立即将小瓶在冰中冷 却、合并并保持冷态直至使用。进行库尔特计数器分析以确定微滴的体积 浓度，然后将乳液用水稀释至10μl/mL分散相。
在2mL的水中重构C1(如E1-2所详述的)并在10mL试管中与制 备的C2样品一起混合以到达10∶1的比例，并用手小心摇动。然后用7mL 水稀释该混合物。通过E1-4中所述方法的手册版本中的显微镜检评估样 品中自发活化和US活化气泡。2分钟后，将1mL这种溶液转移至温度 稳定在37℃的显微镜小室中。设置小室以使可使用中心频率为2.25MHz 的ATL3-2换能器向样品施加US声处理。在200×放大下扫描整个小室区 域并通过目视检查半定量地评估大的(＞～15μm)自发活化气泡的含量。 对于每个样品，给出0至2范围内的得分，其中0表示“没有观察到或很 少有大的相转变气泡”，1表示“观察到中等数目的大的相转变气泡”和2 表示“观察到大量的大的相转变气泡”。然后，将样品在标称MI为0.8 下受声波作用5秒，对大的US活化气泡进行计数并以相同的方式进行评 分。在表11中详述了本研究的结果以及所研究化合物的物理化学特性。
表11.所研究的化合物及其物理化学特性：沸点(b.p.，℃)、在20℃下 的蒸气压(V.P.，torr)以及水溶度(摩尔溶解度的对数)。将自发活化和 US活化气泡的量的评估结果进行了比较。0分＝无或非常有限，1分＝中 等，2分＝高。
表11中列出的数据表明自发活化的水平与b.p.或v.p.没有显著相关 性，但与油组分的水溶解度显著相关，与US活化的水平也是如此。图17 示出了水溶解度相对于自发和US活化得分。如可以看出，随着水溶解度 的降低观察到自发活化气泡的形成显著降低，而随着水溶解度的降低观察 到US活化气泡的水平显著提高。这些结果表明，通过使用水溶解度低于 约1·10-5M的C2油组分稳定可以针对自发活化稳定DP，并且US活化的 水平也受益于低于该水平的水溶解度。但是，注意，如图E5-4所示，大 部分的乳液微滴组分可由具有较高的水溶解度的组分(例如，添加用于提 高药物荷载的潜溶剂)构成，而不导致自发活化的提高或US诱导活化的 降低。
E5-4药物荷载和潜溶剂
在本发明的一个方面中，向微滴油相添加治疗性化合物用于活化后在 体内靶部位释放。为了阐明实现这种加载的概念，进行了一系列制剂研究。 这些研究简要总结如下。
基于E5-3中报道的多种组分的筛选研究，以及例如易于乳化、乳液 的稳定性、可用性、质量等额外响应，选择全氟甲基环戊烷(pFMCP) 作为主要的油成分用于制备C2，其具有二硬酯酰磷脂酰胆碱(DSPC)稳 定化膜，所述稳定化膜添加了硬脂胺(SA)以使带有正表面电荷。作为 对药物加载研究的起点，对pFMCP中的不同溶质(药物和用于光学成像 的发色团)和一系列其他油组分的溶解度进行了理论评估。使用用于评估 溶剂溶质相容性的最先进软件Hansensolubilityparameters，HSPiPv.4 (StevenAbbottTCNFLtd.)进行该评价。HSPiP分析计算与物质之间相 容性相关的三个基本特性：极性、分散力和氢结合，以及在例如溶剂和溶 质之间这种三维空间上的距离：Hansen距离(Hd)。在该空间中溶剂和溶 质越接近，溶质在溶剂中的溶解度(相对)更好。汉森理论预测Hd＜8表 示可溶性“溶剂中溶质”对，8＜Hd＜12表示部分可溶性以及Hd＞12表 示非可溶性。对于1)一系列基于沸点＜65℃、水溶解度＜0.1M以及可能 生物相容性(毒性)选择的具有大范围的汉森参数的溶剂，和2)适于光 学成像的一系列靶溶质、化疗药物和分子进行了这种分析。根据规定的溶 剂选择标准，优选的溶剂是所有的部分卤代的烃。实验测定了溶剂之间的 混溶性和溶质在一种溶剂中的溶解度。在表12中示出了本研究的结果。 除了那里所示的数据之外，发现氯三氟丙烷(CltFPr)和二氯二氟乙烷 (dCldFEt)在pFMCP、二氯甲烷(dClMe)和三氯甲烷(tClMe)中是 完全混溶的。
表12.溶剂的理化性质：沸点(b.p.)、蒸汽压和水溶解度(摩尔溶解 度的对数)和靶分子、pFMCP和tClMe的汉森距离(Hd)以及在tClMe 中的混溶性/溶解度(参见正文)。
1DiIC18(7)(1，1’-双十八烷基-3，3，3’，3’-四甲基吲哚三碳菁碘化物(LifeTech.Ltd)
2实验性极光激酶抑制剂(SelleckchemLtd.)
如从这些结果可以看出，鉴于所计算Hd与预测的溶剂之间的混溶性 匹配的相当好，所以它不是tClMe中多种靶分子绝对溶解性的良好预测 者。这表明，汉森分析是评估多种溶剂体系中给定分子的相对溶解度的主 要工具，而不能用于评估多种溶剂体系中多种化合物的绝对溶解度。
对于表12中列出的7种物质，在tClMe中测得的溶解度也与LogP 和LogS的文献值相关联。然而，正如预期的，该分析表明在tClMe中的 溶解度是亲脂性的函数，这些特性不能预测绝对溶解度。logP＜0.9和 LogS＞-2.7的物质没有显示出或显示出非常低的溶解度，但对于logP在 3.2至3.9范围内的物质，溶解度在50mg/mL至350mg/mL之间变动， 与logP没有协方差，对于logS在-3.7至-5.2范围内的物质，溶解度在20 mg/mL至350mg/mL之间变动，与logS没有协方差。
这些评价表明，鉴于亲脂性物质是优选的，所以需要通过实验测试任 何特定的治疗剂与本发明之间的相容性。
在pFMCP中，表12中的靶分子都没有显示出任何可测量的溶解度， 因此，必须使用潜溶剂以实现功能装载容量。因为在pFMCP中d-ClMe 和t-ClMe的混溶性仅为约10％，所以指明“溶剂阶梯”构建，即，汉森 空间中tClMe和pFMCP之间使用第三溶剂。基于这些考虑，选择 pFMCP、ClrFPr和pFMCP的1∶1∶1(体积比)混合物用于对装载有治 疗化合物或光学成像化合物的C2进行进一步研究。
在pFMCP、ClrFPr和pFMCP的1∶1∶1的混合物中评估了尼罗红 (NR)、DiR和紫杉醇(Ptx)的溶解度，结果分别为＞5mg/mL、＞10mg/mL 和＞25mg/mL。此外，开发了所述装载Ptx的三种溶剂1∶1∶2的混合物。 该溶剂混合物中Ptx的溶解度为＞50mg/mL，表明通过改变油相的组成可 显著提高装载容量。如下详述制备了具有三种组分1∶1∶1的混合物的C2。
通过将称重250mg具有3％mol/mol的SA的DSPC加入100mL圆底烧瓶中的50mL水中，在80℃下水化30分钟，并使其冷却来制备含脂质分散体。称重Xmg物质(对于NR、DiR和Ptx，X分别为5mg、10mg和25mg)并溶于333μL的tClMe(溶液A)中。用333μLCltFPr+333μLpFMCP(溶液B)稀释333μL的溶液A。向1.5mL离心管中添加900μL的脂质分散体。向离心管中的脂质分散体添加100μL的溶液B。使用DentalHL-AHG7混汞器(amalgamator)在3200rpm下运行20秒实现乳化。将所得的乳液以25g离心5分钟。离心后，微滴形成清晰的沉积层。小心地除去上清液(含有过量的脂质囊泡)，添加等体积的5mMTRIS水溶液并通过手动摇动使微滴再分散。进行库尔特分析和基于所检测到的微滴体积浓度，将5mM的乳液稀释至3μL微滴/mL。
用显微镜检和库尔特分析评估所得的C2样品。图18示出了显微镜 检评价的显微照片。对于所有的样品，观察到微滴尺寸在靶范围1μm至 5μm内的稳定乳液。此外，装载物质明显以溶解状态包含在微滴内；没 有观察到多余的-囊泡材料，并且微滴澄清且均匀着色，没有沉淀的迹象。 对于所有样品，库尔特分析表明约3μL微滴/mL的中值尺寸为约3μm。
如E1-2中详述的，这些C2样品随后与C1一起制备DP，通过库尔 特计数评估反应性，通过显微镜检评估成簇以及通过声学测量评估活化的 气泡尺寸和体积。对于所有样品所观察到的反应性在40％-70％的范围内， 显微镜检证实了存在簇，但没有显示出自发活化的证据，活化气泡的体积 在100至200μL/μL微滴的范围内且活化气泡的尺寸在42至48μm的范 围内。这些结果表明：
●微滴油相可包含一系列溶剂以便获得可接受的药物装载容量。为 此，部分卤化烃是特别有用的。
●显著比例(例如，＞60％v/v)的溶剂比E5-2所示(＜1·10-5M)可 具有显著更高的水溶解度(例如，＜1·10-1M)。
●这些制剂保留了在簇组合物中形成簇的概念的关键属性、在受声波 作用后其被活化的能力以及缺少自发活化。
如上所述装载有DiR的C2样品被用于评估体内递送(参见E8)。如 上所述装载有NR的C2样品被用于评估活化后装载物质的显现(参见 E6)。
实施例6(E6)-活化后装载物质的显现
E6-1简介
为了研究装载入C2的微滴中的分子物质在簇组合物活化后如何显 现，进行了荧光显微镜检研究。将其中C2中的微滴已经装载了尼罗红 (NR)染料的簇组合物活化并通过荧光显微镜检进行研究。
E6-2化合物和方法
使用如E5-4中详述的装载有5mg/mL尼罗红染料的C2来制备如 E1-2中详述的簇组合物。将簇组合物在水中稀释，置于显微镜孔中并使 用VscanUS扫描器(GEHealthcare)活化。
使用LeicaTCSSP8共聚焦显微镜获得活化的簇组合物的图像。所使 用的物镜是数值孔径为0.95的HCXIRAPOL25X水浸物镜。通过可调谐 的白光激光器在539nm激发荧光染料。通过混合检测器(HyD)检测 570-670nm范围内的发射。所使用的激光速度为400Hz并且针孔直径被 设为1AU。在另一台检测器中同时获得透射图像，透射图像可能与荧光 图像重叠。通过在z方向上逐步移动物镜的换镜旋座(nosepiece)而获得 的样品的交集和3D图像。
E6-3结果
图19示出了DP活化后，相转变气泡的交集的荧光显微镜照片，其 中C2微滴组分装载有5mgNR/mL。
如从该图中可以看出，活化后，所加载的NR出现在液/气界面上。 在体内活化后，如果装载了治疗物质，这样的物质将与内皮壁紧密接触， 因此易于外渗。
实施例7(E7)-肿瘤中活化气泡的沉积
E7-1简介
为了进一步研究并证明肿瘤模型中活化后产生的大气泡的特性，对鼠 模型的皮下前列腺癌PC-3肿瘤异种移植物中的活化相转变气泡进行成像 研究，证明了与自由流动的HEPS/PFB微泡在沉积性质和造影增强动力 学方面的显著性差异。
E7-2所研究的组分和组合物
E1-2中详述了这项研究中所研究的组合物。
E7-3方法
使用了16只雌性BALB/c裸小鼠。在肿瘤植入前，将小鼠称重，用 异氟烷麻醉，并进行耳标记。将含有3·106个PC-3细胞的100μL细胞悬 液经皮下缓慢注射到臀部和膝部之间的左后腿的侧面。
通过皮下注射芬太尼(0.05mg/kg)、咪达唑仑(5mg/kg)和美托咪 定(0.5mg/kg)的混合物对小鼠进行外科麻醉。将静脉插管(BD NeoflonTM24GA)置于尾静脉中。通过注射少量(～20μL)的0.9％的 注射用氯化钠证实通畅，之后注射少量(～10μL)的肝素(10U/mL)以 防止凝血。套管的中心填充有0.9％的注射用氯化钠以清除任何死腔，并 用盖子封闭。用手术胶带将插管固定至尾巴。
使用三种商业超声成像系统。用带有MS250换能器(16-18MHz) 的高频小动物成像系统VEVO2100(VisualSonicInc.)对所有实验的肿 瘤进行成像。用设置MI为0.28的VividE-9临床成像系统(GE Healthcare)的2MHz成像探针，或设置标称MI为0.8的Vscan1.2临床 成像系统(GEHealthcare)的2MHz成像探针在体内活化簇组合物。
将16只动物分成4组，每组4只动物。在表13中列出了每组的活化 系统和剂量。
表13.所研究的组与活化方法和剂量
组 活化 剂量 1 Vivid E9，MI 0.28 1.5μL/kg pFMCP+4μL/kg HEPS/PFB 2 Vscan，MI 0.8 1.5μL/kg pFMCP+4μL/kg HEPS/PFB 3 Vivid E9，MI 0.28 6μL/kg pFMCP+16μL/kg HEPS/PFB 4 Vscan，MI 0.8 6μL/kg pFMCP+16μL/kg HEPS/PFB
将所准备的小鼠置于操作台的右侧(温度控制设置为37℃)。将左腿 水平提起，用一块布支持，并用手术胶带固定。超声凝胶完全施加至肿瘤 并将水浴袋置于肿瘤之上。用VisualsonicsVevo2100成像系统进行成像， 将换能器置于水浴中，成像换能器控制在固定的扫描平面。用另外一台换 能器(VividE9或Vscan)从注射簇组合物开始持续75秒进行簇组合物 的活化。
簇组合物的活化产生在超声图像中保持静止几分钟的造影回波。对扫 描平面中肿瘤图像的每个单位面积内的静止造影信号的数目进行计数。假 定扫描平面厚度为0.2mm，推导出每单位肿瘤体积的相转变回波数目。
E7-4结果
在超声图像中肿瘤是低回声的。在图20中示出了预先注射簇组合物 (左图)和之后注射簇组合物并活化(右图)两者的典型肿瘤图像，显示 了在活化后存在静止的相转变回波(右图)。表14示出了每毫升肿瘤组织 中所估计的静止相转变造影回波的数目。所有的肿瘤均显示静止造影回波 的沉积。这些回波被称为静止的是因为它们在超声图像中保持静止几分 钟。应用Vevo2100成像系统的突发序列(burstsequence)(其目的是破 坏常规的造影微泡，例如HEPS/PFB)不破坏静止回波。这与相转变气泡 由于其尺寸较大不被突发序列破坏的理论预测一致，并证实了静止造影回 波不是由组合物中的HEPS/PFB微泡产生的。图21示出了与仅有等效剂 量的HEPS/PFB微泡(在图中标记为B)相比，相转变气泡(图中标记 为A)在肿瘤区域内典型的集成造影增强动力学。这表明相转变气泡与 HEPS/PFB微泡相比的动力学差异，即，沉积性与自由流动性。自由流动 HEPS/PFB微泡增强是更加短暂的。相转变气泡的造影示出了沉积在肿瘤 中并保持数分钟的静止回波。
表14.每mL肿瘤组织中估计的相转变静止回波的平均数和标准差(SD)。
组 每mL的平均数 SD 1(MI 0.28，低剂量) 3685 2188 2(MI 0.9，低剂量) 6675 1701 3(MI 0.28，高剂量) 10705 6394 4(MI 0.9，高剂量) 12597 7884
对活化的剂量和类型(VividE9或Vscan)应用了双因素方差分析。 剂量在统计学上具有显著性差异p＝0.024，并且活化换能器具有非显著性 差异，p＝0.352。
E7-5结论
用两个不同的临床成像系统(具有2MHz探针和MI为0.28的Vivid E9和具有2MHz探针和MI为0.8的Vscan)活化簇组合物，并用高频 (16-18MHz)小动物超声成像系统对肿瘤进行成像。所有的步骤在肿瘤 中都产生静止的造影回波。与HEPS/PFB微泡中的暂时造影不同，这些 造影回波在超声图像中保持静止几分钟。它们不被旨在破坏HEPS/PFB 微泡的突发成像序列破坏。这些观察结果与在肿瘤组织中相转变气泡沉积 一致。当用具有0.28至0.8MI的不同临床成像系统活化时，观察到统计 学上显著的剂量响应(p＝0.24)，沉积的量在统计学上没有统计学上的差 异(p＝0.352)。
实施例8(E8)-共注射的或装载的物质向肿瘤的递送
E8-1简介
为了证明本发明提高体内分子递送的能力，在小鼠PC-3异体移植物 肿瘤模型中进行研究。探究了三种模型系统：共注射DP和伊文思蓝 (EvansBlue)染料、共注射DP和LicorCW800EPR剂和注射DP(其 中DiR-染料已装载进微滴组分(C2)中)。伊文思蓝是当静脉内注射后与 白蛋白结合的荧光染料。在生理条件下，内皮细胞不能透过白蛋白，伊文 思蓝结合的白蛋白仍然被限制在脉管系统内。因此，在药物递送研究中伊 文思蓝常被用作模型化合物[Bohmer等，JControlledRelease，148，第1 期，2010，第18-24页]。渗透性增强和滞留(Enhancedpermeabilityand retention，EPR)是肿瘤脉管系统的共同特点。在肿瘤微环境中血管内皮 通常是不连续的，允许分子扩散进入周围的肿瘤组织。市售的(LI-Cor BiosciencesInc.)IR染料800CWPEG造影剂(25-60kDa)是一种由于 EPR效应而在肿瘤中积累的非特异性成像剂。DiR染料是市售的(Life Technologies，ThermoFisherScientificInc.)近IR荧光、亲脂性碳菁 DiOC18(7)染料，其在水性条件下荧光较弱，但是当并入例如细胞膜时 是荧光较强且是光稳定的。因此，提取和定量组织中伊文思蓝并用800CW PEG和DiR染料进行光学成像的标准技术被用作证明本发明体内药物递 送的模型化合物。
E8-2所研究的组分和组合物
在E1-2(共注射模型)和E5-4(DIR装载)中详述了这项研究中所 研究的组合物。
E8-3方法
在研究中使用雌性Balb/c裸小鼠。肿瘤植入前，将小鼠称重，用异 氟烷麻醉，并且进行耳标记。将含3·106个PC-3细胞的100μl细胞悬液 皮下缓慢注射到臀部和膝部之间的左后腿的侧面。
通过皮下注射芬太尼(0.05mg/kg)、咪达唑仑(5mg/kg)和美托咪 定(0.5mg/kg)的混合物对小鼠进行外科麻醉。将静脉插管(BD NeoflonTM24GA)置于尾静脉中。通过注射少量(～20μL)的0.9％的 注射用氯化钠证实通畅，之后注射少量(～10μL)的肝素(10U/mL) 以防止凝血。套管的中心充满0.9％的注射用氯化钠以清除任何死腔，并 用盖子封闭。用手术胶带将插管固定至尾巴。
将小鼠的后肢置于水浴中，摆放两个US换能器进行受声波作用。通 过具有2MHz探针和0.8标称MI的Vscan提供簇组合物的超声活化。使 用500kHz的定制换能器(ImasonicSAS)施加随后的超声暴露，在MI 为0.1至0.8的范围内，进行8个周期的脉冲，脉冲重复频率为1kHz。
伊文思蓝
注射50μl的伊文思蓝(50mg/kg)，之后立即注射每mL含有标称 1.5μLPFMC微滴+4.0μLHEPS/PFB微泡，或每mL只含4.0μL的 HEPS/PFB微泡的50μl簇组合物。通过具有2MHz探针的Vscan临床超 声扫描仪从注射时间开始扫描45秒提供活化。这之后在0.1或0.2的MI 下500kHz超声辐照5分钟。治疗后30分钟，处死动物，获得组织样品： 肿瘤、经处理腿的大腿肌肉以及未处理对侧腿的大腿肌肉，提取并定量伊 文思蓝含量。每组中测试三只动物，均使用Vscan探针进行45秒活化。 在表15中给出了组和变量。
表15.共注射伊文思蓝染料所研究的组、US方法和测试项目。对所有动 物进行US活化，每组三只动物。
LiCorCW800EPR剂
以5nmol/kg体重的剂量施用LiCorCW800EPR，之后立即施用每 mL含有标称1.5μLpFMCP微滴+4.0μLHEPS/PFB微泡的50μL簇组合 物。通过具有2MHz探针的Vscan临床超声扫描仪从注射时间开始扫描 45秒提供活化。这之后接着在MI为0.2下进行5分钟的500kHz超声辐 照。在施用后，用Pearl脉冲成像系统进行长达12小时的全身落射萤光 成像。表16中给出了动物组和数目。
表16.共注射LiCorCW800所研究的组；US方法。所有的动物都给 予簇组合物。
组 #动物 活化 随后的US辐照 1 3 无 无 2 4 45秒 无 3 5 45秒 MI 0.2，5分钟
在落射荧光图像中的肿瘤上画出目的区域并计算平均强度。在未处理 的对侧大腿上的同一位置也画出相同大小的目的区域。计算肿瘤区域平均 图像强度的无量纲比(dimensionlessratio)除以未处理腿的平均图像强 度。计算这个比值曲线下面积，并从1分钟至1小时的时间点进行积分。
装载DiR的簇组合物
施用每mL含有装载有10mg/mLDiR染料的标称1.5μLpFMCP微 滴+4.0μLHEPS/PFB微泡的50μL簇组合物。通过具有2MHz探针的 Vscan临床超声扫描仪从注射时间开始扫描45秒提供活化。这之后在MI 为0.2下接着进行5分钟500kHz的US辐照。向动物的带有肿瘤的左腿 施加超声场。对照组接受相同的装载DiR的簇组合物以及处理方法，但 没有进行超声暴露。在表17中给出动物组的详细说明。
表17.用注射装载DiR的簇组合物所研究的组；动物数目和US方法。所 有动物均给予簇组合物。
组 #动物 活化 随后的US辐照 1 3 无 无 2 4 45秒 MI 0.2，5分钟
以标准化图像采集在预注射和处理后1分钟(约注射后7分钟)两种 情况下用Pearl脉冲荧光成像系统获得落射荧光图像以允许进行定量对 比。在左侧大腿的肿瘤上画目的区域，并且在没有肿瘤的右侧大腿上在约 相同大小和解剖学位置处绘制同样大小的目的区域。记录区域中的平均荧 光强度。作为主要响应，评估注射前图像和处理后图像之间荧光强度的差 异。对带有肿瘤与没有肿瘤的腿以及US辐照与无US辐照的因素进行双 因素方差分析。
E8-4结果
伊文思蓝
从组织样品中提取并定量伊文思蓝(mg/mL组织)。对每只动物，用 经处理的大腿肌肉中的浓度除以未处理的大腿肌肉中的浓度(匹配的一 对)来提供在经处理的肌肉中摄取提高的无量纲比。对表18中给出的数 据和结果应用单因素方差分析。在用活化的簇组合物处理，随后施加低频 的腿中伊文思蓝的摄取在统计学上显著地提高了近2倍。对于其他组，在 统计学上没有观察到摄取的显著提高。
表18.在不同的组中，经处理和未处理的肌肉组织的摄取率(平均值和标 准差)。
组 平均值 SD 1-簇组合物，活化和随后的US辐照 2.0 0.3 2-簇组合物和仅活化 1.3 0.4 3-HEPS/PFB微泡，活化和US辐照 1.1 0.2
肿瘤样品来自组1和2。伊文思蓝浓度除以未处理的大腿肌肉组织样 品中伊文思蓝的浓度以提供描述摄取提高的无量纲比。假设样本方差相 等，应用2样本t检验。结果示于表19中。与未处理的大腿肌肉组织相 比，活化后应用500kHz超声的肿瘤的摄取提高为3.4比1，而在活化后 没有应用500kHz超声的肿瘤的摄取提高为约2比1。
表19.在不同的组中，经处理的组织和未处理的组织的摄取比(平均值、 标准差和平均值的标准误)。
组 平均值 SD SEM 1-簇组合物，活化和随后的US辐照 3.4 1.0 0.4 2-簇组合物和仅活化 2.0 0.4 0.2
光学成像与LiCorCW800EPR造影剂
在图22中示出了组1的动物(左图；进行活化和随后的US辐照) 和组3的动物(右图；没有活化，没有随后US辐照)的典型的落射荧光 图像。箭头指示肿瘤的位置。为了直接比较，用相同的Pearl成像系统扫 描仪设置拍摄图像，并用相同的荧光强度线性灰度等级呈现。在两种动物 中的肿瘤具有大致相同的位置和尺寸。
图23示出了在处理后1分钟至9个小时肿瘤的荧光强度与未处理的 对照腿强度的比。与组1(菱形；没有活化，没有后续的US辐照)相比； 组2(正方形；仅活化)中的初始摄取在统计学上提高，并且与组1和组 2相比，组3(圆圈；活化和随后的US辐照)中初始摄取和摄取率在统 计学上提高。
计算肿瘤区域中平均强度与未处理的腿的平均强度之比以产生无量 纲的目标与背景(TBR)比，且对处理后1分钟至1小时的TBR曲线下 的面积进行积分。对于所有动物在1分钟、30分钟和60分钟的时间点进 行成像。在表20中列出了结果。图24示出了组1、2和3的平均值和估 算的标准误，在图中分别标记为A、B和C。
表20.在不同的组中，对于经处理的肿瘤组织和未处理的大腿组织TBR 摄取比(平均值和标准差)曲线下的面积(AUC)。
组 平均AUC SD 1-没有活化，没有随后的US辐照 63.7 4.5 2-仅活化 77.0 7.3 3-活化和随后的US辐照 94.0 7.5
对三个处理组应用方差分析得到P值＜0.001。组1和2之间进行对比 的p值为0.037，组2和3之间p值为0.005。因此，在组1和2之间以及 组2和3之间曲线下面积存在统计学上的显著(在0.05水平)提高。
簇组合物的DiR加载的微滴组分
在图25中示出了没有接受超声辐照的第1组动物(标记为A)，和向 左侧荷瘤腿进行活化和随后的US辐照的第2组动物(标记为B)的典型 的处理后荧光图像。在表21中示出了左腿(带有肿瘤)和右腿的荧光强 度的平均差，定义为处理后平均强度减去预注射平均强度。
表21.在不同组中来自注射前值荧光强度的平均提高±SD
组 左(肿瘤)腿 右腿 1-没有活化或US辐照 -0.02±0.20 0.17±0.19 2-活化和随后的US辐照 2.83±0.57 0.23±0.31
当应用超声活化和随后的辐照时，对于荷瘤腿的荧光强度的提高之双 因素方差分析得到P值＜0.001。这些结果表明加载进入微滴组分(C2) 的油相中的荧光染料分子的定位递送和摄取。
E8-5结论
与簇组合物共注射后，随后US活化和进一步US辐照将伊文思蓝染 料递送至肌肉和肿瘤组织具有统计学上的显著提高(在0.05水平)。观察 到与没有进行活化和没有后续US辐照相比，在经处理的肌肉组织中伊文 思蓝几乎加倍。仅施用HEPS/PFB微泡并应用活化以及随后超声暴露， 没有观察到伊文思蓝的递送有显著的提高。与未经处理的肌肉组织相比， 在仅活化后肿瘤组织中的摄取提高了2倍，在活化和随后的US辐照后提 高了3.4倍。
与没有进行超声活化相比，在与簇组合物共注射以及超声活化后，将 LiCorCW800EPR剂递送至肿瘤组织在统计学上有显著的提高。与单独 活化相比，在随后的US辐照和用于增强递送的US辐照后，递送在统计 学上进一步提高。
当在注射簇组合物(其中DiR染料已装载入C2中的微滴的油相中) 后，应用活化和随后的US辐照时，观察到荷瘤腿中荧光强度在统计学上 显著提高。这表明微滴的分子有效载荷的定位递送，证实了对暴露于超声 方法的区域的靶向空间释放和摄取。
实施例9(E9)-组分的制造和簇组合物的制备
在无菌条件下生产两种成分。
C1-由无菌的脂质分散体和无菌气体组分制备微泡的原料分散体 (rawdispersion)。在大容器中将脂质分散体热灭菌，气体经无菌过滤。 完整的生产线经蒸汽灭菌。在胶体磨中原位产生微球体，同时供应脂质分 散体和气体。然后在浮选容器中对中间产物(原料分散体)进行大小分级， 用冻干保护剂的水溶液稀释至指定的微泡浓度，无菌填充并冻干。
C2-由无菌脂质分散体和无菌油组分制备微滴乳液。在大容器中将 脂质分散体热灭菌，油成分经无菌过滤。完整的生产线经蒸汽灭菌。在胶 体磨中原位产生微滴，同时供给脂质分散体和油成分。然后在直列式离心 机(in-linecentrifuge)中对原料乳液进行大小分级，用TRIS缓冲剂的水 溶液稀释至目的微滴浓度并无菌填充。
制造各组分的三个连续批次，并根据Ph.Eur和USP进行无菌性测试。 全部六批都通过无菌测试。
DP-通过用2mL的C2重构C1小瓶，随后通过30秒手动均质化无 菌地制备簇组合物。使用无菌的一次性是用的注射器和针头从C2的小瓶 中抽出2mL。通过C1的小瓶的塞子添加注射器的内容，并将所得DP均 质化。