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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610248646.0 (22)申请日 2016.04.20 (71)申请人 北京大学第一医院 地址 100034 北京市西城区西什库大街8号 (72)发明人 张学智 叶晖 于靖 丰胜利 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 王春霞 (51)Int.Cl. A61K 36/9064(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (54)发明名称 中药组合物在抗幽门螺杆菌中的应用 (57)摘要 本发明公开了中药组合物在抗幽。
2、门螺杆菌 中的应用。 经本发明证明， 中药组合物具有很强 的抗H.pylori活性， 对于与H.pylori密切相关的 急、 慢性胃炎、 胃、 十二指肠溃疡等疾病来讲， 中 药组合物是一个极具开发潜力的药物， 它可直接 用于相应疾病的治疗及其相关药物的制备。 本发 明涉及的中药组合物在制备抗H.pylori药物中 的用途属于首次公开， 其对H.pylori具有很强的 抑制活性， 其可用于H.pylori感染的防治。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 105878900 A 2016.08.24 CN 105878900 A 1.中药组合物在制备预防由幽门螺杆菌引起的疾病的药物中的应用。
3、； 所述中药组合物由下述质量份的原料制成： 黄连6份； 车前草15份； 栀子6份； 蒲公英15份； 豆蔻仁6份； 厚朴10份； 苍术10份； 茯苓15份； 薏苡仁15份； 半夏10份； 杏仁10份。 2.中药组合物在制备治疗由幽门螺杆菌引起的疾病的药物中的应用； 所述中药组合物由下述质量比的原料制成： 黄连6份； 车前草15份； 栀子6份； 蒲公英15份； 豆蔻仁6份； 厚朴10份； 苍术10份； 茯苓15份； 薏苡仁15份； 半夏10份； 杏仁10份。 3.中药组合物在制备抑制幽门螺杆菌生长的产品中的应用； 所述中药组合物由下述质量比的原料制成： 黄连6份； 车前草15份； 栀子6份； 蒲公。
4、英15份； 豆蔻仁6份； 厚朴10份； 苍术10份； 茯苓15份； 薏苡仁15份； 半夏10份； 杏仁10份。 4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用， 其特征在于： 所述中药组合物为煎剂。 5.根据权利要求1-3中任一项所述的应用， 其特征在于： 所述中药组合物为颗粒剂。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105878900 A 2 中药组合物在抗幽门螺杆菌中的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种中药组合物在抗幽门螺杆菌中的应用， 属于医药技术领域。 背景技术 0002 幽门螺杆菌(H.pylori)是一种螺旋形、 微厌氧、 对生长条件要求十分苛刻的细菌。 1983年首次从慢性。
5、活动性胃炎患者的胃黏膜活检组织中分离成功， 是目前所知能够在人胃 中生存的惟一微生物种类。 目前已证实幽门螺杆菌感染与胃腺癌、 胃粘膜相关性淋巴瘤有 着密切的联系， 其中80的胃溃疡都有幽门螺旋杆菌感染； 减少人体对铁质及维生素B12的 吸收。 增加肠道感染的机会； 世界卫生组织已把幽门螺杆菌列为第一类致癌因子， 并明确为 胃癌的危险因子； 导致胃酸减少或缺乏。 可见幽门螺杆菌感染所具有的传染性、 致癌性、 普 遍性和隐蔽性， 对人类健康构成严重的威胁。 因此提供一种防治幽门螺杆菌感染的疾病的 药物十分重要和必要。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种中药组合物在抗幽门螺杆菌中的应用。 。
6、0004 中药组合物可用于制备预防由幽门螺杆菌引起的疾病的药物； 0005 中药组合物还可用于制备治疗由幽门螺杆菌引起的疾病的药物； 0006 中药组合物进一步还可以制备抑制幽门螺杆菌生长的产品； 0007 所述中药组合物由下述质量份的原料制成： 0008 黄连6份； 车前草15份； 栀子6份； 蒲公英15份； 豆蔻仁6份； 0009 厚朴10份； 苍术10份； 茯苓15份； 薏苡仁15份； 半夏10份； 0010 杏仁10份。 0011 所述中药组合物可为煎剂， 可按照下述步骤制备： 取上述11味中药材， 加水煎煮两 次， 每次煎煮水的用量可为2000ml， 合并煎液， 滤过， 浓缩， 终浓。
7、度为每毫升清膏相当于 3.23g饮片； 0012 第一次煎煮的时间可为1.5小时， 第二次煎煮的时间可为1小时。 0013 所述中药组合物可为颗粒剂， 可按照下述步骤制备： 将上述11味中药材的中药配 方颗粒， 并按照上述配比混合后水溶， 浓缩至每克相当于3.87g饮片的复方颗粒； 0014 可根据现有的方法制备各中药材的中药配方颗粒。 0015 体外实验表明， 该中药组合物具有很强的抗H.pylori活性。 中药组合物煎剂及配 方颗粒剂对H.pylori的1个标准菌株(NCTC11637)和5个临床耐药株均具有显著的抑菌效 果， 对H.pylori耐药菌株的最小抑菌浓度(MIC值)分别为煎剂。
8、2mg/ml、 配方颗粒剂4mg/ml， 对H.pylori的临床耐药株及标准菌株NCTC11637的平均MIC值为煎剂8mg/ml、 配方颗粒剂 7mg/ml， 其有效剂量低于临床用药剂量。 0016 中药组合物对H.pylori具有显著的杀菌作用， 且其杀菌效能与药物浓度成正相 关， 不同浓度的中药组合物对H.pylori NCTC11637具有显著的杀菌效果， 剂量越大， 起效越 说 明 书 1/5 页 3 CN 105878900 A 3 快， 效果则越好。 0017 本发明研究结果显示， 中药组合物具有很强的抗H .pylori活性， 说明对于与 H.pylori密切相关的急、 慢性。
9、胃炎、 胃、 十二指肠溃疡等疾病来讲， 该中药组合物是一个极 具开发潜力的药物， 它可直接用于相应疾病的治疗及其相关药物的制备。 0018 本发明涉及的中药组合物在制备抗H.pylori药物中的用途属于首次公开， 其对 H.pylori具有很强的抑制活性， 其可用于H.pylori感染的防治。 附图说明 0019 图1为中药组合物的药物浓度与各时间点的杀菌率的关系图。 具体实施方式 0020 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0021 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0022 实施例1、 0023 1、 材料与方法 0024 。
10、1.1材料 0025 1.1.1实验菌株 0026 H.pylori NCTC11637标准菌株， 临床分离的H.pylori菌株5株。 0027 1.1.2实验用药与主要试剂 0028 中药组合物， 由黄连、 车前草、 栀子、 蒲公英、 豆蔻仁、 厚朴、 苍术、 茯苓、 薏苡仁、 半 夏、 杏仁制成， 它们的质量比(活性成分)为： 6： 15： 6： 15： 6： 10： 10： 1： 15： 10： 10份， 生药饮片 购自北京本草方源药业有限公司。 0029 中药组合物煎剂由北京金象复兴医药股份有限公司白塔寺药店制备： 0030 取上述11味中药材， 加水煎煮两次， 每次煎煮水的用量为2。
11、000ml， 第一次煎煮1.5 小时， 第二次煎煮1小时， 合并煎液， 滤过， 浓缩， 终浓度为每毫升清膏相当于3.23g饮片。 0031 中药组合物配方颗粒剂按照下述方法制备： 将上述11味中药材的中药配方颗粒 (购自北京康仁堂药业有限公司)， 并按照上述配比混合后水溶， 浓缩至每克相当于3.87g饮 片的复方颗粒。 0032 哥伦比亚琼脂(批号： CM0331)、 脑心脊液(批号： CM0225)购自英国OXOID公司， 布氏 肉汤(批号： 3182288)购自碧迪医疗器械(上海)有限公司， 按说明书配制； 脱纤维羊血购自 北京宝特医疗器械有限公司； 胎牛血清(批号： 20140623)购。
12、自北京飞默生物科技有限公司； H.pylori选择性培养琼脂购自生物梅里埃中国有限公司； 微需氧产气袋(批号： CN0025A)购 自北京欣隆福医药销售有限公司。 0033 1.1.3实验设备 0034 超净工作台(上海锐聪实验室设备有限公司)， 恒温培养箱(上海一恒科技有限公 司)， 微需氧培养罐(北京玻璃厂)， 恒温振摇床(上海一恒仪器有限公司)， 液体培养罐购自 英国OXOID公司， 混合气体(85N2、 10CO2、 5O2)。 0035 1.2方法 0036 1.2.1H.pylori培养方法及菌株鉴定方法 说 明 书 2/5 页 4 CN 105878900 A 4 0037 将H。
13、.pylori NCTC11637均匀接种于含有8脱纤维羊血的哥伦比亚血琼脂培养基 中， 采用抽气换气法， 于37微需氧环境下培养23d， 阳性者进行传代培养； 通过观察菌落 形态， 革兰染色， 以及快速尿素酶、 过氧化氢、 氧化酶试验对菌株进行鉴定。 0038 临床菌株的分离培养： 取慢性胃炎或消化性溃疡患者胃镜检查下活检胃黏膜组 织， 充分均浆， 均匀涂布于H.pylori选择性培养基， 于37微需氧环境下培养3-5d， 培养阳 性者接种环挑取H.pylori菌落， 再次涂布于含有8脱纤维羊血的哥伦比亚血琼脂培养基， 37微需氧环境下培养23d， 传代增菌。 0039 1.2.2E-tes。
14、t药敏试验 0040 收取培养4872h的新鲜H.pylori于脑心脊液中， 稀释至3108cfu/ml(1麦氏浊 度)， 取稀释后菌液100ul接种于哥伦比亚血琼脂培养基中， 用L棒均匀涂开， 放置含抗生素 的E-test试纸条， 于37微需氧环境下培养72h， 根据E试纸说明书读取H.pylori对不同抗 生素的MIC值， 判定耐药情况。 0041 1.2.3药物抑菌试验 0042 琼脂稀释法： 收取培养4872h的新鲜H.pylori于脑心脊液中， 将其稀释至3 108cfu/ml， 用1 l接种环将细菌接种于含药琼脂(药物梯度从8,4,20.25mg/ml)平皿， 并 同时接种于无药培。
15、养基作为对照。 接种后置于37微需氧环境中培养， 培养72h后观察结 果， 不出现菌落的琼脂平皿上的最低有效浓度为其最低抑菌浓度(MIC)。 0043 1.2.4药物杀菌试验 0044 实验共设置4组， 分别为空白对照组、 1/2MIC药物浓度组、 MIC药物浓度组、 2MIC药 物浓度组。 取90mm玻璃平皿4个， 分别加入布氏肉汤与胎牛血清(培养液10的量)混合液 9.5ml， 将不同浓度的3种药液各0.5ml加入对应的液体培养基。 收取新鲜培养的H.pylori NCTC11637于布氏肉汤与胎牛血清混合液中制成菌悬液， 使其浓度为1106cfu/ml， 各组均 加入菌悬液100ul。 。
16、将各平皿液体培养液混匀， 于恒温振摇床37微需氧环境下振摇培养。 准备0.9ml布氏肉汤稀释试管若干， 于0、 4、 8、 24h分别取各组菌液的母液100ul经数倍稀释 后， 取100ul混合稀释液接种于90mm哥伦比亚血琼脂培养皿中， 置于恒温培养箱， 于37微 需氧环境下培养72h后做菌落计数并按照稀释倍数折算后取其平均值。 统计各个时间点的 平均菌落数， 计算不同药物浓度下不同时间点的杀菌率， 杀菌率(对照菌落数-处理菌落 数)/对照菌落数100。 取各个时间点菌落计数的对数， 绘制时间-杀菌曲线图。 0045 2.结果 0046 2.1E-test药敏试验筛选耐药菌株情况 0047 。
17、经E-test药敏试验筛选MZ或克拉霉素CH耐药的临床菌株5株， 对临床上常见抗生 素的耐药情况见表1。 0048 表1 H.pylori临床菌株耐药情况 说 明 书 3/5 页 5 CN 105878900 A 5 0049 0050 AC： 阿莫西林CH： 克拉霉素TC： 四环素LE： 左氧氟沙星MZ： 甲硝锉MX： 莫西沙星.*对 该抗生素耐药 0051 2.2中药组合物对H.pylori标准菌株及临床耐药株的MIC值 0052 中药组合物对标准菌株NCTC11637和临床耐药株均具有显著的抑菌效果， 对其煎 剂与配方颗粒剂对H.pylori NCTC11637的MIC值分别为16mg/。
18、ml和8mg/ml， 对H.pylori临床 耐药株的MIC值分别均为28mg/ml和48mg/ml不等(见表2)。 0053 表2中药组合物对H.pylori标准菌株及部分临床耐药株的MIC值(mg/ml) 0054 0055 2.3药物不同浓度杀菌率及杀菌曲线 0056 中药组合物对H.pylori具有杀菌作用， 且各时间点的杀菌率与药物浓度成正比。 当药物浓度为MIC值时， 8h菌落计数为100， 杀菌率达到100； 当药物浓度为2MIC值时， 4h菌 落计数即为0， 杀菌率已经达到100(表3)。 0057 表3不同时间点杀菌率() 0058 0059 图1为不同药物浓度在各时间点的菌。
19、落计数的对数值。 0060 图1结果显示， 在1/2MIC浓度的中药组合物作用下， 培养08h时菌落计数较0h有 显著的降低， 24h菌落数量略有提升， 杀菌效应不持续。 当药物浓度在MIC值以上时， 8h已经 检测不到菌落生长， 当药物浓度为2MIC值时， 培养4h已经检测不到有菌落生长。 0061 3.结论 0062 采用琼脂稀释法测定中药组合物对H.pylori的MIC， 研究其在体外对H.pylori是 否具有抑菌作用。 结果显示中药组合物对标准菌株NCTC11637和5株临床耐药株均具有显著 的抑菌效果， 平均MIC值为煎剂8mg/ml、 配方颗粒剂7mg/ml， 其有效剂量低于临床用药剂量。 在不同药物浓度条件下中药组合物对H.pylori NCTC11637具有明确的杀菌作用， 杀菌率逐 说 明 书 4/5 页 6 CN 105878900 A 6 渐升高， 且其杀菌效能与药物浓度成正相关。 实验结果显示不同浓度的中药组合物均对 H.pylori NCTC11637具有显著的杀菌效果， 剂量越大， 起效越快， 效果则越好。 说 明 书 5/5 页 7 CN 105878900 A 7 图1 说 明 书 附 图 1/1 页 8 CN 105878900 A 8 。