治疗奶牛子宫内膜炎的中药灌注液及其制备工艺.pdf

本发明涉及一种治疗奶牛子宫内膜炎的中药灌注液，还涉及该中药灌注液的制备工艺，包括以下重量份数的原料：诃子10-20份，黄连25-35份，黄柏25-35份，白芍10-20份，益母草118-128份,当归70-80份，川芎25-35份，龙胆40-50份，车前子25-35份，栀子25-35份，泽泻40-50份，该灌注液对奶牛子宫内膜炎病原菌具有良好的抑菌作用。

1.  一种治疗奶牛子宫内膜炎的中药灌注液，其特征在于：包括以下重量份数的原料：诃子10-20份，黄连25-35份，黄柏25-35份，白芍10-20份，益母草118-128份,当归70-80份，川芎25-35份，龙胆40-50份，车前子25-35份，栀子25-35份，泽泻40-50份。

2.  根据权利要求1所述的治疗奶牛子宫内膜炎的中药灌注液，其特征在于：包括以下重量份数的原料：诃子15份，黄连30份，黄柏30份，白芍15份，益母草123份,当归75份，川芎30份，龙胆45份，车前子30份，栀子30份，泽泻45份。

3.  一种如权利要求1所述的治疗奶牛子宫内膜炎的中药灌注液的制备方法，其特征在于：具体如下：
取诃子、黄连、黄柏、白芍、益母草、当归、川芎、龙胆、车前子、栀子和泽泻原料，加10倍于药材总量的蒸馏水于烧杯中浸泡30min，急火煮沸后文火熬制60min，用纱布过滤，药渣再分别加8倍水和6倍水加热60min，合并3次滤液，浓缩至相当于生药的浓度为0.5-2g/mL的药液，3000r/min离心20min，过滤，水蒸灭菌，4℃密封保存备用。

4.  一种如权利要求2所述的治疗奶牛子宫内膜炎的中药灌注液的制备方法，其特征在于：具体如下：
取诃子、黄连、黄柏、白芍、益母草、当归、川芎、龙胆、车前子、栀子和泽泻原料，加10倍于药材总量的蒸馏水于烧杯中浸泡30min，急火煮沸后文火熬制60min，用纱布过滤，药渣再分别加8倍水和6倍水加热60min，合并3次滤液，浓缩至相当于生药的浓度为0.5-2g/mL的药液，3000r/min离心20min，过滤，水蒸灭菌，4℃密封保存备用。

治疗奶牛子宫内膜炎的中药灌注液及其制备工艺
技术领域
本发明涉及一种治疗奶牛子宫内膜炎的中药灌注液，还涉及该中药灌注液的制备工艺。 
背景技术
奶牛子宫内膜炎（puerperal endometritis）为子宫内膜的急性炎症，是奶牛最为常见的繁殖障碍性疾病,发病率高,死亡率低,常呈慢性经过。奶牛患子宫内膜炎使受精卵不能着床或胚胎早期死亡，延长了产犊间隔，严重地影响了奶牛的繁殖力和生产性能，该病常常不能引起人们的重视,给奶牛养殖户造成较大的经济损失,是危害奶牛养殖业的重要疾病之一。 
奶牛子宫内膜炎在国外的发病率为10%～20%，甚至有些管理不好的牛场高达30%以上，而90%的奶牛不孕症是由子宫内膜炎引起的。奶牛子宫内膜炎在我国的发病率也很高，约为20%~50%，且60%~90%奶牛不孕症是由子宫内膜炎引起的。报道称高产奶牛最易发生奶牛子宫内膜炎。在经济损失方面，每头患牛泌乳期花费很高，产后子宫内膜炎的患牛，产犊时间延长了2周到2个月不等，空怀期80至110天，每天的经济损失约为2~2.25美元；美国因奶牛不孕症损失达2.5亿美元，产后子宫疾病造成的经济损失增加到285美元/头。同样，在德国奶牛产后繁殖疾病的半数经济损失是由产后阴道炎和子宫内膜炎造成。 
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足而提供一种治疗奶牛子宫内膜炎的中药灌注液及其制备工艺，该灌注液对奶牛子宫内膜炎病原菌具有良好的抑菌作用。 
本发明的目的是这样实现的： 
一种治疗奶牛子宫内膜炎的中药灌注液，其特征在于：包括以下重量份数的原料：诃子10-20份，黄连25-35份，黄柏25-35份，白芍10-20份，益母草118-128份,当归70-80份，川芎25-35份，龙胆40-50份，车前子25-35份，栀子25-35份，泽泻40-50份。
一种如上所述的治疗奶牛子宫内膜炎的中药灌注液的制备方法，具体如下：取诃子、黄连、黄柏、白芍、益母草、当归、川芎、龙胆、车前子、栀子和泽泻原料，加10倍于药材总量的蒸馏水于烧杯中浸泡30min，急火煮沸后文火熬制60min，用纱布过滤，药渣再分别加8倍水和6倍水加热60min，合并3次滤液，浓缩至相当于生药的浓度为0.5-2g/mL的药液，3000r/min离心20min，过滤，水蒸灭菌，4℃密封保存备用。 
基于以上所述，包括以下重量份数的原料：诃子15份，黄连30份，黄柏30份，白芍15份，益母草123份,当归75份，川芎30份，龙胆45份，车前子30份，栀子30份，泽泻45份。 
一种如上所述的治疗奶牛子宫内膜炎的中药灌注液的制备方法，具体如下：取诃子、黄连、黄柏、白芍、益母草、当归、川芎、龙胆、车前子、栀子和泽泻原料，加10倍于药材总量的蒸馏水于烧杯中浸泡30min，急火煮沸后文火熬制60min，用纱布过滤，药渣再分别加8倍水和6倍水加热60min，合并3次滤液，浓缩至相当于生药的浓度为0.5-2g/mL的药液，3000r/min离心20min，过滤，水蒸灭菌，4℃密封保存备用。 
子宫内膜炎的病因分析： 
1）病原微生物感染
病原微生物感染是奶牛子宫内膜炎的直接诱因，包括细菌、真菌、支原体、病毒及寄生虫等；通过外源性或内源性途径，机体可混合感染多种病原菌或单一感染一种病原菌，混合感染率显著高于单一感染。产后母牛产道损伤、抗病力降低，条件性致病菌经淋巴或血液进入子宫，在子宫内迅速繁殖引起感染。
2）细菌 
国内外的研究均表明，细菌在奶牛子宫内膜炎的发生中起着重要作用（Li et al. 2011）。据报道，有人从子宫内膜炎患牛的子宫内分离到多种细菌，主要包括大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、绿脓杆菌、棒状杆菌、假单胞菌、坏死杆菌、变形杆菌、生殖器杆菌和嗜血杆菌等。有研究者也从患牛子宫内分离出大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、假单胞菌、棒状杆菌和芽胞杆菌属。报道称引起子宫内膜炎的主要病原菌是大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、芽胞杆菌和棒状杆菌。有研究者在南京地区分离的25份患牛子宫分泌物病料中，有10株葡萄球菌、8株大肠杆菌、6株链球菌，这说明该牛场子宫内膜炎的主要致病菌为葡萄球菌、大肠杆菌和链球菌。国内外也很多报道奶牛子宫内膜炎的主要病原菌是链球菌、大肠杆菌、葡萄球菌。还有人报道螺旋体和弧菌也可引起子宫感染。不同地区和不同情况下分离到的细菌种类及其所占比例不同，这可能与饲养管理、环境、牛的品种、应用抗生素情况和试验方法等有关。
3）其他病原菌 
念珠菌、放线菌、毛霉菌等。白色念珠菌、耐热念珠菌和烟曲霉菌等真菌的纯培养物有100%致病性，与细菌混合感染的毒力最强。研究表明，酵母菌也能引起牛子宫内膜炎，从子宫内膜炎的奶牛子宫内容物中能分离到酵母菌。有人从牛生殖道分离出了生殖道支原体（霉形体）、T霉形体和莱时霉形体，用霉形体感染处女牛，毒力最强的是生殖道霉形体，较弱的是MDiv-294，最弱的是莱时霉形体。研究发现，病毒也可引发奶牛死胎、流产、不孕或其他繁殖疾病。毛滴虫、钩端螺旋体、立克次氏体、衣原体等也可感染诱发奶牛产后子宫内膜炎。
）影响子宫内膜炎发病的相关因素
研究结果表明，影响子宫内膜炎发病的因素有很多，奶牛的品种、年龄，饲料营养欠缺，特别是缺乏维生素和微量元素及矿物质缺乏或比例失调，饲养管理不佳等外在条件都容易诱发奶牛感染子宫内膜炎；而内分泌失调，机体代谢紊乱以及自身免疫水平低下的奶牛更易发生感染（王鸿英和隋茁 2010）。
5）机体因素 
机体激素水平与子宫感染有着直接关系，卵泡期激素分泌能加强子宫的防御机制，使子宫抵抗力增强；而黄体期抑制了激素的分泌，子宫抵抗力减弱，黄体持续存在、细菌感染等都容易引发子宫内膜炎（赵树臣和王玉杰 2010）。雌激素能促进子宫收缩排出炎性分泌物，从而增强生殖道的防御能力。发情期的母牛由于雌激素分泌较多生殖道的防御能力增强，在间情期由于孕酮含量较多而使生殖道的防御能力降低，更容易感染疾病，如果血浆中孕酮含量未增加，即使给子宫内灌注病原菌也不能使母牛罹患子宫内膜炎，这既说明分娩后黄体和孕酮分泌可增加子宫内膜炎等疾病的发生几率（朱二勇和殷丽霞 2008; Benoit A M and Dailey R A 1991））。
6）机械因素 
生殖器官受到损伤，无论是分娩时助产粗暴、子宫积水或双胎时引起的子宫增大、难产引起的产道物理性损伤、产道子宫的不当检查、子宫阴道脱出，还是配种时操作不当及过度的增加授精的次数和子宫内用药不当以及低钙血等，都会损伤生殖器官，从而破坏黏膜完整性或致使机能紊乱，免疫力低下，为病原微生物繁殖创造了条件（孙红莉 2013; 祁生旺等 1998）。此外，异常妊娠和人工流产也能诱发此病。如有异常胎膜、水肿、炎症、流产、木乃伊胎、胎儿浸溶等都很容易继发子宫内膜炎。超过70.6%和88%以上的胎衣停滞和子宫复旧不全奶牛易发生子宫内膜炎（赵树臣和王玉杰 2010）。
7）饲养管理因素 
营养不足是发生子宫内膜炎的可能因素，缺乏微量元素及一些常量元素容易引起激素分泌失调、酶活性降低及生殖器官组织结构的改变，从而使生殖力下降（李呈敏等 2000; Heidarpour M et al. 2014）。若日粮的营养价值不全，奶牛产后易发生子宫感染。当饲料中维生素A和硒元素不足时，容易导致子宫内膜细胞变性、角质化增生，子宫内膜炎感染的可能性增高；缺乏钙、磷或钙磷比例不当，容易诱发胎衣不下、子宫轻度感染和子宫内膜炎（Bacha B and Regassa F G 2010; Cheong S H et al. 2011）。此外，冬春两季奶牛子宫内膜炎的总发病率较高，为77.9%，而春季占64.4%，夏秋两季占22.0%。年龄胎次也有影响，初产母牛患病较少，据报道，65.0%-72.0%的不孕奶牛为3-6胎发病奶牛。
子宫内膜炎的治疗主要是采用抗生素治疗，激素疗法，中药疗法，本专利主要是采用了中药疗法，下面着重讲述验证机制及中药的抗炎作用，具体如下： 
1）巨噬细胞与炎症的关系
巨噬细胞是由血液中的单核细胞在组织内分化形成，是一种重要的免疫细胞，不仅能抗感染、抗肿瘤、参与免疫调节，还能启动体内炎症介质产生。巨噬细胞在肺中为肺泡巨噬细胞，在结缔组织中为组织细胞，在肝脏中为枯否氏细胞，在神经组织中为神经胶质细胞，骨组织中为蚀骨细胞，在脾脏中为窦内皮细胞，在肾脏中为系膜细胞。巨噬细胞可参与许多炎症疾病的发生发展，起着举足轻重的作用。研究表明，巨噬细胞参与了动脉粥样硬化的发生发展，它聚集在斑块内，释放的效应分子能促进炎性、细胞毒性或趋化性，且能释放基质金属蛋白酶从而使粥样斑块破裂。同样，巨噬细胞与类风湿关节炎密切相关，它存在于炎性关节滑膜内及软骨周围，释放的细胞因子、炎症蛋白和基质蛋白酶均可参与关节内炎症反应，并引起关节损害。
2）脂多糖与子宫内膜炎的关系 
外源性炎症介质包括细菌及其产物脂多糖（LPS）。LPS又称细菌内毒素，与蛋白质、磷脂等一样，是革兰氏阴性菌细胞壁外膜的主要成分。LPS释放的途径除了革兰氏阴性菌菌体自溶或被裂解时释放外，还可在革兰氏阴性菌生长繁殖过程中从细胞壁上脱落形成。产后子宫处于开放状态导致大量细菌进入子宫内，细菌在子宫内生长死亡的同时产生LPS，它会诱发子宫内膜中吞噬细胞、白细胞由于趋化作用在子宫腔中游走而吞噬细菌，随着子宫的复旧及恶露的排出，绝大多数细菌和LPS也会而排出，恶露期结束时正常的牛会清空内部组织碎片、液体、细菌及LPS。若奶牛机体抵抗力下降，就不会将其内部的细菌和LPS排干净，从而引起子宫内膜炎。而恶露期结束后子宫内膜炎的主要致病菌是厌氧菌，在这期间LPS使多数白细胞或吞噬细胞等免疫细胞游走，而后又造成很强的毒性作用，通过子宫内膜进入血液引发机体毒血症，严重时可造成死亡（Kasima- nickam R K et al. 2013）。
LPS作为一种免疫增强剂可以利用其低浓度来诱导中性粒细胞的趋化作用，使白细胞从子宫内膜向子宫腔内渗出从而清除子宫内的细菌。它还能诱导单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞和表皮细胞等免疫细胞分泌IL-8。低浓度的LPS可刺激单核巨噬细胞的功能，高浓度的LPS可导致组织损伤、弥漫性血管内凝血和休克甚至死亡，而TNF的主要细胞产生来源就是LPS活化的单核巨噬细胞。有报道在反复配种的牛子宫内注入1微克LPS就能清除子宫腔内感染的病原菌，运用这种疗法能使多数需要反复配种的牛受孕。 
3）细胞因子与子宫内膜炎的关系 
细胞因子（cytokines）是由体内多种细胞分泌的一类调节细胞反应、能在细胞间传递信息且具有多种生物活性的蛋白质或小分子多肽，它参与机体应激反应，是应激组织损伤发生发展的病理基础，包括干扰素，TNF，IL，集落刺激因子等。产生细胞因子的源细胞包括巨噬细胞、成纤维细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞和内皮细胞等。LPS是一种广泛存在的具有高度活性的致病原，能激活单核巨噬细胞系统，导致TNF-α、IL-6、一氧化氮（NO）等细胞因子大量释放，从而引发全身炎症反应，进一步可发展为多器官功能衰竭，损害多个器官甚至导致死亡。因此，巨噬细胞在炎症的急性反应相中有重要调控作用，被激活后能产生大量细胞因子，构成机体防御反应的第一道防线。细胞因子中TNF-α、IL-1B、IL-6和IL-10等是病原微生物和毒物反应的基础，当病原微生物和内毒素激活巨噬细胞后，巨噬细胞合成大量NO参与炎症反应，因此抑制NO可以有效控制炎症的发展（Li D et al. 2010）。
在雌性哺乳动物的生殖周期中，激素、免疫职能细胞与细胞因子之间相互作用使子宫内膜的形态和功能状态同步，从而为生殖过程提供稳定的内环境。生殖道内子宫内膜上皮细胞、免疫反应细胞、蜕膜细胞、间质细胞、胎盘滋养细胞等均有合成分泌细胞因子的能力，研究发现子宫内有IL-2，IL-6，IL-8和TNF等细胞因子。TNF主要由单核细胞和巨噬细胞分泌，除了在机体抗革兰氏阴性菌感染及其它抗感染过程中发挥着重要作用外，还有很多生物学活性。巨噬细胞受LPS刺激后，除了大量LPS本身的直接毒性作用外，最主要的毒性来自于释放的细胞因子尤其是TNF。雌激素和孕酮对子宫内TNF-α的表达有调节作用。TNF-α是子宫内膜中细胞通讯的介质，关系着子宫内膜的脱落更新，还是维持子宫对合子高敏的重要调节因子。IL-6是活化的T细胞和成纤维细胞产生的淋巴因子，能促进细胞的吞噬功能及细胞粘附，它对机体的免疫、应激和造血起着重要作用，是一种多效应的细胞因子。研究发现，IL-6对炎症反应有很强诱导作用，能引起机体发热，增加白细胞数量，增高血管通透性，还可诱导肝细胞产生急性期蛋白。IL-6可调节子宫内膜组织生长和分化，介导子宫内膜细胞间的相互作用。此外，IL-6还能维持子宫内膜的正常状态，如果其功能受扰，可能会引发子宫内膜癌或子宫内膜异位症。NO广泛存在于机体组织细胞中，具有物质代谢、信息传递和疾病预防等多种生物学功能，并且在炎症和免疫机制中也发挥着双重作用，在显著抑制细胞内外微生物及肿瘤细胞活性的同时又介导细胞毒性。在急、慢性炎症中，NO是重要的致炎因子，由一氧化氮合酶（NOS）催化合成。NOS包括组成型和诱导型，巨噬细胞中的NOS属于诱导型一氧化氮合酶（iNOS），NOS mRNA系统能够表达并激活NOS，从而催化 L-精氨酸氧化生成大量NO，促进炎症反应。 
4）中药的抗炎作用 
炎症作为机体对外源性和内源性损伤因子的防御反应，是由多细胞、多成分参与的临床上比较常见的病理过程，所诱导的免疫和炎症应答紊乱常引起广泛组织损伤，并可加重病情发展。因此，控制炎症是治疗子宫内膜炎等炎症疾病的重要措施。目前临床广泛使用的非甾体类和肾上腺皮脂激素抗炎药物均具有一定副作用。中药抗炎机理、中药抗炎成分以及新药物的开发已成为药物研究的热点。实际上，一直以来，中药在控制动物炎症方面发挥着重要作用。炎性反应的过程是多种炎性介质、因子与机体不断斗争直至达到平衡的过程，而中药可通过多途径多环节发挥抗炎作用，包括抑制炎症介质的产生、分泌，抑制血栓生成以及抑制白细胞的活化等，且一般主要通过影响下丘脑-垂体-肾上腺轴来发挥作用。此外，有研究发现，中药对炎性细胞合成和分泌细胞因子具有双向调节作用，能显著抑制由脂多糖（LPS）诱导或未经LPS诱导的巨噬细胞释放细胞因子，还可抑制脂质过氧化反应、稳定溶酶体、减少肿瘤坏死因子（TNF）的释放。
药理药性分析： 
诃子，清热解毒，收敛养血，调和诸药。用于各种热证，泻痢，黄水病，肝胆病，病后虚弱。
黄连，清热燥湿，泻火解毒。用于湿热痞满，呕吐吞酸，泻痢，黄疸，高热神昏，心火亢盛，心烦不寐，心悸不宁，血热吐衄，目赤，牙痛，消渴，痈肿疔疮；外治湿疹，湿疮，耳道流脓。酒黄连善清上焦火热。用于目赤，口疮。姜黄连清胃和胃止呕。用于寒热互结，湿热中阻，痞满呕吐。萸黄连舒肝和胃止呕。用于肝胃不和，呕吐吞酸。 
黄柏，清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗疮。用于湿热泻痢，黄疸尿赤，带下阴痒，热淋涩痛，脚气痿躄，骨蒸劳热，盗汗，遗精，疮疡肿毒，湿疹湿疮。盐黄柏滋阴降火。用于阴虚火旺，盗汗骨蒸。 
白芍，养血调经，敛阴止汗，柔肝止痛，平抑肝阳。用于血虚萎黄，月经不调，自汗，盗汗，胁痛，腹痛，四肢挛痛，头痛眩晕。 
益母草，活血调经，利尿消肿，清热解毒。用于月经不调，痛经经闭，恶露不尽，水肿尿少，疮疡肿毒。 
当归，补血活血，调经止痛，润肠通便。用于血虚萎黄，眩晕心悸，月经不调，经闭痛经，虚寒腹痛，风湿痹痛，跌扑损伤，痈疽疮疡，肠燥便秘。酒当归活血通经。用于经闭痛经，风湿痹痛，跌扑损伤。 
川芎，活血行气，祛风止痛。用于胸痹心痛，胸胁刺痛，跌扑肿痛，月经不调，经闭痛经，癥瘕腹痛，头痛，风湿痹痛。 
龙胆，清热燥湿，泻肝胆火。用于湿热黄疸，阴肿阴痒，带下，湿疹瘙痒，肝火目赤，E耳鸣耳聋，胁痛口苦，强中，惊风抽搐。 
车前子，清热利尿通淋，渗湿止泻，明目，祛痰。用于热淋涩痛,水肿胀满，暑湿泄泻，目赤肿痛，痰热咳嗽。 
栀子，泻火除烦，清热利湿，凉血解毒；外用消肿止痛。用于热病心烦，湿热黄疸，淋证涩痛，血热吐衄，目赤肿痛，火毒疮疡；外治扭挫伤痛。 
泽泻，利水渗湿，泄热，化浊降脂。用于小便不利，水肿胀满，泄泻尿少，痰饮眩晕，热淋涩痛，高脂血症。 
附图说明
图1为灌注液浓度与小鼠耳廓肿胀率的关系。 
图2为灌注液浓度与小鼠足趾肿胀的关系。 
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的描述。 
实施例1： 
取诃子10克，黄连25克，黄柏25克，白芍10克，益母草118克,当归70克，川芎25克，龙胆40克，车前子25克，栀子25克，泽泻40克原料，加10倍于药材总量的蒸馏水于烧杯中浸泡30min，急火煮沸后文火熬制60min，用纱布过滤，药渣再分别加8倍水和6倍水加热60min，合并3次滤液，浓缩至相当于生药的浓度为0.5-2g/mL的药液，3000r/min离心20min，过滤，水蒸灭菌，4℃密封保存备用。
实施例2： 
取诃子20克，黄连35克，黄柏35克，白芍20克，益母草128克,当归80克，川芎35克，龙胆50克，车前子35克，栀子35克，泽泻50克原料，加10倍于药材总量的蒸馏水于烧杯中浸泡30min，急火煮沸后文火熬制60min，用纱布过滤，药渣再分别加8倍水和6倍水加热60min，合并3次滤液，浓缩至相当于生药的浓度为0.5-2g/mL的药液，3000r/min离心20min，过滤，水蒸灭菌，4℃密封保存备用。
实施例3： 
取诃子15克，黄连30克，黄柏30克，白芍15克，益母草123克,当归75克，川芎30克，龙胆45克，车前子30克，栀子30克，泽泻45克原料，加10倍于药材总量的蒸馏水于烧杯中浸泡30min，急火煮沸后文火熬制60min，用纱布过滤，药渣再分别加8倍水和6倍水加热60min，合并3次滤液，浓缩至相当于生药的浓度为0.5-2g/mL的药液，3000r/min离心20min，过滤，水蒸灭菌，4℃密封保存备用。
大肠杆菌，无乳链球菌等奶牛子宫内膜炎常见致病菌临床分离株，主要用于连诃液组合方抑菌效果的验证试验。通过对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌的抑菌效果的实验对三个实施例中各个成份的用量进行定性，具体如下： 
采用平板打孔法进行连诃液的抑菌试验，即将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌接种于肉汤培养基，链球菌接种于加绵羊血的肉汤培养基，于37℃温箱中培养18 h，用比浊管测得细菌浓度约为3亿个/mL。吸取0.1mL菌液的1000倍稀释液加入平皿，以T型玻棒涂匀，在琼脂平板上打孔，孔径5 mm，孔内加入供试药液。每一平皿上打3孔，加同一药液，37℃培养24h后测量抑菌圈直径，以3孔的平均值表示连诃液的抑菌作用大小，具体结果如表1所示。
表1为不同用量对3种供试菌的抑菌效果（mm） 

注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05），不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）。
通过体外抑菌试验平板打孔法筛选出抑菌效果最好的中药灌注液。该方对3种供试菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌均有一定体外抑菌作用，对3种病原菌抑菌效果均显著的最佳配比为诃子:黄连=1:2。 
以实施例3中的各个成份的剂量为基础，设计一个正交试验，选择8因素2水平的正交t值法L₁₂（2¹¹）进行拆方安排（表2），计算对各菌的预期药效（MM），确定最为有效的抑菌药物组合。根据拆方对3种供试菌D值的贡献分析确定优化组合方，即D值为正值，表示用该药比不用该药对试验菌的抑菌圈大，差异显著，表明抑菌效果显著；D值为负值，表示用该药比不用该药对试验菌的抑菌圈小，差异显著，表明无抑菌效果，并对优化组合方进行组方剂量优化和验证试验。 
预期药效MM=Mm+∑D／G，其中Mm为各组抑菌圈直径均数的平均值，D=M1-M2，M1为用某药各组抑菌圈直径的均数；M2为未用某药各组抑菌圈直径的均数，G为分组组数。 
表2 L₁₂（2¹¹）正交设计拆方的因素、水平及试验安排 

注：1水平为“用药”，2水平为“不用药”。
表3对金黄色葡萄球菌的抑菌效果 
注：1水平：用药；2水平：不用药。M1：用某药各组的抑菌圈直径的均数之和；M2：未用某药各组抑菌圈直径的均数之和。D=M1-M2
表4对无乳链球菌的抑菌效果
注：1水平：用药；2水平：不用药。M1：用某药各组的抑菌圈直径的均数之和；M2：未用某药各组抑菌圈直径的均数之和。D=M1-M2。
表5对大肠杆菌的抑菌效果 
注：1水平：用药；2水平：不用药。M1：用某药各组的抑菌圈直径的均数之和；M2：未用某药各组抑菌圈直径的均数之和。D=M1-M2。
对金黄色葡萄球菌的最佳抑菌组合为D₂E₁F₂G₁H₁I₁J₂K₂，预期药效26.0mm，且用E、G、H、I与不用差异极显著（P<0.01）（表3），说明诃子、益母草、黄连、黄柏为抑制金黄色葡萄球菌的主药。对于大肠杆菌的最佳抑菌组合为D₂E₁F₁G₂H₁I₂J₂K₂，预期药效9.4mm，且用F、H与不用差异极显著（P<0.01），用E与不用差异显著（P<0.05）（表5），说明诃子、川芎、黄连为抑制大肠杆菌的主药。对于链球菌的最佳抑菌组合为D₁E₂F₂G₂H₁I₁J₂K₂，预期药效18.6mm，且用D、H、I与不用差异极显著（P<0.01）（表4），说明龙胆、黄连、黄柏、车前子为抑制链球菌的主药。 
为了更好的理解中药灌注液的体内抗炎效果，从而进行小鼠的体内抗炎试验。 
第一，具体试验操作过程： 
（1）二甲苯所致小鼠耳廓肿胀抑制试验：选取健康昆白小鼠50只，随机分成5组，每组10只。在正常饲养的基础上，第1、2、3、5组每天灌胃1次，连续3d。其中第1、2、3组分别为正交t值法筛选的最有效抑菌中药灌注液组合的低、中、高浓度组，给药浓度分别为0.5，1，2g/mL，用量均为20 mL/kg；第4组为地塞米松对照组，腹腔注射给药，根据地塞米松的产品说明，给药浓度为0.05g/mL，用量为12mL/kg；第5组为空白对照组，每次给予同中药组等体积的生理盐水。在每组的最后一次给药0.5h后，分别于每只小鼠左耳两面的皮肤上滴加0.05mL二甲苯致炎，右耳作对照，致炎20min后处死小鼠，在两耳相同部位打下耳片，精确称量，分别计算耳肿胀率及抑制率。
耳肿胀抑制率（%）=（空白对照组平均肿胀率–给药组平均肿胀率）/对照组平均肿胀率×100%，其中肿胀率=（左耳重量-右耳重量）/右耳重量×100%。 
（2）甲醛所致小鼠足趾肿胀抑制试验：选取健康昆白小鼠50只，随机分成5组，每组10只。在正常饲养的基础上，第1、2、3、5组每天灌胃1次，连续3d。其中第1、2、3组分别为正交t值法筛选的最有效抑菌药物组合的低、中、高浓度组，给药浓度分别为0.5，1，2g/mL，用量均为20 mL/kg；第4组为地塞米松对照组，腹腔注射给药，根据地塞米松的产品说明，给药浓度为0.05g/mL，用量为12mL/kg；第5组为空白对照组，每次给予同中药组等体积的生理盐水。在第3天最后一次给药0.5h后，分别于每只小鼠右后肢足跖皮下注射1%甲醛0.05mL致炎，左跖作为对照。3h后脱颈椎处死试验鼠，齐踝关节处切下两后足，精确称量，计算小鼠足跖肿胀抑制率。 
足跖肿胀抑制率（%）=（空白对照组平均肿胀率–给药组平均肿胀率）/对照组平均肿胀率×100%，其中肿胀率=（右后足重-左后足重-甲醛重）/左后足重×100%。 
第二，二甲苯所致小鼠耳廓肿胀与甲醛致足趾肿胀抑制试验结果，具体如下： 
优化组合方的中、高浓度组对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀抑制率与地塞米松相当（P>0.05），中、高浓度组间差异不显著（P>0.05），高浓度组显著优于低浓度组（P<0.05）（表6），说明优化组合方在中、高浓度时对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀有显著抑制作用。高浓度组对甲醛所致小鼠足跖肿胀抑制率与地塞米松组相当（P>0.05），高浓度组显著优于低浓度组（P<0.05），中、低浓度组间差异不显著（P>0.05）（表6），说明优化组合方在高浓度时对甲醛所致的足跖肿胀有显著抑制作用。
表6对小鼠耳廓肿胀与足趾肿胀的抑制作用 

注：同列不同字母代表不同水平，不同大写字母代表差异极显著（P<0.01），不同小写字母代表差异显著（P<0.05）。
评价指标和方法： 
炎症是机体对抗损伤的一种保护性防御反应。炎症早期，由于损伤因子使机体部分组织遭到破坏，一些炎症介质刺激血管，导致血管扩张，局部血流量增多，血管壁通透性增大，血浆、白细胞等从血管渗出，随着渗出的增加，就造成了组织肿胀。因此，炎性渗出和组织肿胀是急性炎症早期的重要指标。子宫内膜炎一个主要病理变化就是炎症反应，包括炎症细胞渗出、黏膜出血、致炎因子水平提高等，因此能否改善其炎症反应是治疗子宫内膜炎的主要因素之一。因此，评价子宫内膜炎治疗药物药效的指标除了抑菌作用外，抗炎是最重要的指标。巨噬细胞是机体防御机能的基础，在炎症反应的非特异性和特异性免疫应答过程中发挥着非常重要的作用，能够进行非特异性吞噬和抗原递呈，它所产生的各种细胞因子和炎症介质决定了炎症反应整个过程的机制。当病原菌入侵机体，开始繁殖和被消灭时，其体内释放大量的内毒素，从而激活巨噬细胞分泌过量的炎性介质，它们持续不断地大量释放就容易导致炎症的不断扩大、加重，所以，保持适量的炎性介质对维持机体的稳态平衡具有非常重要的作用。由于炎性介质、细胞因子在感染性炎症中起着非常重要的作用，因此，研究中药组方对这些炎性因子的影响，可揭示其抗炎作用的机制。
为了进一步验证复方的抗炎效果，从而进行了体内试验。通过二甲苯所致小鼠耳廓肿胀和甲醛所致小鼠足趾肿胀模型，研究了中药组方体内抗炎作用。这2个模型以血管扩张和炎性肿胀为特征，它们的特点是炎症反应中致炎局部的 PG合成量增多，与血管内的活性物质和激肽一起诱发炎性水肿。通过研究中药组方对这2个模型的影响，可反映该组方对急性炎症的影响，是筛选抗炎药物常用的方法。试验结果表明，对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀、甲醛所致小鼠足趾肿胀具有显著抑制作用，且抗炎效果与剂量呈正相关，表明该组方对急性炎症具有显著的抑制作用。 
通过二甲苯致小鼠耳廓肿胀和甲醛致小鼠足趾肿胀试验法研究了优化组合方的体内抗炎效果。结果表明，优化组合方在中浓度和高浓度时对二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀有显著抑制作用，在高浓度时对甲醛所致的足跖肿胀有显著抑制作用，说明本发明优化组合方具有显著体内抗炎作用。 
治疗奶牛子宫内膜炎的中药灌注液临床用法：奶牛子宫灌注，100mL／次，隔日1次，3～4次为1疗程，一般治疗一个疗程即愈。