发明领域
本发明涉及可用作蛋白激酶抑制剂的吡唑并[1，5-a]嘧啶类化合 物、含有所述化合物的药物组合物以及使用该化合物和组合物治疗诸 如癌、炎症、关节炎、病毒性疾病、神经变性疾病(如，阿尔茨海默 氏病)、心血管疾病和真菌性疾病的方法。本申请要求于2002年9月 4日提交的美国临时专利申请编号60/408,182的优先权。
发明背景
依赖细胞周期蛋白激酶(CDKs)是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其为细 胞周期和细胞增殖的驱动力。在细胞周期进行过程中，诸如CDK1、 CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK8等各种CDK发挥不同 作用，并可分为G1、S期酶或G2M期酶。失控增殖是癌细胞的特征标 志，并且，在许多重要实体瘤中，高频率发生CDK功能调控异常。CDK2 和CDK4尤为令人关注，因为它们的活性在广泛的各种人类癌症中频繁 调控异常。从细胞周期过程的G1期进行到S期需要CDK2活性，并且 CDK2是G1检测点的关键组分之一。检测点用于维持细胞周期过程的正 常顺序，并使细胞对损伤或增殖信号作出响应，而癌细胞中正常检测 点失控导致肿瘤发生。CDK2通道在肿瘤抑制剂功能(例如，p52、RB和 p27)和致癌基因激活(细胞周期蛋白E)水平上影响肿瘤发生。许多报 道表明，在乳腺癌、结肠癌、非小细胞细胞肺癌、胃癌、前列腺癌、 膀胱癌、非何杰金氏淋巴癌、卵巢癌和其它癌症中，辅活化蛋白、细 胞周期蛋白E以及CDK2的抑制剂p27分别被过量表达或表达不足。它 们的变更表达被证明与增加的CDK2活性水平和不良总存活有关。该观 察结果使人们对CDK2及其调控通道强制靶进行了多年研究，文献已报 道，许多腺苷5′-三磷酸(ATP)竞争性有机小分子和肽被用作CDK抑制 剂用于有效治疗癌症。US 6,413,974第1栏23行-第15栏10行对 各种CDK及其与各类癌症之间的关系进行了详细说明。
CDK抑制剂是已知的。例如，flavopiridol(式I)是一种非选择 性CDK抑制剂，目前正在进行人类临床试验(A.M.Sanderowicz et al，J.Clin.Oncol.(1998)16，2986-2999)。
式I
其它已知的CDK抑制剂包括，例如，olomoucine(J.Vesely等 人，Eur.J.Biochem.，(1994)224，771-786)和roscovitine(I. Meijer等人，Eur.J.Biochem.，(1997)243，527-536)。 US6,107,305描述了用作CDK抑制剂的某些吡唑并[3，4-b]吡啶化合 物。′305专利的一个例证化合物具有式II结构：
式II
K.S.Kim et al，J.Med.Chem.45(2002)3905-3927和WO 02/10162公开了用作CDK抑制剂的某些氨基噻唑化合物。
吡唑并嘧啶类化合物是已知的。例如，WO 92/18504、WO 02/50079、WO 95/35298、WO 02/40485、EP 94304104.6、EP 0628559(与 US 5,602,136、5,602,137和5,571,813相同)、US 6,383,790、Chem. Pharm.Bull.，(1999) 47 928，J.Med.Chem.，(1977) 20，296， J.Med.Chem.，(1976) 19 517和Chem.Pharm.Bull.，(1962) 10620公开了许多吡唑并嘧啶类化合物。
现需要用于治疗CDK相关疾病和病症的新化合物、制剂、处理方 法和治疗方法。因此，本发明的一个目的是提供可用于治疗或预防或 改善所述疾病和病症的化合物。
发明概述
在许多实施方案中，本发明提供了一类新的用作依赖细胞周期蛋 白激酶抑制剂的吡唑并[1，5-a]嘧啶化合物、所述化合物的制备方法、 含有一种或多种所述化合物的药物组合物、制备含有一种或多种所述 化合物的药物制剂的方法以及使用所述化合物或药物组合物治疗、预 防、抑制或改善一种或多种CDK相关疾病的方法。
在一个方面，本申请公开了一种具有通式III结构的化合物或其 可药用盐或其溶剂化物：
式III
其中：
Q选自-S(O2)NR6R7-、-C(O)NR6R7-和-C(O)OR7-；
R2选自R9、烷基、炔基、炔基烷基、环烷基、-CF3、-C(O2)R6、芳 基、芳烷基、杂芳烷基、杂环基、被1-6个相同或不同的R9基团取代 的烷基，并且R9基团独立地选自下列所示一系列R9，
和
其中上述规定的R2中的芳基可以是未取代的或任选被相同或不同的一 个或多个基团取代，各取代基团独立地选自卤素、CN、-OR5、SR5、 -S(O2)R6、-S(O2)NR5R6、-NR5R6、-C(O)NR5R6、CF3、烷基、芳基和OCF3；
R3选自H、卤素、烷基、炔基、-NR5R6、-C(O)NR5R6、-C(O)OR4、 环烷基、环烷基烷基、芳基、芳烷基、杂环基、杂环基烷基、杂芳基 和杂芳基烷基、
和
其中R3定义中所述各烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂环基、杂环基 烷基、杂芳基和杂芳基烷基以及刚才在上文R3定义中列出的杂环基基 团可以是未被取代的或任选被相同或不同的一个或多个基团独立取 代，各取代基团独立地选自卤素、烷基、芳基、环烷基、CF3、CN、 -OCF3、-(CR4R5)nOR5、-OR5、-NR5R6、-(CR4R5)nNR5R6、-C(O2)R5、-C(O)R5、 -C(O)NR5R6、-SR6、-S(O2)R6、-S(O2)NR5R6、-N(R5)S(O2)R7、-N(R5)C(O)R7和-N(R5)C(O)NR5R6；
R4是H、卤素或烷基；
R5是H或烷基；
R6选自H、烷基、芳基、芳烷基、环烷基、杂环基、杂环基烷基、 杂芳基和杂芳基烷基，其中所述各烷基、芳基、芳烷基、环烷基、杂 环基、杂环基烷基、杂芳基和杂芳基烷基，可以是未取代的或任选被 相同或不同的一个或多个基团取代，各基团独立地选自卤素、烷基、 芳基、环烷基、杂环基烷基、CF3、OCF3、CN、-OR5、-NR5R10、-N(R5)Boc、 -(CR4R5)nOR5、-C(O2)R5、-C(O)R5、-C(O)NR5R10、-SO3H、-SR10、-S(O2)R7、 -S(O2)NR5R10、-N(R5)S(O2)R7、-N(R5)C(O)R7和-N(R5)C(O)NR5R10；
R10选自H、烷基、芳基、芳烷基、环烷基、杂环基、杂环基烷基、 杂芳基和杂芳基烷基，其中所述各烷基、芳基、芳烷基、环烷基、杂 环基、杂环基烷基、杂芳基和杂芳基烷基可以是未取代的或任选被一 个或相同或不同的多个基团取代，各基团独立地选自卤素、烷基、芳 基、环烷基、杂环基烷基、CF3、OCF3、CN、-OR5、-NR4R5、-N(R5)Boc、 -(CR4R5)nOR5、-C(O2)R5、-C(O)NR4R5、-C(O)R5、-SO3H、-SR5、-S(O2)R7、 -S(O2)NR4R5、-N(R5)S(O2)R7、-N(R5)C(O)R7和-N(R5)C(O)NR4R5；
或任选(i)基团-NR5R10中的R5和R10，或(ii)基团-NR5R6中的R5和R6可以连接在一起形成环烷基或杂环基，所述各环烷基或杂环基是 未取代的或任选独立地被一个或多个R9基团取代；
R7选自烷基、环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳基烷基，其 中所述各烷基、环烷基、杂芳基烷基、芳基、杂芳基和芳烷基可以是 未取代的或任选独立地被一个或多个相同或不同的基团取代，并且各 取代基团独立地选自卤素、烷基、芳基、环烷基、CF3、OCF3、CN、-OR5、 -NR5R10、-CH2OR5、-C(O2)R5、-C(O)NR5R10、-C(O)R5、-SR10、-S(O2)R10、 -S(O2)NR5R10、-N(R5)S(O2)R10、-N(R5)C(O)R10和-N(R5)C(O)NR5R10；
R8选自R6、-C(O)NR5R10、-S(O2)NR5R10、-C(O)R7和-S(O2)R7；
R9选自卤素、CN、-NR5R10、-C(O2)R6、-C(O)NR5R10、-OR6、-SR6、 -S(O2)R7、-S(O2)NR5R10、-N(R5)S(O2)R7、-N(R5)C(O)R7和 -N(R5)C(O)NR5R10；
m是0-4；和
n是1-4。
式III化合物可以用作蛋白激酶抑制剂并可用于治疗和预防增生 性疾病，例如，癌、炎症和关节炎。它们还可以用于治疗神经变性疾 病(如阿尔茨海默氏病)、心血管疾病、病毒性疾病和真菌性疾病。
发明详述
在一个实施方案中，本发明公开了结构式III所示的吡唑并 [1，5-a]嘧啶化合物、或其可药用盐或其溶剂化物，其中各基团的定义 如上所述。
在另一个实施方案中，R2是卤素、CF3、CN、低级烷基、-OR6、环 烷基、-C(O)OR6、-CH2OR6、芳基或杂芳基。
在另一个实施方案中，R3是H、卤素、低级烷基、芳基、杂芳基、 -C(O)OR4、环烷基、-NR5R6、杂环烷基、环烷基烷基、
或
其中所述烷基、芳基、杂芳基、杂环基和环烷基是未取代的或任意独 立地被一个或多个相同或不同的选自卤素、CF3、-OCF3、低级烷基、CN和-OR5取代。
在另一个实施方案中，R4是H或低级烷基。
在另一个实施方案中，R5是H或低级烷基。
在另一个实施方案中，m是0-2。
在又一个实施方案中，R2是卤素、CF3、CN、环丙基、低级烷基、 芳基、-C(O)OR6、-CH2OR6或-OR6。
在又一个实施方案中，R3是H、低级烷基、环烷基、C(O)OR4、
或
芳基、杂芳基、环烷基烷基，其中所述烷基、环烷基、杂芳基和芳基 是未取代的或任选独立地被一个或多个相同或不同的基团取代，各基 团独立地选自卤素、CF3、低级烷基、甲氧基和CN。
在又一个实施方案中，R3是
或
在又一个实施方案中，R4是H。
在又一个实施方案中，R5是H。
在又一个实施方案中，R8是-CH2OH或-CH2OCH3。
在又一个实施方案中，m是0。
在又一个实施方案中，n是1或2。
一组创造性的化合物如表1所示。
表1
在整个说明书中，除非另有说明，如上文所使用的下列术语应当 理解为具有下列含义：
“患者”包括人类和动物。
“哺乳动物”是指人类和其它哺乳类动物。
“烷基”是指链中具有约1-20个碳原子的直链或支链脂族烃基。 优选的烷基在链中含有约1-12个碳原子。更优选的烷基在链中含有 约1-6个碳原子。支链是指一个或多个诸如甲基、乙基或丙基的低级 烷基连接到直链烷基链上。“低级烷基”是指链中具有约1-6个碳原 子的直链或支链基团。术语“取代的烷基”是指可以被一个或多个相 同或不同的取代基取代的烷基，各取代基独立地选自卤素、烷基、芳 基、环烷基、氰基、羟基、烷氧基、烷硫基、氨基、-NH(烷基)、-NH(环 烷基)、-N(烷基)2、羧基和-C(O)O-烷基。适宜的烷基的非限制性实例 包括甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。
“炔基”是指含有至少一个碳-碳三键且链中含有约2-15个碳原 子的直链或支链脂族烃基。优选的炔基在链中具有约2-12个碳原子； 更优选链中具有约2-4个碳原子。支链是指一个或多个诸如甲基、乙 基或丙基的低级烷基连接到直链炔基链上。“低级炔基”是指链中具 有约2-6个碳原子并可以是直链或支链。合适的非限制性炔基实例包 括乙炔基、丙炔基、2-丁炔基和3-甲基丁炔基。术语“取代的炔基” 是指可以被一个或多个相同或不同的取代基取代的炔基，各取代基独 立地选自烷基、芳基和环烷基。
“芳基”是指具有约6-14个碳原子，优选具有约6-10个碳原 子的芳香单环或多环体系。芳基可以任选这里所定义的一个或多个相 同或不同的“环系取代基”取代。合适的非限制性芳基实例包括苯基 和萘基。
“杂芳基”是指具有约5-14个环上原子，优选具有约5-10个 环上原子的芳香单环或多环体系，其中一个或多个环上原子为除碳之 外的元素，例如，单独为氮、氧和/或硫，或它们的组合。优选的杂芳 基含有约5-6个环上原子。“杂芳基”可以任选被这里所定义的一个 或多个相同或不同的“环系取代基”取代。杂芳基根名前的前缀氮杂、 氧杂或硫杂是指至少分别存在氮、氧或硫原子作为环上原子。杂芳基 的氮原子可以任选被氧化为相应的N-氧化物。合适的非限制性杂芳基 实例包括吡啶基、吡嗪基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、异噁唑基、异噻 唑基、噁唑基，噻唑基、吡唑基、呋咱基、吡咯基、吡唑基、三唑基、 1，2，4-噻二唑基、吡嗪基、哒嗪基、喹喔啉基、2，3-二氮杂萘基、咪 唑并[1，2-a]吡啶基、咪唑并[2，1-b]噻唑基、苯并呋咱基、吲哚基、 氮杂吲哚基、苯并咪唑基、苯并噻吩基、喹啉基、咪唑基、噻吩并吡 啶基、喹唑啉基、噻吩并嘧啶基、吡咯并吡啶基、咪唑并吡啶基、异 喹啉基、苯并氮杂吲哚基、1，2，4-三嗪基、苯并噻唑基等等。
“芳烷基”或“芳基烷基”是指芳基-烷基基团，其中芳基和烷基 定义如上。优选的芳烷基含有低级烷基。合适的非限制性芳烷基实例 包括苄基、2-苯乙基和萘甲基。与母体部分的连接是通过烷基。
“烷基芳基”是指烷基-芳基基团，其中烷基和芳基定义如上。优 选的烷基芳基含有低级烷基。合适的非限制性烷基芳基实例是甲苯 基。与母体部分的连接是通过芳基。
“环烷基”是指含有约3-10个碳原子，优选含有约5-10个碳 原子的非芳族单环或多环体系。优选的环烷基环含有约5-7个环上原 子。环烷基可以任选被上面定义的一个或多个相同或不同的“环系取 代基”取代。合适的非限制性单环环烷基实例包括环丙基、环戊基、 环己基、环庚基等。合适的非限制性多环环烷基实例包括1-萘烷基、 降冰片烷基、金刚烷基等。
“卤素”是指氟、氯、溴或碘。优选氟、氯和溴。
“环系取代基”是指与芳族或非芳族环系相连的取代基，例如， 该取代基替代环系上的有效氢。环系取代基可以相同或不同，各自独 立地选自芳基、杂芳基、芳烷基、烷基芳基、杂芳烷基、烷基杂芳基、 羟基、羟基烷基、烷氧基、芳氧基、芳基烷氧基、酰基、芳酰基、卤 素、硝基、氰基、羧基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、芳基烷氧基羰基、 烷基磺酰基、芳基磺酰基、杂芳基磺酰基、烷硫基、芳硫基、杂芳硫 基，芳基烷硫基、杂芳基烷硫基、环烷基、杂环基、Y1Y2N-、Y1Y2N-烷基 -、Y1Y2NC(O)-和Y1Y2NSO2-，其中Y1和Y2可以相同或不同，且独立地选 自氢、烷基、芳基和芳烷基。
“杂环基”是指含有约3-10个环上原子，优选含约5-10个环 上原子的非芳族饱和单环或多环体系，其中环系中的一个或多个原子 为除碳以外的元素，如单独的氮、氧和/或硫或其组合。在该环系中， 不存在相邻氧和/或硫原子。优选的杂环基含有约5-6个环上原子。 杂环基根名前的前缀氮杂、氧杂或硫杂是指至少分别存在氮、氧或硫 原子作为环上原子。杂环基环中的任何-NH可以被保护的形式存在，例 如，以-N(Boc)、-N(CBz)、-N(Tos)等基团形式存在；这种被保护的 基团也被认为是本发明的一部分。杂环基可以任选被这里所定义的一 个或多个相同或不同的“环系取代基”取代。杂环基的氮或硫原子可 以任选被氧化为相应的N-氧化物、S-氧化物或S，S-二氧化物。合适的 非限制性单环杂环基实例包括哌啶基、吡咯烷基、哌嗪基、吗啉基、 硫代吗啉基、噻唑烷基、1，4-二氧六环基、四氢呋喃基、四氢噻吩基 等等。
应该注意的是，在本发明含杂原子的环系中，在与N、O或S相邻 的碳原子上不存在羟基，并且，在与另一个杂原子相邻的碳原子上不 存在N或S基团。因此，例如，在下列环中，没有-OH与标号为2和5 的碳原子直接相连。
“炔基烷基”是指炔基-烷基基团，其中炔基和烷基定义如上。优 选的炔基烷基含有低级炔基和低级烷基。与母体部分的连接是通过烷 基。合适的非限制性炔基烷基实例包括炔丙基甲基。
“杂芳烷基”是指杂芳基-烷基基团，其中杂芳基和烷基定义如 上。优选的杂芳烷基含有低级烷基。合适的非限制性杂芳烷基实例包 括吡啶基甲基和喹啉-3-基甲基。与母体部分的连接是通过烷基。
“羟烷基”是指HO-烷基基团，其中烷基定义如上。优选的羟烷基 含有低级烷基。合适的非限制性羟烷基实例包括羟基甲基和2-羟基乙 基。
“酰基”是指H-C(O)-，烷基-C(O)-或环烷基-C(O)-，其中各基团 的定义如上。与母体部分的连接是通过羰基。优选的酰基含有低级烷 基。合适的非限制性的酰基实例包括甲酰基、乙酰基和丙酰基。
“芳酰基”是指芳基-C(O)-基团，其中芳基定义如上。与母体部 分的连接是通过羰基。合适的非限制性实例包括苯甲酰基和1-萘甲酰 基。
“烷氧基”是指烷基-O-基团，其中烷基定义如上。合适的非限制 性的烷氧基实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基和正丁氧 基。与母体部分的连接是通过醚氧。
“芳氧基’是指芳基-O-基团，其中芳基定义如上。合适的非限制 性的芳氧基实例包括苯氧基和萘氧基。与母体部分的连接是通过醚 氧。
“芳烷基氧基”是指芳烷基-O-基团，其中芳烷基定义同上。合适 的非限制性的芳烷基氧基实例包括苄氧基和1-或2-萘甲氧基。与母体 部分的连接是通过醚氧。
“烷硫基”是指烷基-S-基团，其中烷基定义同上。合适的非限制 性的烷硫基实例包括甲硫基和乙硫基。与母体部分的连接是通过硫。
“芳硫基”是指芳基-S-基团，其中芳基定义同上。合适的非限制 性的芳硫基实例包括苯硫基和萘硫基。与母体部分的连接是通过硫。
“芳烷基硫基”是指芳烷基-S-基团，其中芳烷基定义同上。合适 的非限制性的芳烷基硫基实例包括苄硫基。与母体部分的连接是通过 硫。
“烷氧基羰基”是指烷基-O-CO-基团。合适的非限制性的烷氧基 羰基实例包括甲氧羰基和乙氧羰基。与母体部分的连接是通过羰基。
“芳氧基羰基”是指芳基-O-C(O)-基团。合适的非限制性的芳氧 基羰基实例包括苯氧基羰基和萘氧基羰基。与母体部分的连接是通过 羰基。
“芳烷氧基羰基”是指芳烷基-O-C(O)-基团。合适的非限制性的 芳烷氧基羰基实例包括苄氧基羰基。与母体部分的连接是通过羰基。
“烷基磺酰基”是指烷基-S(O2)-基团。优选的基团是其中烷基为 低级烷基的基团。与母体部分的连接是通过磺酰基。
“芳基磺酰基”是指芳基-S(O2)-基团。与母体部分的连接是通过 磺酰基。
术语“取代的”是指在指定原子上的一个或多个氢被所指出的基 团代替，前提条件是，不超出指定原子在现有情况下的正常价态，并 且通过取代得到稳定的化合物。可以将取代基和/或可变取代基组合， 唯一的条件是这种组合应得到稳定的化合物。“稳定的化合物”或“稳 定的结构”是指：化合物足够稳定，从而能够经受从反应混合物中分 离得到有效纯度化合物，并能配制成有效治疗试剂。
术语“任选取代的”是指用特定的基、根或基团任选取代。
还应当注意的是，在本发明说明书、实施方案、实施例和表格中， 假设任何化合价不饱和的杂原子由氢原子来满足化合价。
如果化合物中的官能团被称作是“被保护的”，这意味着该官能 团为改良型，从而在化合物进行反应时，避免了在被保护部位发生不 需要的副反应。本领域普通技术人员能够确认合适的保护基，以及参 考标准教科书，例如，T.W.Greene et al，Protective Groups in organic Synthesis(1991)，Wiley，New York确认它们。
在任一组分或式III中，如果任何可变的基团(例如，芳基、杂 环基、R2等)出现一次以上，那么，其在每种情况下的定义与其在所 有其它情况下的定义无关。
本发明使用的术语“组合物”包括产物，该产物中含有特定量特 定组分，该术语还包括由特定量特定组分的混合而直接或间接得到的 任何产物。
本发明化合物的前药和溶剂化物也包括在本发明范围内。这里所 使用的术语“前药”是指一种化合物，该化合物是药物前体，在对患 者给药后，该化合物通过代谢或化学过程发生化学转化，得到式III 化合物或其盐和/或溶剂化物。关于前药的讨论可参见T.Higuchi and V.Stella，Pro-drugs as Novel Delivery Systems(1987) 14 of the A.C.S.Symposium Series以及Bioreversible Carriers in Drug Design，(1987)Edward B.Roche，ed.，American Pharmaceutical Association and Pergamon Press，它们均收入本发明中供参考。
“溶剂化物”是指本发明化合物与一种或多种溶剂分子之间的物 理缔合。该物理缔合涉及改变离子和共价键合度，包括氢键键合度。 在某些情况下，例如，当结晶固体的晶格中掺入一种或多种溶剂分子 时，可以对溶剂化物进行分离。“溶剂化物”包括溶液-相和可分离的 溶剂化物。合适的非限制性的溶剂化物实例包括乙醇化物、甲醇化物 等。“水合物”是溶剂分子为H2O的溶剂化物。
“有效量”或“治疗有效量”是指能有效抑制CDK从而能产生所 需的治疗、缓解、抑制或预防效果的本发明化合物或组合物的量。
式III化合物可以形成盐，其也包括在本发明范围内。除非另有 说明，本发明中提及式III化合物时显然应包括其盐。本发明中使用 的术语“盐”表示与无机和/或有机酸形成的酸性盐以及与无机和/或 有机碱形成的碱性盐。此外，当式III化合物同时含有碱性基团(例 如，但不限于，吡啶或咪唑)和酸性基团(例如，但不限于，羧酸) 时，可以形成两性离子(“内盐”)，其包括在本发明使用的术语“盐” 的范围内。优选可药用盐(即，无毒的、生理上可接受的)，当然， 其它盐也是有效的。例如，通过在介质中，例如，在能够沉淀出盐的 介质中或在含水介质中，使式III化合物与一定量的酸或碱(例如，1 当量)反应，可以形成式III化合物的盐，如果使用含水介质，则随 后进行冷冻干燥。
可列举的酸加成盐包括乙酸盐、抗坏血酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸 盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、 延胡索酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲 磺酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、草酸盐、磷酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、 琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐等。此外，例 如，在S.Berge et al，Journal of Pharmaceutical Sciences(1977) 66(1)1-19；P.Gould，International J.of Pharmaceutics(1986) 33 201-217；Anderson et al，The Practice of Medicinal Chemistry(1996)，Academic Press，New York中以及在The Orange Book(Food & Drug Administration，Washington，D.C.on their website)中讨论了通常被认为适用于由可药用碱性化合物形成药学上 有效的盐的那些酸。这些公开内容在本发明中引作参考。
可列举的碱性盐包括铵盐、碱金属盐(如钠、锂和钾盐)、碱土 金属盐(如钙和镁盐)、与有机碱(例如，有机胺，如二环己基胺、 叔丁基胺)形成的盐、与氨基酸(如精氨酸、赖氨酸)形成的盐等。 碱性含氮基团可以用诸如下列试剂季铵化：低级烷基卤化物(例如，甲 基、乙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物)、硫酸二烷基酯(例如，硫 酸二甲酯、二乙酯和二丁酯)、长链卤化物(例如，癸基、月桂基和十 八烷酰基的氯化物、溴化物和碘化物)、芳烷基卤(例如，苄基溴和苯 乙基溴)以及其它等等。
所有上述酸式盐和碱式盐被规定属于本发明范围内的可药用盐， 并且，对本发明来说，所有酸式盐和碱式盐被认为与游离形式的相应 化合物等效。
式III化合物及其盐、溶剂化物和前药可以其互变异构体的形式 存在(例如，以酰胺或亚氨醚的形式存在)。所有这些互变异构体都 包括在本发明中作为本发明的一部分。
同位置异构体(例如，4-吡啶基和3-吡啶基)一样，本发明化合 物(包括化合物的盐、溶剂化物和前药以及前药的盐和溶剂化物)的 所有立体异构体(例如，几何异构体、旋光异构体等)，例如，由于 不同取代基上存在的不对称碳而导致可能存在的立体异构体，均包括 在本发明范围内，包括对映异构体(即使没有不对称碳，也可能存在 对映异构体)、旋转异构体、阻转异构体和非对映异构体。本发明化 合物的各立体异构体可以，例如，基本上不含其它异构体，或者可以 混合例如形成外消旋体，或与所有其它立体异构体混合或与其它选择 的立体异构体混合。本发明的手性中心可以具有如IUPAC 1974 Recommendations中定义的S或R构型。规定“盐”、“溶剂化物”、 “前药”等术语的使用同样适用于本发明化合物的对映体、立体异构 体、旋转异构体、互变异构体、位置异构体、外消旋体或前药的盐、 溶剂化物和前药。
本发明化合物具有药理学特性，特别是，式III化合物能够抑制 蛋白激酶，如依赖细胞周期蛋白激酶(CDK)，例如，CDC2(CDK1)、CDK2、 CDK4、CDK5、CDK6、CDK7和CDK8。预期式III新化合物可以用于治 疗增生性疾病，例如，癌、自身免疫性疾病、病毒性疾病、真菌性疾 病、神经病学疾病/神经变性疾病、关节炎、炎症、抗-增生性疾病(例 如，眼视网膜病)、神经元性疾病、脱发和心血管疾病。这其中的许 多疾病和病症列于上文引用的US6413974中，其内容在本发明中引作 参考。
更具体地讲，式III化合物可用于治疗各种癌症，包括(但不限 于)以下癌症：癌，包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺 癌(包括小细胞肺癌)、食道癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、 宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌和皮肤癌(包括扁平细胞癌)；淋巴血 统造血肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞白 血病、B-细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏 淋巴瘤、多毛细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤；脊髓血统造血肿瘤，包括 急性和慢性骨髓性白血病、脊髓发育不良综合征和前髓细胞性白血 病；间充质来源肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；中枢和周围神经 系统肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤； 和其它肿瘤，包括黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎瘤、骨肉瘤、xenoderoma pigmentosum、角化棘皮瘤(keratoctanthoma)、甲状腺滤泡肿瘤和 卡波济氏肉瘤。
由于CDK在大多数细胞增殖调节中起重要作用，因此，抑制剂可 以用作可逆细胞抑制剂，其可以用于治疗以异常细胞增殖为特征的任 何疾病过程，例如，良性前列腺增生、家族性腺上皮增生息肉病、神 经纤维瘤病、动脉粥样硬化、肺纤维化、关节炎、牛皮癣、肾小球性 肾炎、血管成形术或血管手术后的再狭窄、肥厚性瘢痕形成、炎性肠 病、移植排斥、内毒素性休克和真菌感染。
最近发现CDK5涉及tau蛋白的磷酸化作用(J.Biochem， (1995) 117，741-749)，这意味着，式III化合物还可以用于治疗阿 耳茨海默氏疾病。
式III化合物可诱导或抑制细胞凋亡。在各种人类疾病中，细胞 凋亡应答异常。用作细胞凋亡调节剂的式III化合物可用于治疗癌症 (包括但不限于上述癌症类型)、病毒性(包括但不限于疱疹病毒、痘病 毒、埃-巴二氏病毒、新培斯病毒和腺病毒)感染、预防HIV-感染个体 的爱滋病发展、自身免疫病(包括但不限于系统性红斑狼疮、自身免疫 介导的肾小球性肾炎、风湿性关节炎、牛皮癣、炎性肠病、和自身免 疫糖尿病)、神经变性疾病(包括但不限于阿耳茨海默氏病、AIDS-相关 性痴呆、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化、色素性视网膜炎、脊髓性 肌萎缩和小脑变性)、脊髓发育异常综合征、再生障碍性贫血、与心肌 梗死、中风和再灌注损伤有关的局部缺血性损伤、心律失常、动脉粥 样硬化、毒素导致的或与酒精有关的肝疾病、血液病(包括但不限于慢 性贫血和再生障碍性贫血)、肌与骨骼系统的变性疾病(包括但不限于 骨质疏松和关节炎)、阿斯匹林敏感性鼻窦炎、囊性纤维化、多发性硬 化、肾疾病和癌痛。
作为CDK抑制剂的式III化合物能够调节细胞RNA和DNA合成水 平。因此，这些试剂可用于治疗病毒性感染(包括但不限于HIV、人类 乳头瘤病毒、疱疹病毒、痘病毒、埃-巴二氏病毒、新培斯病毒和腺病 毒)。
式III化合物也可用于化学预防癌症。化学预防的定义是通过阻 断起始诱变事件或通过阻断已损伤癌前期细胞的发育或抑制肿瘤复发 来抑制侵袭性癌症发展。
式III化合物也可用于抑制肿瘤血管生成和转移。
式III化合物还可用作其它蛋白激酶(例如，蛋白激酶C、her2、 raf1、MEK1、MAP激酶、EGF受体、PDGF受体、IGF受体、PI3激酶、 wee1激酶、Src和AbI)抑制剂，因此，式III化合物可有效治疗与 其它蛋白激酶有关的疾病。
本发明另一方面涉及一种治疗哺乳动物(例如，人类)所患CDK相 关疾病或病症的方法，该方法是通过对哺乳动物施用治疗有效量的至 少一种式III化合物或其可药用盐或其溶剂化物。
式III化合物的优选剂量为约0.001-500mg/kg体重/天。式III 化合物或其可药用盐或其溶剂化物特别优选的剂量为约0.01-25mg /kg体重/天。
本发明化合物还可与一种或多种抗癌疗法(如放射疗法)和/或一 种或多种下述抗癌剂联用(一同给药或相继给药)：细胞抑制剂、细胞 毒素剂(例如，但不限于，DNA交互剂(例如，顺铂或阿霉素))；紫杉 碱类(例如，泰素帝和紫杉醇)；交连异构酶II抑制剂(例如，依托泊 甙)；交连异构酶I抑制剂(例如，irinotecan(或CPT-11)、camptostar 或topotecan)；微管蛋白交互剂(例如，紫杉醇、docetaxel或 epothilones)；激素药(例如，他莫昔芬)；胸苷酸合酶抑制剂(例如， 5-氟尿嘧啶)；抗代谢物(例如，氨甲蝶呤)；烷基化剂(例如，替莫唑 胺(购自Schering-Plough Corporation，Kenilworth，New Jersey， 商品名为TEMODARTM)、环磷酰胺)；法尼基蛋白转移酶抑制剂(例如， SARASARTM(4-[2-[4-[(11R)-3，10-二溴-8-氯-6，11-二氢-5H-苯并 [5，6]环庚[1，2-b]吡啶-11-基-]-1-哌啶基]-2-氧代乙基]-1-哌啶甲 酰胺或从Schering-Plough Corporation，Kenilworth，New Jersey 购得的SCH66336)、tipifarnib(从Janssen Pharmaceuticals购得 的Zarnestra或R115777)、L778，123(购自Merck & Company， Whitehouse Station，New Jersey的法尼基蛋白转移酶抑制剂)、BMS 214662(购自Bristol-Myers Squibb Pharmaceuticals，Princeton， New Jersey的法尼基蛋白转移酶抑制剂)；信号转导抑制剂(例如， Iressa(购自Astra Zeneca Pharmaceuticals，England)、 Tarceva(EGFR激酶抑制剂)、EGFR抗体(例如，C225)、GLEEVECTM(购 自Novartis Pharmaceuticals，East Hanover，New Jersey的C- abl激酶抑制剂)；干扰素，例如，内含子(购自Schering-Plough Corporation)、Peg-内含子(购自Schering-Plough Corporation)； 激素疗法联用；芳香酶联用；阿糖胞嘧啶、阿霉素、环磷酰胺和 gemcitabine。
其它抗癌(也称作抗肿瘤)剂包括但不限于尿嘧啶芥子气、氮芥、 异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、曲他胺、噻替派、白 消安、卡莫司汀、环己亚硝脲、链佐星、达卡巴嗪、氟尿苷、阿糖胞 苷、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨、奥沙利铂、亚叶酸 (亮丙瑞林leucovirin)、奥沙利铂(购自Sanofi-Synthelabo Pharmaeuticals，France，商品名为ELOXATINTM)、喷托司它丁、长 春碱、长春新碱、长春地辛、博莱霉素、放线菌素、柔红霉素、阿霉 素、表阿霉素、伊达比星、普卡霉素、脱氧考福酶素、丝裂霉素-C、 L-天冬酰胺酶、替尼泊甙、17α-炔雌醇、己烯雌酚、睾丸素、泼尼松、 氟甲睾酮、丙酸屈他雄酮、睾内酯、乙酸甲地孕酮、甲泼尼龙、甲睾 酮、泼尼松龙、曲安西龙、氯烯雌醚、羟孕酮、氨鲁米特、雌莫司汀、 乙酸甲羟孕酮、亮丙瑞林、氟他胺、托瑞米芬、戈舍瑞林、顺铂、卡 铂、羟基脲、安吖啶、丙卡巴肼、米托坦、米托蒽醌、左旋咪唑、 Navelbene、Anastrazole、Letrazole、Capecitabine、Reloxafine、 屈洛昔芬或六甲蜜胺。
如果配制成固定的剂量，上述组合产品可以采用在本发明所述剂 量范围内的本发明化合物和在其剂量范围内的其它药用活性剂或治 疗。例如，现已发现，在诱导细胞凋亡中，CDC2抑制剂Olomucine与 已知的细胞毒素剂起协同作用(J.Cell Sci.，(1995) 108，2897)。 当组合制剂不适当时，式III化合物也可以与已知的抗癌剂或细胞毒 素剂一起按序给药。本发明对给药顺序没有限制；可以在施用已知抗 癌剂或细胞毒素剂之前或之后施用式III化合物。例如，依赖细胞周 期蛋白激酶抑制剂flavopiridol的细胞毒素活性受施用抗癌剂顺序 的影响。Cancer Research，(1997)， 57，3375。这些技术是本领域 技术人员和主治医师熟知的。
因此，一方面，本发明包括组合物，其含有一定量的至少一种式 III化合物或其可药用盐或其溶剂化物以及一定量的一种或多种上述 抗癌治疗和抗癌药，其中，化合物/治疗的量能达到所需的治疗效果。
本发明化合物的药理学性质可通过许多药理学试验证实。使用本 发明化合物和其盐进行下文描述的例示药理学试验。
本发明还涉及一种药物组合物，其含有至少一种式III化合物或 其可药用盐或溶剂化物和至少一种可药用载体。
对于由本发明化合物制备药物组合物，惰性可药用载体可以是固 体或液体。固体制剂包括粉剂、片剂、可分散粒剂、胶囊、扁囊剂和 栓剂。粉剂和片剂可以由大约5-95％活性组分组成。合适的固体载体 是本领域已知的，例如，碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、蔗糖或乳糖。片 剂、粉剂、扁囊剂和胶囊剂可以用作适合于口服给药的固体剂型。可 药用载体的实例以及各种组合物的制备方法可参见A.Gennaro(ed.)， Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th Edition，(1990)， Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania。
液体制剂包括溶液、悬浮液和乳剂。可列举的实例是水或水-丙 二醇溶液(用于肠胃外注射)或添加了甜料和遮光剂用于口服溶液、 悬浮液和乳剂。液体制剂还可包括鼻内给药溶液。
适于吸入给药的气雾剂可以包括溶液和固体粉末，其可以与可药 用载体(例如，惰性压缩气体，如氮气)混合。
还包括固体制剂，其在临用前转化成用于口服或肠胃外给药的液 体制剂。所述液体制剂包括溶液、悬浮液和乳剂。
本发明化合物还可以经皮提供。经皮组合物可以是乳膏、洗剂、 气雾剂和/或乳剂，并且，如同本领域常规实际应用的那样，其能包含 在基质型或贮库型经皮贴剂中。
本发明化合物还可以经皮下提供。
优选将化合物用于口服给药。
优选，药物制剂为单位剂型。在这种剂型中，制剂再细分成含有 适量(例如，达到所需效果的有效量)活性组分的适当规模的单位剂 量。
根据本申请，在单位剂量制剂中，活性化合物的量可以在大约1 -100mg，优选约1-50mg，更优选约1-25mg范围内变化或调整。
实际使用剂量可以根据患者需求和所治疗疾病的严重程度变化。 本领域技术人员能够确定具体情况下的合适剂量方案。为方便起见， 在一天中，可以根据需要，将总日剂量均分和分次给药。
本发明化合物和/或其可药用盐的给药量和给药频率由主治临床 医师根据诸如患者年龄、病情和体重以及所治疗症状的严重程度等因 素进行判断调整。一般建议的口服日剂量可以为约1-500mg/天，优 选为1-200mg/天，采用2-4个均分剂量。
本发明另一方面涉及一种试剂盒，该试剂盒包含治疗有效量的至 少一种式III化合物或其可药用盐或其溶剂化物和可药用载体、赋形 剂或稀释剂。
本发明另一方面还涉及一种试剂盒，其包含一定量的至少一种式 III化合物或其可药用盐或其溶剂化物和一定量的至少一种上述抗癌 治疗和/或抗癌药，其中，两种或多种组分的量能达到所需的治疗效 果。
通过下述制备例和实施例来举例说明本发明，但其不限制本发明 的公开范围。其它机械途径和类似结构对本领域技术人员而言是显而 易见的。
如果存在NMR数据，则1H波谱在Varian VXR-200(200MHz，1H)、 Varian Gemini-300(300MHz)或XL-400(400MHz)上获得，作为Me4Si低磁场的ppm报道，并在括号内指出质子数、多重态和以赫兹表示的 偶合常数。当存在LC/MS数据时，用Applied Biosystems API-100 质谱仪和Shimadzu SCL-10A LC柱进行分析：Altech铂C18、3微米、 33mm×7mm ID；梯度流：0min-10％CH3CN，5min-95％CH3CN，7min-95％ CH3CN，7.5min-10％CH3CN，9min-停止。得到保留时间和观测到的 母离子。
下述溶剂和试剂可用其缩写来表示：
薄层色谱法：TLC
二氯甲烷：CH2Cl2
乙酸乙酯：AcOEt或EtOAc
甲醇：MeOH
三氟乙酸酯：TFA
三乙胺：Et3N或TEA
丁氧基羰基：n-Boc或Boc
核磁共振谱：NMR
液相色谱质谱：LCMS
高分辨质谱：HRMS
毫升：ml
毫摩尔：mmol
微升：μl
克：g
毫克：mg
室温或rt(环境温度)：约25℃
实施例
一般，本发明所述的化合物可通过下述流程1的一般途径制得。 用叔丁醇钾和甲酸乙酯处理原料腈，得到中间体烯醇2，紧接着用肼处 理该烯醇，得到所需的取代的3-氨基吡唑。如反应流程3所示，将式 3化合物与适当官能化的的式5酮酸酯缩合，制得式6吡啶酮。在上述 一般途径中使用的酮酸酯是市售产品或可以根据流程图解2制得。
反应流程1
用POCl3处理吡啶酮8，可制得式9氯化物。当R2是H时，通过亲 电卤化、酰化和其它各种亲电芳香族取代，可以在式9化合物的上述 位置上进行取代。
反应流程2
反应流程3
通过在2-丙醇中用与氨反应替代式9化合物的氯，可以引入N7- 氨基官能度(反应流程3)。
C-7氨基中间体10然后用适当的氨磺酰氯或氨基甲酰氯或氯甲酸 酯进行酰化或磺酰化得到所需产物，见反应流程4。
反应流程4
当式6化合物中R3＝OEt时，用反应图解4的方法能容易地制得 式12的二氯化物。对7-氯化物进行选择性取代，制得式13化合物， 该化合物能容易地转化成式14的产物或相应的磺酰亚胺 (sulfonimides)。
反应流程5
制备实施例：
制备例1：
步骤A：
采用DE 19834047A1，p19中的方法。向KOtBu(6.17g，0.055mol) 的无水THF(40ml)溶液中滴加环丙基乙腈(2.0g，0.025mol)和甲酸乙 酯(4.07g，0.055mol)的无水THF(4ml)溶液。立即形成沉淀。搅拌该 混合物12小时。真空浓缩并用Et2O(50ml)搅拌残余物。将得到的残余 物倾析，用Et2O(2×50ml)洗涤并在真空下从残余物中除去Et2O。将 残余物溶解在冷H2O(20ml)中，用12N HCl调节其pH至4-5。用CH2Cl2(2 ×50ml)萃取该混合物。合并有机层，用MgSO4干燥并真空浓缩，得到 黄褐色液体醛。
步骤B：
将制备例1步骤A的产物(2.12g，0.0195mol)、NH2NH2·H2O(1.95g， 0.039mol)和1.8g(0.029mol)冰醋酸(1.8g，0.029mol)溶解在 EtOH(10ml)中。回流该混合物6小时并真空浓缩。使残余物在 CH2Cl2(150ml)中形成浆料并用1N NaOH调节其pH至9。用盐水洗涤有 机层，用MgSO4干燥并真空浓缩，得到蜡状橙色固体产物。
制备例2-3：
使用与制备例1基本相同的方法，不过使用表2第2栏中的腈代 替，制得表2第3栏中的化合物：
表2
制备例4：
根据K.O.Olsen，J.Org.Chem.，(1987) 52，4531-4536中 描述的方法进行反应。因此，在-65--70℃下，向二异丙基氨基化锂 的THF搅拌溶液中滴加新近蒸馏的乙酸乙酯。将所得溶液搅拌30分 钟，并加入酰基氯的THF溶液。在-65--70℃搅拌反应混合物30分钟， 然后加入1N HCl溶液终止反应。使得到的两相混合物温热至室温。所 得混合物用EtOAc(100ml)稀释，并收集有机层。水层用EtOAc(100ml) 萃取。合并有机层，用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并真空浓缩，得到用于 下一步缩合反应的β-酮酸酯粗产物。
制备例5-10：
按照与制备例4基本相同的方法，不过替代使用表3第2栏中的 酰基氯，制得表3第3栏中的β-酮酸酯：
表3
制备例11：
向酸的THF溶液中加入Et3N，然后在-20--30℃加入氯甲酸异丁 酯。在-20--30℃搅拌混合物30分钟后，在氩气气氛下滤出盐酸三乙 胺，并在-65-70℃下，将滤液加入LDA-EtOAc反应混合物(按方法A 制得)中。加入1N HCl后，按常规处理反应混合物并蒸发溶剂，分离 出β-酮酸酯粗产物，该粗产物用于随后的缩合反应中。
制备例12-13.12：
根据与制备例11基本相同的方法，不过替代使用表4第2栏中的 羧酸，制得表4第3栏中的化合物：
表4
制备例14：
将3-氨基吡唑(2.0g，24.07mmol)和苯甲酰乙酸乙酯(4.58ml，1.1eq.) 的AcOH(15ml)溶液加热回流3小时。冷却反应混合物至室温，并真空浓 缩。用EtOAc稀释所得的固体，过滤得到白色固体(2.04g，40％收率)。
制备例15-32.15：
根据与制备例14基本相同的方法，不过替代使用表5第2栏中的 氨基吡唑和表5第3栏中的酯，制得表5第4栏中的化合物：
表5
制备例33：
将苯甲酰乙酸乙酯(1.76ml，1.1eq.)和3-氨基-4-氰基吡唑 (1.0g，9.25mmol)的AcOH(5.0ml)和H2O(10ml)溶液加热回流72小 时。所得溶液冷却至室温，真空浓缩，并用EtOAc稀释。滤出所得的 沉淀，用EtOAc洗涤并真空干燥(0.47g，21％收率)。
制备例33.10：
采用US 3,907,799中公开的方法。将钠(2.3g，2eq.)分批加入 EtOH(150ml)中。当钠完全溶解后，加入3-氨基吡唑(4.2g，0.05mol) 和丙二酸二乙酯(8.7g，1.1eq.)，并将所得溶液加热回流3小时。冷 却得到的悬浮液至室温并过滤。将滤饼用乙醇(100ml)洗涤并溶解在 H2O(250ml)中。所得溶液在冰浴中冷却并用浓HCl调节pH至1-2， 过滤得到的悬浮液，用H2O(100ml)洗涤，真空干燥，得到白色固体 (4.75g，收率63％)。
制备例33.11-33.12：
根据与制备例33.10基本相同的方法，不过替代使用表5.1第2 栏中的化合物，制得表5.1第3栏中的化合物：
表5.1
制备例34：
在室温下，将制备例14制得的化合物(1.0g，4.73mmol)在 POCl3(5ml)和吡啶(0.25ml)中的溶液搅拌3天。用Et2O稀释所得的淤 浆，过滤，固体残余物用Et2O洗涤。将合并的Et2O洗液冷却至0℃， 并用冰处理。当剧烈反应停止时，将得到的混合物用H2O稀释，分离， 且水层用Et2O萃取。合并的有机物用H2O和饱和NaCl洗涤，Na2SO4干 燥，过滤并浓缩，得到浅黄色固体(0.86g，收率79％)。LCMS：MH+＝230。
制备例35-53.15：
根据与制备例34基本相同的方法，不过替代使用表6第2栏中的 化合物，制得表6第3栏中的化合物：
表6
制备例53.16：
将POCl3(62ml)和二甲基苯胺(11.4g，2.8eq.)和制备例33.10 制得的化合物(4.75g，0.032mmol)在氮气下冷却至5℃。将反应混合物 温热至60℃并搅拌过夜。冷却反应混合物至30℃并减压蒸馏除去 POCl3。将残余物溶解在二氯甲烷(300ml)中并倾倒入冰中。搅拌15 分钟后，用固体碳酸氢钠调节混合物的pH至7-8。分离为两层并用水 (3×200ml)洗涤有机层，用MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。将粗产物 用快速色谱法提纯，以50∶50二氯甲烷∶己烷溶液作为洗脱液洗脱二 甲基苯胺。然后将洗脱液变为75∶25二氯甲烷∶己烷溶液洗脱所需产 物(4.58g，收率77％)。MS：MH+＝188。
制备例53.17-53.18：
根据与制备例53.16基本相同的方法，不过替代使用表6.10第2 栏中的化合物，制得表6.10第3栏中的化合物：
表6.10
制备例54：
用NBS(0.085g，1.1eq.)处理制备例34制得的化合物(0.10g， 0.435mmol)的CH3CN(3ml)溶液。在室温搅拌反应混合物1小时并减压 浓缩。粗产物用快速色谱法提纯，用20％的EtOAc的己烷溶液作为洗 脱液(0.13g，收率100％)。LCMS：MH+＝308。
制备例55-68.15：
根据与制备例54基本相同的方法，替代使用表7第2栏中的化合 物，制得表7第3栏中的化合物：
表7
制备例69：
用NCS(0.18g，1.1eq.)处理制备例35制备的化合物(0.3g， 1.2mmol)的乙腈(15ml)溶液并将所得溶液加热回流4小时。加入另 外的NCS(0.032g，0.2eq.)并将所得溶液搅拌回流过夜。将反应混 合物冷却至室温，真空浓缩并将残余物通过快速色谱提纯，用20％EtOAc的己烷溶液作为洗脱液(0.28g，83％收率)。LCMS：MH+＝282。
制备例70：
根据与制备例69基本相同的方法，不过替代使用表8第2栏中的 化合物，制得表8第3栏中的化合物：
表8
制备例71：
向制备例34得到的化合物(1.0g，4.35mmo l)的DMF(6ml)溶 液中加入POCl3(1.24ml，3.05eq.)并将所得混合物在室温下搅拌过 夜。将反应混合物冷却至0℃并加入冰以骤冷过量的POCl3。用1N NaOH中和所得溶液，用水稀释，用二氯甲烷萃取。合并的有机物用硫酸钠 干燥，过滤并真空浓缩。粗产物用快速色谱法提纯，用5％甲醇的二氯 甲烷溶液作为洗脱液(0.95g，85％收率)。LCMS：MH+＝258。
制备例72：
向制备例71的产物(0.25g，0.97mmol)的THF溶液中加入NaBH4(0.041g，1.1eq.)并将所得溶液在室温下搅拌过夜。加水骤冷反应 混合物并用二氯甲烷萃取。合并的有机物用硫酸钠干燥，过滤，并减 压浓缩。粗产物通过快速色谱法提纯，用60∶40己烷∶EtOAc混合物 作为洗脱液(0.17g，收率69％)。LCMS：MH+＝260。
制备例73：
将制备例72制得的化合物(0.12g，0.462mmol)、硫酸二甲酯 (0.088ml，2.0eq)、50％NaOH(0.26ml)和催化的Bu4NBr的二氯甲 烷(4ml)溶液在室温下搅拌过夜。用水稀释反应混合物并用二氯甲烷萃 取。合并的有机物用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。粗产物用快速色谱 法提纯，使用30％乙酸乙酯的己烷溶液作为洗脱液(0.062g，48％收率)。
制备例74：
将制备例54制得的化合物(3.08g，10.0mmol)、2.0M NH3的2- 丙醇(50ml，100.0mmol)和37％NH3水溶液(10.0ml)在密封的压力 容器中在50℃搅拌1天。蒸发溶剂并将残余物用快速色谱法提纯，用 3∶1二氯甲烷∶乙酸乙酯为洗脱剂。得到浅黄色固体(2.30g，80％)。 LCMS：M+＝289。
制备例75-90：
根据与制备例74基本相同的方法，不过替代使用表8.10第2栏 中的化合物，制得表8.10第3栏中的化合物：
表8.10
实施例1：
向制备例74制得的化合物(15mg，0.05mmol)的DMF(2ml)溶液中 加入DMAP(1.0mg)和异氰酸异丙酯(30μl)。将反应混合物在60℃ 加热20小时，冷却至室温并分配在乙酸乙酯(20ml)和水(20ml)中。 除去有机层，用Na2SO4干燥并浓缩，得到膜状的产物。膜用反向HPLC 提纯，得到为无色固体的终产物。MS：m/z＝289.1。
实施例2-13：
用与实施例1基本相同的方法，不过替代使用表9第2栏中的化 合物，和适合的酰化或磺化试剂，一些解释性具体实例见表9第3栏， 可制得本发明公开的化合物，一些解释性实例见表9第4栏。
表9
实施例14：
步骤A：
在室温下，向实施例9制得的化合物的二噁烷/DIPEA(2.5/1.0) 溶液中滴加环戊基胺(1.2eq.)。将所得溶液回流搅拌16小时，冷却至 室温并减压浓缩。粗产物用制备薄层色谱法(8×1000μM)提纯。
步骤B：
在室温下，向实施例14步骤A制得的化合物的CH2Cl2溶液中滴加 TFA(5eq.)。得到的溶液在室温下搅拌18小时，并减压浓缩。将粗产 物再溶解在CH2Cl2中，有机层依次用饱和NaHCO3水溶液(2×2ml)和 盐水(1×2ml)洗涤。干燥有机层(Na2SO4)，过滤并减压浓缩。粗产物 用制备薄层色谱法(8×1000μM)提纯。
实施例15-24：
用与实施例48基本相同的方法，不过替代使用表10第2栏中的 氯化物，制得表10第3栏中的化合物：
表10
试验：可按本领域技术人员已知的方法对本发明公开的化合物进行分 析。代表性的试验如下。
杆状病毒构建：在末端氨基添加5个组氨酸残基，使其能在镍树 脂上提纯，通过PCR将细胞周期蛋白E克隆为pVL1393(Pharmingen， La Jolla，California)。该表达蛋白为大约45kDa。在末端羧基 (YDVPDYAS)添加血细胞凝集素附加表位，通过PCR将CDK2克隆为 pVL1393。该表达蛋白长短约为34kDa。
酶的制备：在相等多重性感染下(MOI＝5)，将表达细胞周期蛋白E 和CDK2的重组杆状病毒协同感染到SF9细胞中48小时。在1000RPM 下离心10分钟收获细胞，然后，使用所得粉末体积5倍的溶胞缓冲液， 将所得粉末在冰上溶胞30分钟，所述溶胞缓冲液含有50mM Tris pH8.0、150mM NaCl、1％NP40、1mM DTT和蛋白酶抑制剂(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)。使溶胞产物在15000RPM 下离心10分钟，将保留了5ml镍珠(对于1升SF9细胞)的上清液在溶 胞缓冲液(Qiagen GmbH，Germany)中洗涤三次。将咪唑加入到杆状病 毒上清液中，使最终浓度为20mM，然后在4℃下用镍珠培养45分钟。 将蛋白质用含有250mM咪唑的溶胞缓冲液洗脱。将洗脱液在2升激酶 缓冲液中透析过夜，所述激酶缓冲液含有50mM Tris pH8.0、1mM DTT、 10mM MgCl2、100μM原钒酸钠和20％甘油。将酶在-70℃等分贮藏。
体外激酶试验：在低蛋白结合96-孔板(Corning Inc，Corning， New York)中进行细胞周期蛋白E/CDK2激酶试验。在激酶缓冲液中稀 释酶至最终浓度为50μg/ml，所述激酶缓冲液含有50mM Tris pH8.0、 10mM MgCl2、1mM DTT和0.1mM原钒酸钠。这些反应中使用的底物是 衍生于组蛋白H1(购自Amersham，UK)的生物素化肽。将底物在冰上熔 化，并在激酶缓冲液中稀释至2μM。将化合物在10％DMSO中稀释至所 需浓度。对于各激酶反应，将20μl 50μg/ml酶溶液(1μg酶)和20μl 2μM 底物溶液混合，然后与各孔中10μl稀释的试验化合物混合。加入50μl 2μM ATP和0.1μCi 33P-ATP(购自Amersham，UK)，开始激酶反应。 反应在室温进行1小时。加入200μl终止缓冲液15分钟，使反应终止， 所述终止缓冲液含有0.1％Triton X-100、1mM ATP、5mM EDTA和5mg/ml 链霉抗生物素包被的SPA珠(购自Amersham，Uk)。然后，使用 Filtermate通用捕获器(Packard/Perkin Elmer Life Sciences)， 将SPA珠捕获至96-孔GF/B滤板(Packard/Perkin Elmer Life Sciences)上。依次用2M NaCl和含1％磷酸的2M NaCl各洗涤珠两次， 以消除非特异性信号。使用TopCount 96孔液体闪烁计数器(购自 Packard/Perkin Elmer Life Sciences)，测定放射性信号。
IC50测定：由8点系列抑制化合物稀释液(各一式两份)产生抑制数 据，根据这些数据绘制剂量响应曲线。用化合物浓度对％激酶活性作 图，用处理样品的CPM除以未经处理样品的CPM来计算％激酶活性。为 了得到IC50值，使剂量响应曲线拟合标准S形曲线，并通过非线性回 归分析法获得IC50值。
虽然本发明已连同上述具体实施方案一起进行了描述，但是，许 多替换方法、改良方法和其它变更方法对本领域技术人员而言是显而 易见的。所有这些替换方法、改良方法和其它变更方法都被认为落入 本发明的精神实质和范围内。