一种促进甘草不定根中甘草酸积累的组培方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201611227494.2 (22)申请日 2016.12.27 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 106665356 A (43)申请公布日 2017.05.17 (73)专利权人 天津大学 地址 300072 天津市南开区卫津路92号 (72)发明人 高文远 李建丽 王娟 李金鑫 (74)专利代理机构 天津市北洋有限责任专利代 理事务所 12201 代理人 陆艺 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (56)对比文件 Bussey,H.。

2、et allipidbinding protein LSP1 Saccharomyces cerevisiae S288c. GenBank .2016,第1-2页. 审查员 王涛 (54)发明名称 一种促进甘草不定根中甘草酸积累的组培 方法 (57)摘要 本发明公开了一种促进甘草不定根中甘草 酸积累的组培方法， 包括如下步骤： (1)将甘草的 根、 茎或叶接种于固体培养基中诱导甘草不定根 的生成， 将甘草不定根接种于液体培养基中， 培 养33-37天； (2)将抗敏蛋白LSP1加入到步骤(1) 已培养33-37天的甘草不定根的液体培养基中， 使抗敏蛋白LSP1的终浓度为25-200mg/L，。

3、 继续培 养4-6天， 收获， 本发明的方法具有操作简单， 能 显著提高甘草不定根中甘草酸化合物含量， 生长 周期短， 生产成本低， 便于甘草酸的工业化大规 模生产。 权利要求书1页 说明书3页 序列表2页 CN 106665356 B 2018.11.30 CN 106665356 B 1.一种促进甘草不定根中甘草酸积累的组培方法， 其特征是包括如下步骤： (1)将甘草的根、 茎或叶接种于固体培养基中诱导甘草不定根的生成， 将甘草不定根接 种于液体培养基中， 培养33-37天； 所述固体培养基用下述方法配成： 在1/2MS培养基中加入蔗糖使终质量浓度为3-4， 加入吲哚丁酸使终浓度为1.0m。

4、g/L， 加入琼脂使终质量浓度为0.6-0.7， 调节pH5.8- 6.0； 所述液体培养基用下述方法配成： 在1/2MS培养基中加入蔗糖使终质量浓度为3， 加 入吲哚丁酸使终浓度为1.0mg/L， 调节pH5.8-6.0； (2)将抗敏蛋白LSP1加入到步骤(1)已培养33-37天的甘草不定根的液体培养基中， 使 抗敏蛋白LSP1的终浓度为25-200mg/L， 继续培养4-6天， 收获， 所述抗敏蛋白LSP1为SEQ ID NO.1所示。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征是所述步骤(2)抗敏蛋白LSP1的终浓度为50mg/ L。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106665。

5、356 B 2 一种促进甘草不定根中甘草酸积累的组培方法 技术领域 0001 本发明涉及一种利用抗敏蛋白LSP1促进甘草不定根中甘草酸积累的组培方法， 属 于中药甘草组织培养领域。 背景技术 0002 甘草酸(Glycyrrhizic acid)属于E型皂苷的一种， 是甘草中含量最丰富的皂苷。 作为甘草中最主要的活性成分， 甘草酸主要有以下几种用途： (1)医药工业： 甘草酸具有抗 炎保肝、 抗病毒、 抗肿瘤、 干扰素诱生剂， 调节免疫功能等作用， 临床应用于慢性肝炎、 支气 管炎和艾滋病及多种癌症的防治。 (2)食品及卷烟业： 甘草酸是一种高甜度低热值的保健甜 味剂， 其甜度约为蔗糖的250。

6、倍以上， 添加于食品， 饮料， 糖果中作甜味剂， 可克服多用糖而 引起的发酵， 酸败等缺点， 而且有杀菌、 洁齿、 消炎、 润喉等功用。 (3)化妆品工业： 甘草酸分 子中含有亲水性基团和亲油性基团， 能降低水溶液表面张力， 有很强的发泡力， 具有乳化、 分散、 保湿润发、 软化皮肤、 抗皱、 抗皮脂、 防治色素沉积、 消炎止痒及洗涤去污的效果。 0003 尽管甘草酸有如此之多的用途， 但从甘草或甘草不定根中进行提取， 其收率较低， 难于满足工业生产的需要。 0004 目前尚未有利用抗敏蛋白LSP1促进甘草不定根中甘草酸积累的报道。 发明内容 0005 本发明的目的在于克服现有技术存在的甘草不。

7、定根组培方法中甘草酸化合物含 量较低的不足， 提供一种促进甘草不定根中甘草酸积累的组培方法。 0006 本发明的技术方案概述如下： 0007 一种促进甘草不定根中甘草酸积累的组培方法， 包括如下步骤： 0008 (1)将甘草的根、 茎或叶接种于固体培养基中诱导甘草不定根的生成， 将甘草不定 根接种于液体培养基中， 培养33-37天； 0009 所述固体培养基用下述方法配成： 在1/2MS培养基中加入蔗糖使终质量浓度为3- 4， 加入吲哚丁酸使终浓度为1.0mg/L， 加入琼脂使终质量浓度为0.6-0.7， 调节pH 5.8-6.0； 0010 所述液体培养基用下述方法配成： 在1/2MS培养基。

8、中加入蔗糖使终质量浓度为 3， 加入吲哚丁酸使终浓度为1.0mg/L， 调节pH5.8-6.0； 0011 (2)将抗敏蛋白LSP1加入到步骤(1)已培养33-37天的甘草不定根的液体培养基 中， 使抗敏蛋白LSP1的终浓度为25-200mg/L， 继续培养4-6天， 收获， 所述抗敏蛋白LSP1用 SEQ ID NO.1所示。 0012 步骤(2)抗敏蛋白LSP1的终浓度为50mg/L。 0013 本发明的优点： 0014 本发明的方法具有操作简单， 能显著提高甘草不定根中甘草酸化合物含量， 生长 周期短， 生产成本低， 便于甘草酸的工业化大规模生产。 说 明 书 1/3 页 3 CN 10。

9、6665356 B 3 具体实施方式 0015 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。 0016 MS培养基， 商品化。 0017 PDA培养基， (20土豆+2葡萄糖+2琼脂,余量是水) 0018 实施例1 0019 固体培养基用下述方法配成： 在1/2MS培养基中加入蔗糖使终质量浓度为3.5， 加入吲哚丁酸使终浓度为1.0mg/L， 加入琼脂使终质量浓度为0.65， 调节pH5.9。 0020 实施例2 0021 固体培养基用下述方法配成： 在1/2MS培养基中加入蔗糖使终质量浓度为4， 加 入吲哚丁酸使终浓度为1.0mg/L， 加入琼脂使终质量浓度为0.6， 调节pH5.8。 002。

10、2 实施例3 0023 固体培养基用下述方法配成： 在1/2MS培养基中加入蔗糖使终质量浓度为3， 加 入吲哚丁酸使终浓度为1.0mg/L， 加入琼脂使终质量浓度为0.7， 调节pH6.0。 0024 实施例4 0025 液体培养基用下述方法配成： 在1/2MS培养基中加入蔗糖使终质量浓度为3， 加 入吲哚丁酸使终浓度为1.0mg/L， 调节pH5.9。 0026 实施例5 0027 液体培养基用下述方法配成： 在1/2MS培养基中加入蔗糖使终质量浓度为3， 加 入吲哚丁酸使终浓度为1.0mg/L， 调节pH5.8。 0028 实施例6 0029 液体培养基用下述方法配成： 在1/2MS培养基。

11、中加入蔗糖使终质量浓度为3， 加 入吲哚丁酸使终浓度为1.0mg/L， 调节pH6.0。 0030 实施例7 0031 一种促进甘草不定根中甘草酸积累的组培方法， 包括如下步骤： 0032 (1)将甘草的根接种于实施例1配制的固体培养基中诱导甘草不定根的生成， 将甘 草不定根接种于实施例4配制的液体培养基中， 培养35天； 0033 (2)将抗敏蛋白LSP1加入到步骤(1)已培养35天的甘草不定根的液体培养基中， 使 抗敏蛋白LSP1的终浓度为50mg/L， 继续培养5天， 收获， 所述抗敏蛋白LSP1用SEQ ID NO.1所 示。 0034 实施例8 0035 一种促进甘草不定根中甘草酸积。

12、累的组培方法， 包括如下步骤： 0036 (1)将甘草的茎接种于实施例2配制的固体培养基中诱导甘草不定根的生成， 将甘 草不定根接种于实施例5配制的液体培养基中， 培养33天； 0037 (2)将抗敏蛋白LSP1加入到步骤(1)已培养33天的甘草不定根的液体培养基中， 使 抗敏蛋白LSP1的终浓度为25mg/L， 继续培养6天， 收获， 所述抗敏蛋白LSP1用SEQ ID NO.1所 示。 0038 实施例9 0039 一种促进甘草不定根中甘草酸积累的组培方法， 包括如下步骤： 说 明 书 2/3 页 4 CN 106665356 B 4 0040 (1)将甘草的叶接种于实施例3配制的固体培养。

13、基中诱导甘草不定根的生成， 将甘 草不定根接种于实施例6配制的液体培养基中， 培养37天； 0041 (2)将抗敏蛋白LSP1加入到步骤(1)已培养37天的甘草不定根的液体培养基中， 使 抗敏蛋白LSP1的终浓度为200mg/L， 继续培养4天， 收获， 所述抗敏蛋白LSP1用SEQ ID NO.1 所示。 0042 实施例10 0043 甘草不定根的组培方法(对照组)， 包括如下步骤： 0044 将甘草根接种于实施例1配制的固体培养基中诱导甘草不定根的生成， 将甘草不 定根接种于实施例4配制的液体培养基中， 培养40天， 收获。 0045 实施例11 0046 各实施例获得的甘草不定根中甘草。

14、酸化合物的提取及含量测定： 0047 (1)色谱条件 0048 液相色谱条件： 色谱柱为Kromasil C18(4.6mm250mm,5 m)； 流动相A： 乙腈， B： 0.05磷酸； 梯度洗脱程序： 08min， A： 19； 835min， A为1950； 3536min， A为50 100； 3640min， A为10019。 检测波长237nm； 柱温30； 流速1.0mLmin-1； 进样体积 为20 L。 0049 (2)标准品溶液的制备 0050 精密称取甘草酸标品1mg， 加少量甲醇超声溶解后置于5mL容量瓶中， 再用甲醇定 容至刻度， 分别得到甘草酸对照品储备液。 对照品。

15、储备液用0.22 m微孔滤膜过滤后密封， 置 冰箱中保存备用。 0051 (3)样品溶液的制备 0052 精密称取0.2g实施例7、 8、 9、 10获得的甘草不定根， 干燥后获得的甘草不定根样品 分别置于50mL具塞三角瓶中， 各加入20mL甲醇， 超声提取(250W， 40kHz)30min， 然后60水 浴振荡器振荡90min， 过滤， 滤渣再加入20mL甲醇， 超声提取(250W， 40kHz)30min， 然后60 水浴振荡器振荡90min， 过滤， 合并滤液。 挥干(提取物)， 再加入1mL甲醇超声溶解， 再加甲醇 定容至1mL， 用高效液相色谱仪。 0053 实验结果： 实施例7。

16、、 8、 9、 10测定的甘草酸含量依次为0.41mg/g、 0.32mg/g、 0.28mg/g、 0.12mg/g。 0054 抗敏蛋白LSP1由北京华大蛋白公司鉴定， 其序列(SEQ ID NO.1)为： 0055 0056 说 明 书 3/3 页 5 CN 106665356 B 5 0001 SEQUENCE LISTING 0002 天津大学 0003 一种促进甘草不定根中甘草酸积累的组培方法 0004 0005 1 0006 PatentIn version 3.3 0007 1 0008 341 0009 PRT 0010 Saccharomyces cerevisiae st。

17、rain 0011 1 0012 Met His Arg Thr Tyr Ser Leu Arg Asn Gln Arg Ala Pro Thr Ala Ala 0013 1 5 10 15 0014 Glu Leu Gln Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ser Ser Thr Lys Ser Lys Phe 0015 20 25 30 0016 Phe Gly Lys Ala Ser Ile Ala Ser Ser Phe Arg Lys Asn Ala Ala Gly 0017 35 40 45 0018 Asn Phe Gly Pro Glu Leu Ala Arg L。

18、ys Leu Ser Gln Leu Val Lys Thr 0019 50 55 60 0020 Glu Lys Gly Val Leu Arg Ala Met Glu Val Val Ala Ser Glu Arg Arg 0021 65 70 75 80 0022 Glu Ala Ala Lys Gln Leu Ser Leu Trp Gly Ala Asp Asn Asp Asp Asp 0023 85 90 95 0024 Val Ser Asp Val Thr Asp Lys Leu Gly Val Leu Ile Tyr Glu Leu Gly 0025 100 105 110 。

19、0026 Glu Leu Gln Asp Gln Phe Ile Asp Lys Tyr Asp Gln Tyr Arg Val Thr 0027 115 120 125 0028 Leu Lys Ser Ile Arg Asn Ile Glu Ala Ser Val Gln Pro Ser Arg Asp 0029 130 135 140 0030 Arg Lys Glu Lys Ile Thr Asp Glu Ile Ala His Leu Lys Tyr Lys Asp 0031 145 150 155 160 0032 Pro Gln Ser Thr Lys Ile Pro Val L。

20、eu Glu Gln Glu Leu Val Arg Ala 0033 165 170 175 0034 Glu Ala Glu Ser Leu Val Ala Glu Ala Gln Leu Ser Asn Ile Thr Arg 0035 180 185 190 0036 Glu Lys Leu Lys Ala Ala Tyr Ser Tyr Met Phe Asp Ser Leu Arg Glu 0037 195 200 205 0038 Leu Ser Glu Lys Phe Ala Leu Ile Ala Gly Tyr Gly Lys Ala Leu Leu 序 列 表 1/2 页。

21、 6 CN 106665356 B 6 0039 210 215 220 0040 Glu Leu Leu Asp Asp Ser Pro Val Thr Pro Gly Glu Ala Arg Pro Ala 0041 225 230 235 240 0042 Tyr Asp Gly Tyr Glu Ala Ser Arg Gln Ile Ile Met Asp Ala Glu Ser 0043 245 250 255 0044 Ala Leu Glu Ser Trp Thr Leu Asp Met Ala Ala Val Lys Pro Thr Leu 0045 260 265 270 0。

22、046 Ser Phe His Gln Thr Val Asp Asp Val Tyr Glu Asp Glu Asp Gly Glu 0047 275 280 285 0048 Glu Glu Glu Glu Pro Glu Ile Gln Asn Gly Asp Ile Pro Gly Gln Val 0049 290 295 300 0050 Val Glu Glu Glu Glu Val Glu Trp Thr Thr Glu Val Pro Val Asp Asp 0051 305 310 315 320 0052 Glu Ala His Glu Ala Asp His His Val Ser Gln Asn Gly His Thr Ser 0053 325 330 335 0054 Gly Ser Glu Asn Ile 0055 340 序 列 表 2/2 页 7 CN 106665356 B 7 。