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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710084344.9 (22)申请日 2017.02.16 (71)申请人 国家纳米科学中心 地址 100190 北京市海淀区中关村北一条 11号 (72)发明人 丁宝全 王婷 蒋乔 宋琳琳 湛鹏飞 李彤彤 (74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司 11332 代理人 巩克栋 侯桂丽 (51)Int.Cl. A61K 49/00(2006.01) A61K 49/22(2006.01) (54)发明名称 一种集光学和光声于一体的双模态分子影 像探针及其制备方法和应用。
2、 (57)摘要 本发明涉及一种集光学和光声于一体的双 模态纳米分子影像探针及其制备方法和应用， 其 由核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物形成， 所述核酸纳米结构是利用DNA折纸技术构建的二 维和/或三维纳米结构； 所述金纳米棒为表面进 行DNA修饰的金纳米棒。 本发明制备的核酸纳米 结构-金纳米棒-量子点复合物作为光学及光声 成像探针， 不但能够保证其偶联的光声学的吸收 对比增强效果， 而且负载的量子点具有很好的光 学成像质量效果， 可显著提高检测灵敏度并延长 活体成像的检测时间， 该材料制备方法工艺简 单、 成本低且方便易行。 权利要求书2页 说明书8页 附图2页 CN 106620725。
3、 A 2017.05.10 CN 106620725 A 1.一种集光学和光声于一体的双模态分子影像探针， 其特征在于， 所述双模态分子影 像探针为核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物。 2.如权利要求1所述的双模态分子影像探针， 其特征在于， 所述核酸纳米结构是利用 DNA折纸技术构建的二维和/或三维纳米结构； 优选地， 所述核酸纳米结构是通过脚手架链与辅助折叠的订书钉链进行杂交而自组装 形成的核酸纳米结构。 3.如权利要求1或2所述的双模态分子影像探针， 其特征在于， 所述金纳米棒为表面进 行寡核苷酸序列修饰的金纳米棒， 优选为表面进行巯基化DNA修饰的金纳米棒。 4.如权利要求1-3之一。
4、所述的集光学和光声于一体的双模态分子影像探针的制备方 法， 其特征在于， 包括以下步骤： (1)制备核酸纳米结构； (2)制备金纳米棒； (3)将步骤(1)得到的核酸纳米结构与步骤(2)得到的金纳米棒混合， 以梯度循环的方 式降温退火， 得到负载有金纳米棒的核酸纳米结构， 并进行电泳除去过量的金纳米棒； (4)将量子点与步骤(3)得到的纯化后的负载有金纳米棒的核酸纳米结构混合， 经孵 育， 得到核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物。 5.如权利要求4所述的方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所述核酸纳米结构的制备方法包 括以下步骤： 将订书钉链混合溶液加入到脚手架链溶液中， 所述脚手架链与订。
5、书钉链的摩尔比为1: (2-50)， 混匀； 以90-100为起始温度进行降温退火至15-25， 整个过程持续10h以上， 得 到所述核酸纳米结构； 优选地， 所述脚手架链与订书钉链的摩尔比为1:(5-30)， 优选1:(10-25)； 优选地， 所述降温退火的起始温度为93-96， 优选95； 优选地， 所述降温退火的终点温度为18-22， 优选20； 优选地， 所述降温退火过程的持续时间为10-26h， 优选12-24h。 6.如权利要求4或5所述的方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 所述金纳米棒通过以下方法 制备： 利用晶种诱导生长法制备金纳米棒； 使用十六烷基三甲基溴化铵进行修饰； 。
6、使用合成 的巯基化寡核苷酸序列替代十六烷基三甲基溴化铵， 由此完成金纳米棒的DNA表面修饰。 7.如权利要求4-6之一所述的方法， 其特征在于， 步骤(3)中， 所述核酸纳米结构与金纳 米棒的摩尔比为1:(1-3)， 优选为1:2； 优选地， 所述降温退火为从40-45， 逐渐降温退火至20-25， 此退火降温过程为一个 循环， 共30-60个循环， 优选30-45个循环， 每摄氏度为一个梯度， 每梯度保持3-5min； 优选地， 所述电泳的条件为： 0.5-1琼脂糖胶、 电泳环境温度4-10、 电泳缓冲液为 0.5-1TBE缓冲液并含5-11mM Mg2+、 电泳电压为10-15V/cm、 。
7、且电泳时间为30-50min。 8.如权利要求4-7之一所述的方法， 其特征在于， 步骤(4)中， 所述量子点与负载有金纳 米棒的核酸纳米结构的摩尔比为(3-5):1， 优选为4:1； 优选地， 所述孵育在室温下进行， 优选在18-25下进行； 优选地， 所述孵育的时间为1-3h， 优选2h。 9.如权利要求1-3之一所述的集光学和光声于一体的双模态分子影像探针在制备活体 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 106620725 A 2 光学和光声成像造影剂或肿瘤手术导航探针中的应用。 10.如权利要求9所述的应用， 其特征在于， 所述肿瘤为卵巢癌、 乳腺癌、 非小细胞癌、 头 颈癌、 食。
8、管癌、 肝癌、 肺腺细胞癌、 前列腺癌或非何金氏淋巴瘤中的一种或至少两种的组合。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 106620725 A 3 一种集光学和光声于一体的双模态分子影像探针及其制备方 法和应用 技术领域 0001 本发明涉及光学光声成像领域， 具体而言， 本发明涉及了一种集光学和光声于一 体的、 以核酸纳米结构为基础自组装的双模态纳米分子影像探针及其制备方法和应用。 背景技术 0002 恶性肿瘤是一种严重危害人类健康的重要疾病， 是威胁人类生命的头号杀手。 面 对全球恶性肿瘤发生率和死亡率的不断攀升， 以及目前诊断和治疗方法的局限性， 发展高 效低毒的诊疗一体化治疗方法已。
9、成为迫在眉睫的重大问题。 如何有效的利用较小侵入性且 高灵敏度的分子影像手段进行恶性肿瘤的早期筛查和切除术中导航， 如何进一步实现肿瘤 诊断与治疗一体化， 是现今癌症研究中的热点。 0003 分子探针是成像成功的关键， 它的合成和检测是分子影像学研究中最热门、 最前 沿的问题之一。 而实际上， 人们对探针的研究， 没有一种完美的影像技术能够提供检测对象 的所有信息， 任何一种影像技术都存在自身优缺点； 传统的分子探针中， 同样也没有一种能 够提供关于组织的所有结构、 功能和分子信息。 为了克服这些问题， 人们开始研究多模态分 子探针， 使得在诊断、 治疗和监测等方面可以获得全方位的信息， 必将。
10、成为未来进行体内成 像的重要工具。 相对于传统高损伤的手术治疗和高毒性的放化疗治疗策略， 利用纳米探针 在活体进行光学(Optical imaging)及光声成像(Photoacoustic imaging)指导下的双模 态的癌症诊疗一体化策略， 以其对肿瘤较好的疗效和对机体较小的侵入损伤因而具有极其 重要的应用前景。 0004 核酸纳米材料具有结构精确可控、 易于化学修饰、 生物可降解等特点， 是一种很有 潜力的抗肿瘤分子影像探针， 在药物高效靶向运输、 多功能复合诊疗平台等方面有非常广 阔的应用前景。 研制高效、 低毒、 靶向、 多功能的核酸纳米结构作为运输载体， 有望为开发新 一代抗肿瘤。
11、药物运输系统提供新思路、 新途径和新手段， 具有重大的实际意义。 DNA折纸 (DNA origami)是一种新颖而独特的DNA自组装纳米技术， 为核酸纳米材料的制备提供了一 个新的思路， 现在被广泛用来从生物大分子脱氧核糖核酸(DNA)自下而上(Bottom-up)的制 作各种纳米尺度的二维和三维的DNA图案和形状， 它是利用一条长的单链核苷酸序列与若 干条短的寡核苷酸序列通过碱基互补配对原则进行杂交形成预先设计的结构， 通过这项技 术， 可以简单方便的制备结构复杂的二维或三维DNA纳米材料。 因此， 研制高效、 低毒、 靶向、 可控的DNA折纸纳米结构作为药物运输载体， 具有非常重大的实际。
12、意义。 0005 贵金属纳米材料， 由于其具有光声的特点而引起了广泛关注并成为了肿瘤治疗方 面的另一研究热点， 其中金纳米棒最具有一定的代表意义。 金纳米棒近红外区域具有良好 的等离子共振效应(Surface Plasmon Resonance， SPR)， 能够被可见光或者近红外光诱导 并将其转化为热量释放出来， 可用来进行光热治疗； 利用其等离子共振峰峰波长相近的双 光子激光进行激发则产生双光子荧光和光声信号， 可被用作活体诊断成像的造影剂。 尽管 利用贵金属纳米颗粒及其组装体作为造影剂进行光声成像和光热治疗有诸多的好处， 如制 说 明 书 1/8 页 4 CN 106620725 A 4。
13、 备简单、 形貌丰富、 尺寸可控以及生物安全性等优势， 但应用于肿瘤的早期检测和治疗的实 践中， 仍然存在许多的问题。 如贵金属纳米材料结构大多尺寸较小， 对于肿瘤区域没有主动 选择性， 限制其进一步应用。 如果能够将贵金属纳米颗粒或其组装结构进行有效装载， 并对 纳米载体进行肿瘤细胞和组织靶向功能修饰， 则既可以提高造影材料对肿瘤组织的有效递 送， 又可以避免纳米材料对正常组织和细胞的伤害， 从而有效杀伤肿瘤； 还可在同一纳米载 体上同时装载成像试剂/化疗药物等， 最终实现高效、 低毒、 靶向、 影像探针导航的诊疗一体 化纳米平台。 0006 量子点(Quantum Dot)是20世纪90年。
14、代提出来的一个新概念。 量子点一般为球形 或类球形， 又可称为纳米晶， 是一种由II-VI族或III-V族元素组成的纳米颗粒。 量子点的粒 径一般介于1-10nm之间， 由于电子和空穴被量子限域， 连续的能带结构变成具有分子特性 的分立能级结构， 受激后可以发射荧光。 作为一种新颖的半导体纳米材料， 与传统的有机荧 光染料相比， 量子点具有许多独特的纳米性质和多种优势， 如吸收光谱宽、 发射光谱窄且对 称； 生物相容性好； 具有很好的光稳定性， 在较长时间的激发光照射下荧光强度都不会降 低， 因此， 量子点可用于高灵敏度的检测和荧光显微镜下长时间持续的观测， 使其作为一种 新型的荧光探针在生物。
15、医学领域的应用得到了快速的发展。 总而言之， 量子点具有激发光 谱宽且连续分布， 而发射光谱窄而对称， 颜色可调， 光化学稳定性高， 荧光寿命长等优越的 荧光特性， 是一种理想的荧光探针。 量子点特殊的光学性质使得它在生物化学、 分子生物 学、 细胞生物学、 基因组学、 蛋白质组学、 药物筛选、 生物大分子相互作用等研究中有极大的 应用前景。 基于量子效应， 量子点在太阳能电池， 发光器件， 光学生物标记等领域具有广泛 的应用前景。 0007 如何构建可控的微纳米结构作为光学及光声成像的分子影像探针是现今急需解 决的核心问题之一， 该探针需满足形态和粒径容易控制、 化学结构容易修饰、 生物相容。
16、性较 好等必要条件。 恰恰DNA纳米材料具有结构精确可控、 易于功能化修饰、 可生物降解等特点 符合这些要求， 是一种很有潜力的生物型材料， 在构建功能型材料等方面有非常好的优势。 DNA修饰后的金纳米棒， 通过DNA之间的相互杂交连接到DNA折纸结构上， 此外， 量子点利用 链霉亲和素与生物素相互反应连接到DNA折纸结构上。 0008 通过上述分析， 前期已有的发明都有关于核酸纳米结构用于药物载体、 小动物光 热治疗， 但是目前尚无将核酸纳米材料作为载体将金纳米棒和量子点结合在一起的报道。 发明内容 0009 本发明的目的在于提供一种集光学和光声于一体的双模态分子影像探针及其制 备方法和应用。
17、。 本发明所提供的双模态分子影像探针是集光学成像和光声成像于一体的， 其利用核酸纳米结构将金纳米棒和量子点结合在一起， 实现了双模态分子影像探针在动物 水平上的光学及光声成像效果。 0010 为达此目的， 本发明采用了以下技术方案： 0011 第一方面， 本发明提供了一种集光学和光声于一体的双模态分子影像探针， 该双 模态分子影像探针为核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物。 0012 本发明提供的双模态分子影像探针能够促进光敏成分在肿瘤组织中的富集从而 更有效的进行活体光声成像， 同时由于其负载的量子点使其具有良好的光学成像质量， 从 说 明 书 2/8 页 5 CN 106620725 A 。
18、5 而实现了集光学和光声成像于一体。 0013 本发明中， 所述核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物是由核酸纳米结构作为载 体将金纳米棒和量子点结合在一起， 从而得到该复合物。 0014 本发明中， 所述核酸纳米结构是利用DNA折纸技术构建的二维和/或三维纳米结 构， 其具体可以是通过脚手架链(scaffold chains)与辅助折叠的订书钉链(staple strands)进行杂交而自组装形成的核酸纳米结构， 所述脚手架链与所述订书钉链通过碱基 互补配对原则进行杂交。 0015 其中所述脚手架链可选自M13噬菌体基因组DNA、 基于M13噬菌体基因组DNA进行改 造的各种单链环状DNA、 。
19、Lambda噬菌体基因组DNA、 利用点突变技术和位点-延伸非依赖克隆 (SLIC)技术从给定质粒大规模生产长度可调的单链环状DNA链、 通过PCR得到的M13噬菌体 基因组DNA片段、 Lambda噬菌体基因组DNA片段和利用体外转录得到的RNA片段中的一种或 至少两种的混合物。 除此之外， 还可使用其它脚手架链， 只要其能够满足特定位点上的碱基 互补配对， 使订书钉链能够辅助脚手架链进行折叠自组装形成核酸纳米结构。 优选地， 所述 脚手架链为M13噬菌体基因组DNA。 0016 所述辅助折叠的订书钉链为人工合成的寡核苷酸序列， 其选取5-20个位点延伸出 了捕获序列， 其捕获序列与后续DN。
20、A修饰金纳米棒采用的序列互补。 0017 由此可见， 优选的核酸纳米结构为M13噬菌体基因组DNA与人工合成的寡核苷酸序 列通过碱基互补配对原则进行杂交自组装而形成。 0018 优选地， 使用DNA折纸技术可以将所述核酸纳米结构构建成三角形、 长方形、 纳米 管状、 四面体、 巴基球形、 纳米片状、 带状或笼状。 0019 本发明中， 所述金纳米棒为表面进行寡核苷酸序列修饰的金纳米棒； 除了该金纳 米棒以外， 还可以采用金纳米壳、 表面包银的金纳米棒或金纳米笼等。 0020 所述金纳米棒可使用本领域内任意已知方法制备。 在一个优选的实施方案中， 所 述金纳米棒为表面进行巯基化DNA修饰的金纳米。
21、棒。 0021 本发明中所述金纳米棒与所述核酸纳米结构通过寡核苷酸序列杂交偶联。 0022 本领域的技术人员将会理解， 本发明的金纳米棒的制备方法并不必然依赖于上述 详细工艺及参数， 此处给出的仅仅是较优的技术方案。 本领域技术人员可以根据其经验制 备所需的金纳米棒。 0023 第二方面， 本发明提供了如第一方面所述集光学和光声于一体的双模态分子影像 探针的制备方法， 其包括以下步骤： 0024 (1)制备核酸纳米结构； 0025 (2)制备金纳米棒； 0026 (3)将步骤(1)得到的核酸纳米结构与步骤(2)得到的金纳米棒混合， 以梯度循环 的方式降温退火， 得到负载有金纳米棒的核酸纳米结构。
22、， 并进行电泳除去过量的金纳米棒； 0027 (4)将量子点与步骤(3)得到的纯化后的负载有金纳米棒的核酸纳米结构混合， 经 孵育， 得到核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物。 0028 在本发明所述集光学和光声于一体的双模态分子影像探针的制备方法中， 之所以 能形成核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物， 其中有两个重要的参数起到十分关键的作 用， 一是核酸纳米结构与金纳米棒的摩尔比， 二是量子点与负载有金纳米棒的核酸纳米结 说 明 书 3/8 页 6 CN 106620725 A 6 构的摩尔比， 尤其以后者为主。 也就是说， 本发明构成复合物的三种成分之间具有一定的配 比关系， 只有当同时。
23、满足核酸纳米结构与金纳米棒的摩尔比为1:(1-3)以及量子点与负载 有金纳米棒的核酸纳米结构的摩尔比为(3-5):1时， 其才能制备得到核酸纳米结构-金纳米 棒-量子点复合物， 并使得该复合物具有相比单独采用这三种成分或任意两种成分得到的 复合物， 具有更优异的光声学吸收对比增强效果以及更好的光学成像质量。 0029 优选地， 本发明采用核酸纳米结构与金纳米棒的摩尔比为1:2以及量子点与负载 有金纳米棒的核酸纳米结构的摩尔比为4:1的配比关系。 由于在溶液状态下量子点和金纳 米棒会存在相互作用的影响， 容易导致金纳米棒高效地淬灭量子点， 因此本发明对量子点 与金纳米棒的摩尔比进行了优化， 当二。
24、者的摩尔比为2:1时， 其不仅保证了量子点与金纳米 棒的DNA折纸复合结构完全组装， 还保证了金纳米棒不会将量子点淬灭。 0030 本发明的步骤(1)中， 所述核酸纳米结构的制备方法包括以下步骤： 0031 将订书钉链混合溶液加入到脚手架链溶液中， 所述脚手架链与订书钉链的摩尔比 为1:(2-50)， 混匀； 以90-100为起始温度进行降温退火至15-25， 整个过程持续10h以 上， 制得所述核酸纳米结构。 0032 所述脚手架链与订书钉链的摩尔比为1:(2-50)， 例如1:2、 1:5、 1:8、 1:10、 1:12、 1: 15、 1:18、 1:20、 1:25、 1:28、 1。
25、:30、 1:40或1:50， 优选为1:(5-30)， 进一步优选为1:(10-25)。 0033 所述降温退火的起始温度为90-100， 例如90、 91、 92、 93、 94、 95、 96 、 97、 98或100， 优选为93-96， 进一步优选为95。 0034 所述降温退火的终点温度为15-25， 例如15、 18、 19、 20、 22或25， 优 选为18-22， 进一步优选为20。 0035 所述降温退火过程的持续时间为10h以上， 例如10h、 12h、 14h、 15h、 18h、 20h、 25h、 26h或28h， 优选为10-26h， 进一步优选为12-24h。。
26、 0036 本发明步骤(2)中， 所述金纳米棒通过以下方法制备： 利用晶种诱导生长法制备金 纳米棒； 使用十六烷基三甲基溴化铵进行修饰； 使用合成的巯基化寡核苷酸序列替代十六 烷基三甲基溴化铵， 由此完成金纳米棒的DNA表面修饰。 0037 本发明步骤(3)中， 所述核酸纳米结构与金纳米棒的摩尔比为1:(1-3)， 例如1:1、 1:1.5、 1:2、 1:2.5或1:3， 优选为1:2。 0038 所述步骤(3)中的降温退火为从40-45(例如40、 41、 42、 43或45)， 逐 渐降温退火至20-25(例如20、 21、 22、 23或25)， 此退火降温过程为一个循环， 共30-6。
27、0个循环(例如循环数为30、 32、 35、 40、 45、 50、 55或60)， 优选30-45个循环， 每摄氏度 为一个梯度， 每梯度保持3-5min(例如3min、 3.5min、 4min、 4.5min或5min)。 0039 所述步骤(3)中的电泳条件为： 0.5-1琼脂糖胶、 电泳环境温度4-10、 电泳缓冲 液为0.5-1TBE缓冲液并含5-11mM Mg2+、 电泳电压为10-15V/cm、 且电泳时间为30-50min。 0040 本发明步骤(4)中， 所述量子点与负载有金纳米棒的核酸纳米结构的摩尔比为(3- 5):1， 例如3:1、 3.5:1、 4:1、 4.5:1或。
28、5:1， 优选为4:1。 0041 所述步骤(4)中的孵育在室温下进行， 优选在18-25下进行。 0042 所述步骤(4)中的孵育的时间为1-3h， 例如1h、 1.5h、 2h、 2.5h或3h， 优选为2h。 0043 第三方面， 本发明还提供了如第一方面所述的集光学和光声于一体的双模态分子 影像探针在制备活体光学和光声成像造影剂或肿瘤手术导航探针中的应用。 说 明 书 4/8 页 7 CN 106620725 A 7 0044 所述肿瘤为卵巢癌、 乳腺癌、 非小细胞癌、 头颈癌、 食管癌、 肝癌、 肺腺细胞癌、 前列 腺癌或非何金氏淋巴瘤中的一种或至少两种的组合。 0045 与现有技术。
29、方案相比， 本发明至少具有以下有益效果： 0046 本发明所提供的双模态分子影像探针是集光学成像和光声成像于一体的， 其利用 核酸纳米结构将金纳米棒和量子点结合在一起， 实现了双模态分子影像探针在动物水平上 的光学及光声成像效果。 附图说明 0047 图1为DNA折纸纳米结构-金纳米棒-量子点复合结构电镜图； 0048 图2为注射核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物(Orgami-AuNR-QD)， 核酸纳米 结构、 金纳米棒与量子点混合物(Origami+AuNR+QD)样品后裸鼠的光学成像结果； 0049 图3为核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物(Orgami-AuNR-QD)， 核酸纳。
30、米结构、 金纳米棒与量子点混合物(Origami+AuNR+QD)以及游离金纳米棒样品(AuNR)的仿体光声成 像结果， 其中图3-A为核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物以及核酸纳米结构、 金纳米棒 与量子点混合物样品的仿体光声成像结果， 其每个成像结果的左侧圆环为核酸纳米结构- 金纳米棒-量子点复合物样品， 右侧为核酸纳米结构、 金纳米棒与量子点混合物样品， 图3-B 为游离金纳米棒样品的仿体光声成像结果， 其左侧和中间的成像结果分别包括两个浓度的 游离金纳米棒样品， 右侧的成像结果中均为0.375nM的游离金纳米棒样品； 0050 图4为核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物(Orgami。
31、-AuNR-QD)， 核酸纳米结构、 金纳米棒与量子点混合物(Origami+AuNR+QD)以及游离金纳米棒样品(AuNR)的光声成像数 据的分析。 0051 下面对本发明进一步详细说明。 但下述的实例仅仅是本发明的简易例子， 并不代 表或限制本发明的权利保护范围， 本发明的保护范围以权利要求书为准。 具体实施方式 0052 下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。 0053 为更好地说明本发明， 便于理解本发明的技术方案， 本发明的典型但非限制性的 实施例如下： 0054 器材： Mastercycler Pro梯度PCR仪(Eppendorf， 德国)， 5810R小。
32、型高速离心机 (Eppendorf， 德国)， UV-2450紫外-可见分光光度计(岛津， 日本)， 透射电镜(日立)， 双光子 荧光显微镜(Olympus， 日本)， 全自动化学发光/荧光图像分析系统， 超纯水处理系统 (Miilipore Reference-Q， 德国)， 等离子处理机(Emitch K100X， 美国)。 0055 原料： 短链核苷酸序列(订书钉链， Nature， 2006， 440， 297-302)购自上海英潍捷基 生物技术有限公司， M13噬菌体基因组DNA购自New England Biolabs公司。 量子点购自美国 Life Technology公司。 C。
33、TAB、 氯金酸、 硼氢化钠、 硝酸银等其他原料均购自美国Sigma- Aldrich公司。 0056 试剂： 实验中所用的缓冲溶液有TAE/Mg2+缓冲溶液(pH 8.3)和PBS缓冲溶液(pH 7.4)。 其中， 1TAE/Mg2+缓冲溶液(pH 8.3)的组分为： 410-2mol/L Tris， 210-2mol/L乙 酸， 2.010-3mol/L EDTA和1.2510-2mol/L醋酸镁； 1PBS缓冲溶液(pH 7.4)的组成为： 说 明 书 5/8 页 8 CN 106620725 A 8 136.910-3mol/L(8.00g/L)NaCl， 2.6810-3mol/L(。
34、0.20g/L)KCl， 9.7510-3mol/L (1.56g/L)Na2HPO4H2O和1.4710-3mol/L(0.20g/L)KH2PO4； 这些缓冲溶液所用的试剂均 为分析纯， 购自Sigma-Aldrich公司。 0057 实施例1制备核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物 0058 (1)核酸纳米结构的合成 0059 将终浓度为10nM的M13噬菌体基因组DNA和终浓度为100nM的订书钉链及捕获订书 钉链混合在终浓度为1TAE/Mg2+(pH8.3)的溶液中， 最终获得混合溶液的体积为100 L。 控制上述混合溶液的温度从95逐步退温降火至20， 整个降温过程控制在12小时以。
35、上， 从而获得既定的核酸纳米结构。 0060 (2)利用晶种诱导生长法， 表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)， 还原剂为 抗坏血酸， 通过控制AgNO3浓度来制备金纳米棒(参见Chem Mater,2003,15(10):1957- 62.)。 具体方法如下： 0061 (a)晶种的合成： 取7.5mL浓度为100mM的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)， 50 L浓度 为2(w/v)的HAuCl4加入至20mL圆底烧瓶中。 搅拌均匀后， 迅速加入浓度为6mM预冷的NaBH4 1000 L， 再次搅拌均匀， 约2min， 溶液颜色逐渐由无色变为棕黄色后， 停止搅拌， 将烧瓶移至 30水。
36、浴中静置2小时， 备用。 0062 (b)金纳米棒的生长： 在装有10mL浓度为100mM的CTAB的20mL圆底烧瓶中加入85 L 浓度为2(w/v)的HAuCl4， 液体颜色为橙色。 搅拌均匀后， 在该混合液中加入80 L浓度为 10mM的AgNO3， 缓慢搅拌。 再次搅拌均匀后， 继续在高速搅拌的状态下加入60 L浓度为100mM 的抗坏血酸， 温柔振荡至溶液为无色。 最后加入20 L步骤(a)合成的晶种溶液。 搅拌均匀后， 将溶液置于30温水浴中静置10小时， 溶液为紫红色。 0063 (c)金纳米棒的纯化： 将合成的金纳米棒转移至15mL离心管内(8000rpm， 30分钟) 进行超。
37、速离心。 倒掉上清溶液后， 在离心管内加入10mL去离子水重新分散， 再次以8000rpm 的条件离心30min， 反复数次后保留底部沉淀， 即金纳米棒， 加入20 L去离子水分散。 通过紫 外-可见分光光度计测定所获得的金纳米棒的浓度。 0064 (d)利用巯基化DNA修饰金纳米棒， 具体方法如下： 0065 取 2 0 0 倍 过 量 的 T C E P ( 2 0 0 m M ) 试 剂 对 浓 度 为 1 0 0M 巯 基 化 D N A (ACGCTTTTTTTTTTTTTTT-SH， 100 M)进行还原， 反应时间为4小时， 然后通过G-25体积排阻柱 离心除去过量的TCEP。 。
38、配制修饰缓冲溶液(89mM Tris base、 89mM硼酸、 2mM EDTA、 500mM NaCl和0.01SDS)， 用pH计对溶液pH值进行监测， 保证溶液pH值为5-6后， 加入浓度高于金 纳米棒1000倍的还原后的巯基化DNA， 将上述溶液混合均匀后， 在高效振动时加入金纳米 棒， 混合均匀后， 静置于30水浴中过夜备用。 0066 对于修饰了巯基化DNA的金纳米棒， 放入离心机内进行离心(8000rpm， 30min)， 回 收所得的金纳米棒， 加入适量去离子水， 重复上述离心过程， 洗去过量的DNA。 0067 (3)DNA折纸结构与金纳米棒的组装 0068 将经过PCR仪。
39、器程序控温组装后的核酸纳米结构， 利用离心柱(100kDa)纯化去除 过量的DNA订书钉链和捕获链。 将已修饰的金纳米棒和DNA折纸结构以2:1的比例进行混合， 再次置于PCR仪器内对其进行控温退火， 控温条件为： 45-25为一个循环， 每保持 3min， 重复20个循环以上， 以保证修饰在金纳米棒上的DNA分子可以同DNA折纸结构上的捕 说 明 书 6/8 页 9 CN 106620725 A 9 获订书钉链杂交效果。 0069 (4)量子点与载有金纳米棒的DNA折纸复合结构的组装 0070 将4倍过量的量子点与载有金纳米棒的DNA折纸复合结构混合， 在室温的条件下即 可， 孵育2小时， 。
40、以保证在室温条件下生物素和链霉亲和素充分反应。 0071 以核酸纳米结构为载体的金纳米棒和量子点组装产物的提纯 0072 电泳纯化： 制备1的琼脂糖(1TBE缓冲溶液， Agrose试剂)， 在加热条件下溶解， 加入2.5 L溴化乙锭对其预先染色。 将修饰了DNA的金纳米棒、 DNA折纸结构、 DNA-金纳米棒- 量子点加入至所制备的1琼脂糖凝胶孔中， 对上述产物进行电泳分离， 电泳所需离子环境 为0.5TBE缓冲溶液， 10mM Mg2+。 电泳所需要的电压为85V， 45min。 在白光和紫外光下分别 确定组合产物在琼脂糖凝胶中的位置， 并对其进行拍照存储， 切下目标条带， 利用凝胶纯化 。
41、柱在4以离心的方法得到纯净浓缩的产物。 0073 采用透射电子显微镜对以核酸纳米结构为载体的量子点和金纳米棒组装产物的 表征 0074 碳支持膜(铜网)经等离子体处理机辉光溅射进行处理， 滴加10 L上述纯化后的复 合结构的产物， 沉积至铜网10min后， 吸弃多余液体， 再次滴加浓度为0.7的醋酸双氧铀对 铜网进行负染， 沉积30秒钟后， 滤纸吸干醋酸双氧铀， 待干燥后用透射电镜观察样品。 以型 号为HT7700的投射电子显微镜在80kV的条件下， 对产物拍照表征。 0075 如图1所示， 图1为DNA折纸纳米结构-金纳米棒-量子点复合结构电镜图， 从透射电 子显微镜可见， DNA折纸纳米结。
42、构-金纳米棒-量子点复合结构形成良好， 在组装和纯化过程 的情况下， 核酸纳米结构仍旧能够保持完好的形貌， 无不利影响。 0076 实施例2核酸纳米结构-金纳米棒-量子点的活体光学成像 0077 将实施例1制备得到的核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物和对照组核酸纳米 结构、 金纳米棒与量子点混合物两组样品各取100 L在5-6周雌性BALB/C裸鼠背部皮下进行 给药处理， 注射后利用小动物光学成像系统对裸鼠进行活体光学成像。 0078 如图2所示为注射样品后裸鼠的光学成像结果。 由图2可见， 将量子点组装在载有 金纳米棒的核酸纳米结构上的光学信号相对于没有进行组装而只是将核酸纳米结构、 金纳。
43、 米棒与量子点混合的情况下的光学信号显著， 这说明经组装后， 核酸纳米结构-金纳米棒- 量子点复合物相比核酸纳米结构、 金纳米棒与量子点混合物具有更强的光学信号。 0079 实施例3核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物的仿体光声成像 0080 图3所示为核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物、 核酸纳米结构、 金纳米棒与量 子点混合物以及游离金纳米棒样品的仿体光声成像结果， 分三组进行对比实验， 分别为金 纳米棒组(100 L)， 核酸纳米结构-金纳米棒-量子点(100 L)复合物和核酸纳米结构、 金纳 米棒与量子点的混合物(100 L)加入到仿体内进行光声实验， 分别在浓度为6nM、 3nM、。
44、 1.5nM、 0.75nM、 0.375nM的情况下对光声信号进行采集。 其中图3-A为核酸纳米结构-金纳米 棒-量子点复合物以及核酸纳米结构、 金纳米棒与量子点混合物样品的仿体光声成像结果， 其每个成像结果的左侧圆环为核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物样品， 右侧为核酸纳 米结构、 金纳米棒与量子点混合物样品， 图3-B为游离金纳米棒样品的仿体光声成像结果， 其左侧和中间的成像结果分别包括两个浓度的游离金纳米棒样品， 右侧的成像结果中均为 0.375nM的游离金纳米棒样品。 说 明 书 7/8 页 10 CN 106620725 A 10 0081 图4为对光声成像数据的分析， 可以观察。
45、到与单独金纳米棒样品、 核酸纳米结构、 金纳米棒与量子点混合物类似， 核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物信号可以较好的吻 合， 该结果进一步证明了核酸纳米结构-金纳米棒-量子点复合物是一种良好的纳米探针材 料， 可以进行实时的光声成像， 有望为肿瘤检测双模态分子影像探针提供基础， 具有极大的 应用价值。 0082 申请人声明， 本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征， 但本发明并 不局限于上述详细结构特征， 即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征才能实施。 所 属技术领域的技术人员应该明了， 对本发明的任何改进， 对本发明所选用部件的等效替换 以及辅助部件的增加、 具体方式的选择等。
46、， 均落在本发明的保护范围和公开范围之内。 0083 以上详细描述了本发明的优选实施方式， 但是， 本发明并不限于上述实施方式中 的具体细节， 在本发明的技术构思范围内， 可以对本发明的技术方案进行多种简单变型， 这 些简单变型均属于本发明的保护范围。 0084 另外需要说明的是， 在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征， 在不矛 盾的情况下， 可以通过任何合适的方式进行组合， 为了避免不必要的重复， 本发明对各种可 能的组合方式不再另行说明。 0085 此外， 本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合， 只要其不违背本 发明的思想， 其同样应当视为本发明所公开的内容。 说 明 书 8/8 页 11 CN 106620725 A 11 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 12 CN 106620725 A 12 图3-A 图3-B 图4 说 明 书 附 图 2/2 页 13 CN 106620725 A 13 。