技术领域
本发明属于医药技术或保健食品等技术领域，具体涉及一种松露和三七为原料的菌质及其制备方法。
背景技术
三七又名田七，明代著名的药学家李时珍称其为“金不换”，扬名中外的中成药“云南白药”和“片仔癀”，即以三七为主要原料制成。三七主要活性成分为三七总皂苷(PNS)，尤其是稀有皂苷Rd在治疗心脑血管疾病、抗肿瘤方面表现出较好的药理活性；三七皂苷Rg1是三七的重要活性成分之一，具有抗疲劳、耐缺氧和增强学习记忆功能作用；Rg1还可减少血清中的皮质酮浓度，通过促进BDNF、p-ERK、等一系列促存活蛋白，增加动物神经元生成来产生抗抑郁作用，放松心情对预防心血管病有着重大意义；
松露，别称块菌(truffle)，俗称猪拱菌，是一类与橡树、松树、栎树等共生的外生菌根菌；法国的松露多产于橡树根部，而中国的松露产于松树根部，云南的松露以高黎贡山为最上品，个小、丑、但风味极浓郁，富含a-雄烷醇(催情成分)和二甲硫基甲烷(块菌特殊风味成分)。a-雄烷醇是松露的活性成分之一，是一种甾体化合物，其化学结构与人体内性激素的化学结构相似，未阉的公猪唾液、睾丸、肝中均含有该化合物，在人的血浆、腋汗及尿液中也有发现；α-雄烷醇具有催情作用，已有企业将其开发成为一种商品——费洛蒙(pheromone)，价值不菲；最近研究表明，a-雄烷醇还具有激发脑细胞活力、调理内分泌、抗疲劳、抗抑郁等作用。
发酵中药的应用在我国具有悠久的历史，是传统中药加工炮制的重要方法之一，发酵中药作为一种炮制加工工艺，不但改变了煎、煮、熬、炼、蒸、浸的传统工艺，而且使药效提高药性发生改变产生新化合物并降低药物不良作用。例如：六神曲、淡豆豉、半夏曲等传统中药均由天然微生物发酵而成。传统的中药发酵采用天然微生物发酵，菌种不纯，代谢理论、药效成分理念模糊不清，生产可控性差。
发明内容
基于上述原因，申请人经过多年的研究，以新鲜三七作为主要发酵基质，以松露菌液作为菌种，采用真菌双向发酵技术进行发酵，得到一种新的药性菌质制备方法，该方法旨在增加两者的生物活性成分的含量及增强药效，尤其是能够增强其抗疲劳功效。
本发明通过下述技术方案实现的。
一种发酵菌质，发酵菌质由下述原料制备而成：三七和松露。
所述的发酵菌质的制备方法包括松露菌液的制备方法和双向发酵方法，其中双向发酵方法包括：固态双向发酵方法或液态双向发酵方法。
其中松露菌液的制备方法为：
A、将采集的新鲜松露子囊果，用水充分清洗后25KHz超声波处理5min，再用无菌水和无菌研钵适度研碎得到研磨液；
B、将研磨液涂布于SLF培养基平板，在23-28℃恒温培养，对长出的菌落于SLF培养基平板划线纯化分离，重复上述操作直至得到单菌落为止；所述SLF培养基成分为：葡萄糖30g/L、蛋白胨10g/L、硫酸铵1g/L、琼脂20g/L、鲜三七浸出汁1L；
C、将分离到的单菌落分别接入发酵培养基，在23-28℃、150rpm振荡培养6-10d，采用高效液相色谱分析的方法检测发酵产物，产a-雄烷醇能力最强的菌株即为筛选的松露菌，将其移至PDA斜面上培养后，于4℃保存；所述发酵培养基成分为：麦芽糖30g/L、蔗糖20g/L、蛋白胨10g/L、硫酸镁1g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵1g/L、鲜三七浸出汁1L，121℃灭菌20min。
D、将松露菌斜面菌种接种到菌种富集培养基，在23-28℃、150rpm振荡培养24h，得到松露菌液；所述的菌种富集培养基成份为：麦芽糖30g/L、蔗糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、硫酸镁1g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵1g/L、氯化钙1g/L、维生素B1 0.01g/L，121℃灭菌20min；
其中固态双向发酵的制备方法为：
A、将新鲜三七加入营养液和纯净水匀浆使其含水量为总重量的60-70％，于121℃灭菌20min得到三七固态培养基；
B、将松露菌液按照10ml/100g接种到三七固态培养基中，搅拌混合均匀使料层厚度为3-5cm，放置于23-28℃的培养箱中发酵，至菌丝长满培养基时发酵结束，将固态发酵产物干燥粉碎，得到发酵菌质。
其中液态双向发酵的制备方法为：
A、将新鲜三七与纯净水按质量比1∶5-10混匀并打浆，在60℃逆流提取1h，取滤液加入营养液并混匀，于121℃灭菌20min，得到三七液态培养基；
B、将10％体积比松露菌液接入三七液态培养基中，在23-28℃、150rpm条件下发酵6-10d；
C、发酵结束后，将发酵液在常温逆流提取1h，离心过滤后将滤液浓缩干燥，得到发酵菌质。
所述的菌质在缓解疲劳食品中的应用。
本发明所述的菌质为：松露与三七双向发酵药性菌质，该菌质可以单独作为食品食用，也可以将其与其他成分组合后用于抗疲劳食品食用，或者将该菌质提取后得到的提取物单独或与其他成分组合作为抗疲劳食品使用。
本发明所述的营养液由去离子水、可溶性淀粉、无机盐、维生素B、铵态氮、硝态氮、葡萄糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、果糖、蛋白胨、酵母膏、麦芽、麸皮、松针、橘皮苷、桑色素、甲硫氨酸、苯丙氨酸、柠檬酸中的一种或几种制备而成。上述原料都可从商业途径购买得到。
具体实施例
以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此。
本说明书实施例所述的内容仅仅是对发明构思的实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式，本发明的保护范围也及于本领域技术人员根据本发明构思所能够想到的等同技术手段。尽管以下本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，下述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。
本发明下述试验，是在多次创造性试验的基础上，以本发明所要保护的技术方案为基础，总结的研发人员的结论性试验。
试验1小鼠抗疲劳实验
试验动物：昆明种小鼠，体重18-20g；
对照组：新鲜三七100g，加水100g，匀浆，备用；
试验组：本发明实施例菌质，加水100g，匀浆，备用；
试验方法：取小鼠，随机分组，每组10只，空白组给予生理盐水0.2ml/20g。对照组和试验组灌胃给药，给药量10ml/kg，给药1小时后，快速将小鼠放入事先备好的游泳池内，记录小鼠子入池开始至不再游泳的时间。结果见表1。
表1抗疲劳试验结果
组别 游泳时间(min) 空白组 2.2±0.8 对照组 4.9±0.7* 实施例1组 8.2±1.0**# 实施例2组 8.1±0.9**# 实施例3组 7.9±0.7**# 实施例4组 8.0±1.2**# 实施例5组 7.7±0.6**# 实施例6组 8.1±0.7**# 实施例7组 8.0±1.1**# 实施例8组 8.3±0.7**# 实施例9组 9.1±1.2**# 实施例10组 9.4±1.0**# 实施例11组 9.3±0.7**# 实施例12组 9.0±1.1**#
注：与对照组比较**p＜0.01，与对照组比较#p＜0.05。
试验结论：上述试验表明，本发明菌质具有很好的抗疲劳作用，在给药量相同的情况下，比三七组比较具有显著性差异(P<0.05)。
制备实施例
实施例1
松露菌液的制备方法为：
A、将采集的新鲜松露子囊果，用水充分清洗后25KHz超声波处理5min，再用无菌水和无菌研钵适度研碎得到研磨液；
B、将研磨液涂布于SLF培养基平板，在23℃恒温培养，对长出的菌落于SLF培养基平板划线纯化分离，重复上述操作直至得到单菌落为止；所述SLF培养基成分为：葡萄糖30g/L、蛋白胨10g/L、硫酸铵1g/L、琼脂20g/L、鲜三七浸出汁1L；
C、将分离到的单菌落分别接入发酵培养基，在23℃、150rpm振荡培养6d，采用高效液相色谱分析的方法检测发酵产物，产a-雄烷醇能力最强的菌株即为筛选的松露菌，将其移至PDA斜面上培养后，于4℃保存；所述发酵培养基成分为：麦芽糖30g/L、蔗糖20g/L、蛋白胨10g/L、硫酸镁1g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵1g/L、鲜三七浸出汁1L，121℃灭菌20min。
D、将松露菌斜面菌种20g接种到200ml菌种富集培养基，在23℃、150rpm振荡培养24h，得到松露菌液180ml；所述的菌种富集培养基成份为：麦芽糖30g/L、蔗糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、硫酸镁1g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵1g/L、氯化钙1g/L、维生素B10.01g/L，121℃灭菌20min；
固态发酵方法：
A、将新鲜三七100g加入营养液5g和纯净水匀浆使其含水量为总重量的60％，于121℃灭菌20min得到三七固态培养基；
B、将松露菌液10ml接种到100g三七固态培养基中，搅拌混合均匀使料层厚度为3cm，放置于23℃的培养箱中发酵，至菌丝长满培养基时发酵结束，将固态发酵产物干燥粉碎，得到发酵菌质90g。
实施例2
松露菌液的制备方法为：
A、将采集的新鲜松露子囊果，用水充分清洗后25KHz超声波处理5min，再用无菌水和无菌研钵适度研碎得到研磨液；
B、将研磨液涂布于SLF培养基平板，在23℃恒温培养，对长出的菌落于SLF培养基平板划线纯化分离，重复上述操作直至得到单菌落为止；所述SLF培养基成分为：葡萄糖30g/L、蛋白胨10g/L、硫酸铵1g/L、琼脂20g/L、鲜三七浸出汁1L；
C、将分离到的单菌落分别接入发酵培养基，在23℃、150rpm振荡培养6d，采用高效液相色谱分析的方法检测发酵产物，产a-雄烷醇能力最强的菌株即为筛选的松露菌，将其移至PDA斜面上培养后，于4℃保存；所述发酵培养基成分为：麦芽糖30g/L、蔗糖20g/L、蛋白胨10g/L、硫酸镁1g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵1g/L、鲜三七浸出汁1L，121℃灭菌20min。
D、将松露菌斜面菌种20g接种到200ml菌种富集培养基，在23℃、150rpm振荡培养24h，得到松露菌液180ml；所述的菌种富集培养基成份为：麦芽糖30g/L、蔗糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、硫酸镁1g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵1g/L、氯化钙1g/L、维生素B10.01g/L，121℃灭菌20min；
液态双向发酵的制备方法为：
A、将新鲜三七100g与纯净水500混匀并打浆，在60℃逆流提取1h，取滤液加入营养液5g并混匀，于121℃灭菌20min，得到三七液态培养基；
B、将松露菌液50ml接入500ml三七液态培养基中，在23℃、150rpm条件下发酵6d；
C、发酵结束后，将发酵液在常温逆流提取1h，离心过滤后将滤液浓缩干燥，得到发酵菌质60g。
实施例3
松露菌液的制备方法为：
A、将采集的新鲜松露子囊果，用水充分清洗后25KHz超声波处理5min，再用无菌水和无菌研钵适度研碎得到研磨液；
B、将研磨液涂布于SLF培养基平板，在28℃恒温培养，对长出的菌落于SLF培养基平板划线纯化分离，重复上述操作直至得到单菌落为止；所述SLF培养基成分为：葡萄糖30g/L、蛋白胨10g/L、硫酸铵1g/L、琼脂20g/L、鲜三七浸出汁1L；
C、将分离到的单菌落分别接入发酵培养基，在28℃、150rpm振荡培养10d，采用高效液相色谱分析的方法检测发酵产物，产a-雄烷醇能力最强的菌株即为筛选的松露菌，将其移至PDA斜面上培养后，于4℃保存；所述发酵培养基成分为：麦芽糖30g/L、蔗糖20g/L、蛋白胨10g/L、硫酸镁1g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵1g/L、鲜三七浸出汁1L，121℃灭菌20min。
D、将松露菌斜面菌种20g接种到200ml菌种富集培养基，在28℃、150rpm振荡培养24h，得到松露菌液180ml；所述的菌种富集培养基成份为：麦芽糖30g/L、蔗糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、硫酸镁1g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵1g/L、氯化钙1g/L、维生素B10.01g/L，121℃灭菌20min；
固态发酵方法：
A、将新鲜三七100g加入营养液10g和纯净水匀浆使其含水量为总重量的70％，于121℃灭菌20min得到三七固态培养基；
B、将松露菌液10ml接种到100g三七固态培养基中，搅拌混合均匀使料层厚
8度为5cm，放置于28℃的培养箱中发酵，至菌丝长满培养基时发酵结束，将固态发酵产物干燥粉碎，得到发酵菌质92g。
实施例4
松露菌液的制备方法为：
A、将采集的新鲜松露子囊果，用水充分清洗后25KHz超声波处理5min，再用无菌水和无菌研钵适度研碎得到研磨液；
B、将研磨液涂布于SLF培养基平板，在28℃恒温培养，对长出的菌落于SLF培养基平板划线纯化分离，重复上述操作直至得到单菌落为止；所述SLF培养基成分为：葡萄糖30g/L、蛋白胨10g/L、硫酸铵1g/L、琼脂20g/L、鲜三七浸出汁1L；
C、将分离到的单菌落分别接入发酵培养基，在28℃、150rpm振荡培养10d，采用高效液相色谱分析的方法检测发酵产物，产a-雄烷醇能力最强的菌株即为筛选的松露菌，将其移至PDA斜面上培养后，于4℃保存；所述发酵培养基成分为：麦芽糖30g/L、蔗糖20g/L、蛋白胨10g/L、硫酸镁1g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵1g/L、鲜三七浸出汁1L，121℃灭菌20min。
D、将松露菌斜面菌种20g接种到200ml菌种富集培养基，在28℃、150rpm振荡培养24h，得到松露菌液180ml；所述的菌种富集培养基成份为：麦芽糖30g/L、蔗糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、硫酸镁1g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵1g/L、氯化钙1g/L、维生素B10.01g/L，121℃灭菌20min；
液态双向发酵的制备方法为：
A、将新鲜三七100g与纯净水1000ml混匀并打浆，在60℃逆流提取1h，取滤液加入营养液20g并混匀，于121℃灭菌20min，得到三七液态培养基；
B、将松露菌液100ml接入1000ml三七液态培养基中，在28℃、150rpm条件下发酵10d；
C、发酵结束后，将发酵液在常温逆流提取1h，离心过滤后将滤液浓缩干燥，得到发酵菌质63g。
实施例5
松露菌液的制备方法为：
A、将采集的新鲜松露子囊果，用水充分清洗后25KHz超声波处理5min，再用无菌水和无菌研钵适度研碎得到研磨液；
B、将研磨液涂布于SLF培养基平板，在25℃恒温培养，对长出的菌落于SLF培养基平板划线纯化分离，重复上述操作直至得到单菌落为止；所述SLF培养基成分为：葡萄糖30g/L、蛋白胨10g/L、硫酸铵1g/L、琼脂20g/L、鲜三七浸出汁1L；
C、将分离到的单菌落分别接入发酵培养基，在25℃、150rpm振荡培养8d，采用高效液相色谱分析的方法检测发酵产物，产a-雄烷醇能力最强的菌株即为筛选的松露菌，将其移至PDA斜面上培养后，于4℃保存；所述发酵培养基成分为：麦芽糖30g/L、蔗糖20g/L、蛋白胨10g/L、硫酸镁1g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵1g/L、鲜三七浸出汁1L，121℃灭菌20min。
D、将松露菌斜面菌种20g接种到200ml菌种富集培养基，在25℃、150rpm振荡培养24h，得到松露菌液180ml；所述的菌种富集培养基成份为：麦芽糖30g/L、蔗糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、硫酸镁1g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵1g/L、氯化钙1g/L、维生素B10.01g/L，121℃灭菌20min；
固态双向发酵的制备方法为：
A、将新鲜三七100g加入营养液3g和纯净水匀浆使其含水量为总重量的65％，于121℃灭菌20min得到三七固态培养基；
B、将松露菌液10ml接种到100g三七固态培养基中，搅拌混合均匀使料层厚度为4cm，放置于25℃的培养箱中发酵，至菌丝长满培养基时发酵结束，将固态发酵产物干燥粉碎，得到发酵菌质95g。
实施例6
松露菌液的制备方法为：
A、将采集的新鲜松露子囊果，用水充分清洗后25KHz超声波处理5min，再用无菌水和无菌研钵适度研碎得到研磨液；
B、将研磨液涂布于SLF培养基平板，在25℃恒温培养，对长出的菌落于SLF培养基平板划线纯化分离，重复上述操作直至得到单菌落为止；所述SLF培养基成分为：葡萄糖30g/L、蛋白胨10g/L、硫酸铵1g/L、琼脂20g/L、鲜三七浸出汁1L；
C、将分离到的单菌落分别接入发酵培养基，在25℃、150rpm振荡培养8d，采用高效液相色谱分析的方法检测发酵产物，产a-雄烷醇能力最强的菌株即为筛选的松露菌，将其移至PDA斜面上培养后，于4℃保存；所述发酵培养基成分为：麦芽糖30g/L、蔗糖20g/L、蛋白胨10g/L、硫酸镁1g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵1g/L、鲜三七浸出汁1L，121℃灭菌20min。
D、将松露菌斜面菌种20g接种到200ml菌种富集培养基，在25℃、150rpm振荡培养24h，得到松露菌液180ml；所述的菌种富集培养基成份为：麦芽糖30g/L、蔗糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、硫酸镁1g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵1g/L、氯化钙1g/L、维生素B10.01g/L，121℃灭菌20min；
液态双向发酵的制备方法为：
A、将新鲜三七100g与纯净水600ml混匀并打浆，在60℃逆流提取1h，取滤液加入营养液3g并混匀，于121℃灭菌20min，得到三七液态培养基；
B、将松露菌液60ml接入600ml三七液态培养基中，在25℃、150rpm条件下发酵8d；
C、发酵结束后，将发酵液在常温逆流提取1h，离心过滤后将滤液浓缩干燥，得到发酵菌质66g。