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1、10申请公布号CN104131014A43申请公布日20141105CN104131014A21申请号201410382388622申请日20140806C12N15/29200601C12N15/84200601A01H5/0020060171申请人昆明理工大学地址650093云南省昆明市五华区学府路253号72发明人刘迪秋张南南季博韩青葛锋陈朝银54发明名称岷江百合类萌发素蛋白基因LRGLP1的应用57摘要本发明涉及岷江百合类萌发素蛋白基因LRGLP1的应用，LRGLP1基因的核苷酸序列如SEQIDNO1所述，编码类萌发素蛋白，本发明通过功能基因组学相关技术研究证实LRGLP1基因具有提高。
2、植物抗真菌侵染的功能。将本发明抗真菌LRGLP1基因构建到植物表达载体上并转入烟草中过量表达，转基因烟草植株具有很强的体外抗真菌活性。LRGLP1超表达的转基因烟草对链格孢、核盘菌以及串珠状赤霉菌的生长具有明显的抑制作用。51INTCL权利要求书1页说明书7页序列表3页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页序列表3页附图1页10申请公布号CN104131014ACN104131014A1/1页21一种岷江百合类萌发素蛋白基因LRGLP1在提高烟草对链格孢、核盘菌、串珠状赤霉菌抗性中的应用。2根据权利要求1所述的岷江百合类萌发素蛋白基因LRGLP1的应用。
3、，其特征在于提高烟草的真菌抗性的具体操作如下（1）将岷江百合类萌发素蛋白基因LRGLP1与植物超表达载体PCAMBIA2300S连接，构建植物超表达载体；（2）将上述构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中；（3）以重组载体TDNA上具有的抗性标记来筛选转化子，并通过聚合酶链式反应筛选获得真正的转基因植株，接种特定病原真菌，分析转基因烟草蛋白对真菌生长的抑制活性，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。权利要求书CN104131014A1/7页3岷江百合类萌发素蛋白基因LRGLP1的应用技术领域0001本发明涉及分子生物学以及基因工程相关技术研究领域，特别是具有抗真菌活性的岷江百合类萌发素。
4、蛋白基因LRGLP1的应用。背景技术0002植物病害是指植物在生物因素的影响下发生的一系列生化、生理甚至形态上的病变，阻碍正常的生长、发育，进而严重危害农业生产。病原真菌是引起植物病害的主要病原物。真菌病害发病率极高，且大规模发生时会致使农作物减产甚至死亡。传统对于真菌病害的预防和处理主要是筛选抗性强的品种、及时清理病害植株及果实、使用农药等，这些措施有的周期长，有的效果差，有的还会给环境和人畜的生命健康带来危害，因此不能彻底防治真菌病害。随着重组DNA技术的创立和快速发展，利用基因工程技术来培育新的对真菌病害有很强抗性的植物品种已经成为解决植物真菌病害的新思路，有望从根本上解决真菌病害问题。。
5、0003与萌发素GERMIN一样，类萌发素蛋白GERMINLIKEPROTEINS,GLPS最初是在小麦中发现DUNWELLJM,GIBBINGSJG,MAHMOODT,ETALGERMINANDGERMINLIKEPROTEINSEVOLUTION,STRUCTURE,ANDFUNCTIONCRITICALREVIEWSINPLANTSCIENCES,2008,275342375。在结构上，两者都是由两个外显子编码形成的稳定低聚物，都含有折叠桶状结构域，且都含有一个“CUPIN”蛋白结构域，共同属于一个功能多样化的家族，即CUPIN超家族。在GLPS的二级结构中包含一个特征结构域称为“GER。
6、MINBOX”，结构域中包含两个特定基序，分别为GERMINMOTIF1GX5HXHX3,4EX6G和GERMINMOTIF2GX5PXGX2HX3NBREENJ,BELLGARDMGERMINLIKEPROTEINSGLPSINCEREALGENOMESGENECLUSTERINGANDDYNAMICROLESINPLANTDEFENCEFUNCTIONALINTEGRATIVEGENOMICS,2010,104463476。GLPS为多功能蛋白，主要以酶、受体和结构蛋白的形式参与多种生理生化过程。其中，酶主要包括超氧化物歧化酶SUPEROXIDEDISMUTASE，SOD、草酸盐氧化酶OX。
7、ALATEOXIDASE，OXO、ADP葡萄糖焦磷酸酶/磷酸二酯酶ADPGLUCOSEPYROPHOSPHATASE/PHOSPHODIESTERASE，AGPPASE，受体如雄激素结合蛋白ANDROGENBINDINGPROTEIN，ABP19/20激素受体、RHICADHESINS受体等。0004目前根据功能的差异将植物的GLPS分为3个亚类第1亚类为“TRUEGERMIN”，主要包括小麦、大麦的萌发素及一些其他谷类植物的GLPS，它们具有SOD和OXO的双重活性；第2亚类的GLPS主要是来自于除小麦和大麦之外的其他禾谷类、裸子植物和茄科植物等，这一亚类主要与植物耐氧化胁迫有直接关系，并与。
8、锰超氧化物歧化酶MNSOD极其相似；第3亚类的GLPS主要包括与生长素代谢相关的一些调节蛋白，它们与植物的生理节律和花期诱导功能有关KHURIS,BAKKERFT,DUNWELLJMPHYLOGENY,FUNCTION,ANDEVOLUTIONOFTHECUPINS,ASTRUCTURALLYCONSERVED,FUNCTIONALLYDIVERSESUPERFAMILYOFPROTEINSMOLECULARBIOLOGYANDEVOLUTION,2001,说明书CN104131014A2/7页4184593605。WOO等人2000研究一个大麦GERMIN蛋白的空间结构时发现，每个GEMIN。
9、蛋白以单体的形式相互结合形成二聚体，再进一步以“二聚体的三聚体”的方式形成极为稳定的六聚体WOOEJ,DUNWELLJM,GOODENOUGHPW,ETALGERMINISAMANGANESECONTAININGHOMOHEXAMERWITHOXALATEOXIDASEANDSUPEROXIDEDISMUTASEACTIVITIESNATURESTRUCTURALBIOLOGY,2000,710361040。与MNSOD类似，GEMIN单体中存在相应的配体并可以结合锰离子，这就从一方面解释了GLP蛋白具有SOD活性的原因。在GLPS中包含两个半胱氨酸残基，可以形成二硫键，维持蛋白质空间结构的稳。
10、定性。0005GODFREY等人在葡萄VITISVINIFERA中已经发现7个GLPS基因，这些GLPS的ORF所编码蛋白长度从207205个氨基酸残基不等，并且包含不同的GLP特征结构域GODFREYD,ABLEAJ,DRYIBINDUCTIONOFAGRAPEVINEGERMINLIKEPROTEINVVGLP3GENEISCLOSELYLINKEDTOTHESITEOFERYSIPHENECATORINFECTIONAPOSSIBLEROLEINDEFENSEMOLECULARPLANTMICROBEINTERACTIONS,2007,20911121125。VVGLPS的表达在不同组织。
11、和不同发育阶段差异较大。VVGLP2和VVGLP6在葡萄叶和浆果包括果皮和果肉中有表达；VVGLP1和VVGLP5分别只在根和成熟之前的浆果中表达；VVGLP3、VVGLP4、VVGLP7则在所有的组织中都表达。白粉病菌ERYSIPHENECATOR侵染迅速诱导浆果和叶片中VVGLP3和VVGLP4的表达，相对而言，白粉病菌侵染的浆果中VVGLP5和发病叶中VVGLP6的表达量都显著减少，VVGLP2的表达却基本不受白粉病菌侵染的影响。VVGLP3的表达受ENECATOR侵染的诱导，并具有SOD活性。从甜菜BETAVULGARIS克隆的GLP基因BVGLP1，在线虫HETERODERASCHA。
12、CHTII入侵后转录水平上调，将BVGLP1转入拟南芥中过表达，转基因株系抑制真菌菌丝在体内外的生长扩散，进而增强植株对病原真菌VERTICILLIUMLONGISPORUM和RHIZOCTONIASOLANI的抗性，但是不会影响有益真菌在其体内的生长KNECHTK,SEYFFARTHM,DESELC,ETALEXPRESSIONOFBVGLP1ENCODINGAGERMINLIKEPROTEINFROMSUGARBEETINARABIDOPSISTHALIANALEADSTORESISTANCEAGAINSTPHYTOPATHOGENICFUNGIMOLECULARPLANTMICROBEI。
13、NTERACTIONS,2010,234446457。0006GLPS在植物的抗病防卫反应中有着极为重要的作用。通过RNA干扰使水稻ORYZASATIVA类萌发素蛋白基因OSGLP1沉默，OSGLP1功能缺失植株的高度只有大约正常植株的一半，谷粒也不饱满，同时转基因植株对真菌病害的敏感度增加，如纹枯病和稻瘟病BANERJEEJ,MAITIMKFUNCTIONALROLEOFRICEGERMINLIKEPROTEIN1INREGULATIONOFPLANTHEIGHTANDDISEASERESISTANCEBIOCHEMICALANDBIOPHYSICALRESEARCHCOMMUNICATIO。
14、NS,2010,3941178183。BNGLP3同时具有OXO和SOD活性，还可以在氧爆发时水解活性氧生成H2O2，降低植株对病原菌的敏感性，且在油菜BRASSICANAPUS受核盘菌SCLEROTINIASCLEROTIORUM侵染6H后表达量迅速增加RIETZS,BERNSDORFFFEM,CAIDMEMBERSOFTHEGERMINLIKEPROTEINFAMILYINBRASSICANAPUSARECANDIDATESFORTHEINITIATIONOFANOXIDATIVEBURSTTHATIMPEDESPATHOGENESISOFSCLEROTINIASCLEROTIORUMJO。
15、URNALOFEXPERIMENTALBOTANY,2012,631555075519。0007本发明中类萌发素蛋白基因LRGLP1来自岷江百合LILIUMREGALEWILSON。岷江百合又名王百合，多年生草本植物，我国的百合特有种。仅分布于四川西岷江流域海拔说明书CN104131014A3/7页58002700M的河谷到山腰的岩石缝中，对尖孢镰刀菌等真菌具有很强的抗性。发明内容0008本发明的目的是提供一种从岷江百合中克隆获得具有抗真菌活性的类萌发素蛋白的全长基因LRGLP1，LRGLP1的核苷酸序列如SEQIDNO1所示，该基因全长为908BP，包含一个654BP的开放阅读框、59BP的。
16、5非翻译区UNTRANSLATEDREGIONS,UTR及195BP的3UTR，编码如SEQIDNO2所示氨基酸序列的蛋白质。0009本发明所述类萌发素蛋白基因LRGLP1的编码区是序列表SEQIDNO1中第60713位所示的核苷酸序列。0010本发明分离克隆岷江百合的一个抗真菌相关基因的完整CDNA片段，通过根癌农杆菌AGROBACTERIUMTUMEFACIENS介导将目的基因转入受体植物中过量表达，并通过进一步实验验证该基因是否具有抗真菌的活性，为后期利用该基因改良烟草及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基础。发明人将这个基因命名为LRGLP1。0011GLP是PR家族中的一类胞外糖蛋白，在。
17、植物的生长发育以及对生物和非生物胁迫的防御反应中有重要的作用。GLPS具有OXO、SOD、AGPPASE中的至少一种活性。在真菌病害入侵时，SOD将氧爆发时形成的活性氧转化为过氧化氢和氧分子，降低过多活性氧对植株形成的伤害；OXO可以催化草酸产生二氧化碳和过氧化氢；两种反应所产生的过氧化氢可以通过纤维素交联作用增强细胞壁的结构，并催化细胞壁的氧化交联形成乳突，延缓和阻止病原菌的侵入和扩散，以保护细胞免受再次感染。此外过氧化氢还是植物体内重要的抗病防卫反应相关的信号分子，可以激活并诱导体内大量抗病基因的表达，激活体内的抗病防卫反应。0012本发明涉及分离包含LRGLP1的DNA片段并鉴定其功能，。
18、具有该基因片段的植物在一定程度上具有抵抗特定真菌入侵的表型。其中所述DNA片段如序列表SEQID所示，对该基因进行分析，表明LRGLP1全长CDNA为908BP，包含一个654BP的开放阅读框、59BP的5UTR及195BP的3UTR，其中ORF编码一个具有217氨基酸的蛋白质。LRGLP1的核苷酸序列与岷江百合LRGLP2有97的相似性。编码蛋白具有类萌发素蛋白的特征结构域，GERMINMOTIF1和GERMINMOTIF2。BLASTP检索结果表明LRGLP1编码的蛋白质与岷江百合LRGLP2的相似性最高，与山羊草AEGILOPSTAUSCHII小麦TRITICUMURATU中几个GLPS。
19、的相似性约为6465，这表明其属于岷江百合中的类萌发素蛋白。超表达序列表SEQID1所示序列可以增强烟草对链格孢（ALTERNARIAALTERNATA）、核盘菌（SCLEROTINIASCLEROTIORUM）以及串珠状赤霉菌（GIBBERELLAMONILIFORMIS）的抗性。0013上述LRGLP1基因可以应用于提高烟草的抗真菌特性，具体操作如下1采用扩增LRGLP1的特异引物，从接种尖孢镰刀菌后的岷江百合根中提取总RNA，通过逆转录聚合酶链式反应REVERSETRANSCRIPTIONPOLYMERASECHAINREACTION，RTPCR扩增出LRGLP1的全长编码区，然后将其连。
20、接到PMD18T载体上，经测序获得具有目的基因的克隆。00142用限制性内切酶BAMHI和ECORI酶切PMD18TLRGLP1载体和植物表达载体PCAMBIA2300S，通过胶回收得到目的基因片段和载体大片段。再将所获得LRGLP1基因片段与PCAMBIA2300S载体片段连接，构建植物超表达载体。之后将所构建的重组载体通过根癌说明书CN104131014A4/7页6农杆菌介导转入烟草中表达。00153以重组载体TDNA上具有的抗性标记筛选转化子，并通过PCR以及RTPCR检测得到真正的转基因植株，分析转基因植株对于病原真菌的抗性，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。0016本发明为提。
21、高植物对真菌病害的抗性提供了一种新的方法，通过基因工程手段培育抗病植物可以克服传统育种的不足，不仅育种周期缩短，而且操作简单，容易获得高抗材料。本发明中来自岷江百合的LRGLP1基因能增强植物对几种病原真菌的抗性，将该基因导入烟草中，可以产生具有真菌抗性的新品种和新材料。利用基因工程技术培育抗性植物品种和材料具有明显的优势和不可取代的重要性。它不仅可以为大规模生产作物、花卉等提供方便，减少化学农药的使用，还可以为农业生产节约成本、减少环境污染，因此本发明具有广阔的市场应用前景。附图说明0017图1是本发明中部分LRGLP1转基因烟草基因组DNA的PCR检测结果，其中MARKERDL2000DN。
22、AMARKER大连宝生物，由2,000BP、1,000BP、750BP、500BP、250BP以及100BP六条DNA片段组成；正对照质粒PMD18TLRGLP1为模板的PCR反应；WT非转基因烟草野生型总DNA为模板进行的PCR。0018图2是本发明中部分阳性LRGLP1转基因烟草中LRGLP1转录水平的表达分析结果图，其中MARKERDL2000DNAMARKER大连宝生物；WT非转基因烟草总RNA逆转录CDNA为模板的PCR产物；正对照质粒PMD18TLRGLP1为模板的PCR产物。0019图3是本发明中LRGLP1转基因烟草体外抗真菌活性的抑菌效果图；其中A、B、C图示中的真菌分别是链。
23、格孢、核盘菌、串珠状赤霉菌；WT为野生型烟草的总蛋白；CK为空白对照，即无蛋白对照用于提取蛋白的缓冲液。具体实施方式0020下面通过附图和实施例对本发明进一步说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。0021实施例1LRGLP1全长CDNA克隆以及序列分析用尖孢镰刀菌接种岷江百合，用接种后12H的根提取总RNA，用液氮将处理过的岷江百合的根研磨成粉末，然后转入离心管中，采用异硫氰酸胍法提取总RNA。采用逆转录酶MMLVPROMEGA以总RNA为模板合成CDNA第一链，反应体系和操作过程为取5G。
24、TOTALRNA，依次加入50NGOLIGODT，2LDNTPMIX25MMEACH，用DEPC水将反应体积补齐至145L；混匀后，70加热变性5MIN后迅速在冰上冷却5MIN，然后依次加入4L5FIRSTSTANDBUFFER、05LRNASIN200U、1LMMLV200U，混匀并简短离心，42温浴15H，取出后70加热10MIN，终止反应。CDNA第一链合成后置于20保存备用。0022以合成的第一链CDNA为模板，扩增目的基因LRGLP1，所用上下游引物序列分别为5ACGCACATATGGCTACCCACTACT3及5CGACTAGAACTGAGCCTGGAGCC3。采用ADVANTAG。
25、ETM说明书CN104131014A5/7页72PCRENZYMECLONTECH扩增出目的基因。PCR反应条件951MIN；9430S，6130S，721MIN，28个循环；725MIN。反应体系20L为1LCDNA、2L10ADVANTAGE2PCRBUFFER、18LDNTPMIX10MMEACH、02L正向引物10M、02L反向引物10M、02LADVANTAGE2PCRPOLYMERASEMIX、146LPCRGRADEWATER。PCR结束后，取8L进行琼脂糖凝胶电泳，用以检测扩增产物的特异性以及大小。0023所得到PCR产物只有一条DNA带，故直接对PCR产物进行TA克隆，使用的。
26、试剂盒为PMD18TVECTORKIT大连宝生物，反应体系和操作过程为取15LPCR产物，依次加入1LPMD18TVECTOR50NG/L和25L2LIGATIONSOLUTIONI，混匀后置于16过夜反应。通过热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5感受态中。用含有氨苄青霉素AMPICILLIN，AMP的LB固体培养基筛选阳性克隆。挑选若干个单菌落，摇菌后用扩增LRGLP1的特异引物检测多克隆位点插入LRGLP1的克隆。将得到的阳性克隆进行测序，最终获得的LRGLP1全长CDNA为908BP，通过NCBIORFNDERHTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/GORF/GORFHTML分析发。
27、现其包含一个654BP的开放读码框见序列表。LRGLP1编码一个含217个氨基酸的蛋白质LRGLP1，其分子量约为2336KDA，等电点为560。借助生物信息学软件SIGNALP41分析LRGLP1编码的蛋白序列，检测其是否具有N端信号肽。结果显示在LRGLP1中存在信号肽，这就表明LRGLP1为一种分泌蛋白。0024实施例2植物超表达载体构建采用SANPREP柱式质粒DNA小量抽提试剂盒上海生工提取插入LRGLP1的大肠杆菌质粒PMD18TLRGLP1以及植物表达载体PCAMBIA2300S质粒，取1L用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性及浓度高低。用限制性内切酶ECORITAKARA。
28、和BAMHITAKARA分别对质粒PMD18TLRGLP1和PCAMBIA2300S进行双酶切100L体系，反应体系和操作过程为分别取20LPMD18TLRGLP1和PCAMBIA2300S质粒、依次加入10L10KBUFFER、5LECORI、5LBAMHI、60LDDH2O，混匀后短时离心，置于37过夜反应。将所有酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用SANPREP柱式DNA胶回收试剂盒上海生工对LRGLP1片段和PCAMBIA2300S载体大片段分别进行胶回收，取1L回收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的大小以及浓度，置于20保存备用。0025利用T4DNALIGASETAKARA，将回。
29、收的LRGLP1DNA片段和PCAMBIA2300S载体片段连接起来，反应体系20L和操作过程为取10LLRGLP1DNA片段依次加入2LPCAMBIA2300S载体DNA、2L10T4DNALIGASEBUFFER、1LT4DNALIGASE、5LDDH2O，混匀后短时离心，然后16水浴过夜反应。接着采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5中，用含有50MG/L卡那霉素KANAMYCIN，KM的固体培养基筛选阳性克隆。挑选单菌落摇菌，以菌液为模板用扩增LRGLP1的特异引物进行PCR，挑选出LRGLP1与PCAMBIA2300S成功连接的克隆，并向检测得到的阳性菌株中加入甘油并置于80保存。
30、备用。0026采用SANPREP柱式质粒抽提试剂盒上海生工提取并纯化上述大肠杆菌DH5中的PCAMBIA2300SLRGLP1质粒。随后用液氮冻融法将上述构建的植物表达载体PCAMBIA2300SLRGLP1转入所制备的根癌农杆菌LBA4404感受态细胞中。操作步骤为取2GPCAMBIA2300SLRGLP1质粒加入含有200L感受态细胞的离心管中，轻轻混匀后说明书CN104131014A6/7页8冰浴5MIN，随后转入液氮中冷冻1MIN，然后迅速置于37水浴5MIN，再冰浴2MIN，之后加入500LLB液体培养基于28振荡培养4H。将活化后的农杆菌涂于含有50MG/LKM的LB固体培养基上，。
31、28倒置培养。挑选单菌落摇菌，再用扩增LRGLP1的特异性引物进行PCR反应，检测PCAMBIA2300SLRGLP1是否转入农杆菌中。对于阳性克隆，加入甘油后置于80保存备用。0027实施例3农杆菌介导的植物遗传转化以及转基因植物筛选本实验的转基因受体是烟草NICOTIANATABACUML。将烟草种子用75的酒精浸泡30S，用无菌水洗涤后用01的HGCL2浸泡8MIN，然后再用无菌水洗涤若干次，播种于1/2MS培养基上，28暗培养58D，发芽后转至光照培养箱25，16H/D光照，以后每月用MS培养基继代一次。0028从80冰箱中取出保存的含有PCAMBIA2300SLRGLP1质粒的农杆菌。
32、LBA4404菌种，取20L接种于5ML含有50MG/LKM和20MG/L利福平的LB液体培养基中，28培养至培养基浑浊。吸取1ML浑浊的菌液至含有50MG/LKM的LB固体培养基上，28培养48H。随后将LB固体培养基上的农杆菌刮下适量接种于附加有20MG/L的乙酰丁香酮的MGL液体培养基中，28振荡培养58H以活化农杆菌。0029取无菌烟草苗叶子切成约1CM2的叶盘，完全浸泡于上述含有活化农杆菌的MGL液体培养基中，25浸染15MIN。用无菌滤纸吸干叶盘表面的菌液，将叶盘置于共培养基上，22无光条件下共培养2天。烟草转化的共培养基为MS002MG/L6BA21MG/LNAA30G/L蔗糖6。
33、G/L琼脂。0030将共培养后的叶盘转到加有抗生素的MS筛选培养基中分化成苗，同时筛选转基因植株。烟草筛选培养基为MS05MG/L6BA01MG/LNAA30G/L蔗糖6G/L琼脂50MG/LKM200MG/L头孢霉素CEFOTAXIMESODIUMSALT，CEF；筛选培养时将培养瓶转移至光照培养箱培养25，16H/D光照，8H/D黑暗。待烟草长出芽后用含有50MG/LKM和200MG/LCEF的MS培养基继代培养。因烟草愈伤分化率较高，故需要对再生植株进行进一步筛选。将烟草再生苗移至含有50MG/LKM的MS培养基上使其生根，最后选用生根较好的再生苗做进一步的检测。0031采用CTAB法提。
34、取转基因烟草植株叶片的基因组DNA，取1L所得基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和浓度。以转基因植株的基因组DNA为模板用LRGLP1的特异引物进行PCR反应。PCR结束后，取8L产物用于琼脂糖凝胶电泳以检测阳性转基因植株。部分烟草转基因植株的扩增结果如图1所示。LRGLP1转基因烟草共筛选到29株阳性转基因植株。0032实施例4转基因烟草中LRGLP1的表达分析以及转基因植株抗真菌活性分析分别取阳性转基因植株以及非转基因烟草野生型的嫩叶提取总RNA，逆转录生成CDNA第一链，并以此为模板用扩增LRGLP1的特异引物进行PCR，根据PCR结果分析各转基因植株中LRGLP1转录水平的表达。
35、。总RNA提取以及RTPCR的方法与实施例1中相同。PCR结束之后，取8L用于琼脂糖凝胶电泳，部分单株的检测结果如图2所示。共检测到18个转基因单株中LRGLP1在转录水平大量表达，这些单株的编号为118。0033将实验室保存的几种真菌接种于PDA固体培养基200G/L马铃薯，15G/L琼脂，20G/L葡萄糖上，28暗培养，待菌落生长至直径约为23CM时添加蛋白，分析转基因说明书CN104131014A7/7页9植株体外抗真菌活性。供试真菌共有6种葡萄座腔菌BOTROSPHAERIADOTHIDEA、链格孢ALTERNARIAALTERNATA、灰葡萄孢BOTRYTISCINEREA、胶孢炭疽。
36、菌COLLETORICHUMGLOEOSPORIOIDES、串珠状赤霉菌GIBBERELLAMONILIFORMIS和核盘菌SCLEROTINIASCLEROTERUM。为了防止其它杂菌污染所提取的蛋白，整个植物蛋白提取过程均是无菌操作。首先取1G转基因烟草单株编号分别为2、5、6、10及野生型叶片放入研钵中，加入1ML蛋白提取液1MNACL，01M乙酸钠，1PVP，PH6，充分研磨。转入15ML离心管中，混匀后4静置过夜。4离心30MIN12,000G，取上清于新的15ML离心管中，并取适量用紫外分光光度仪测定总蛋白浓度。将转基因和野生型植株的总蛋白浓度调整至02G/L，然后分别取20L滴于。
37、各真菌培养基的无菌滤纸上。在每个真菌的平板上除了添加不同转基因烟草植株的总蛋白，同时平行添加野生型烟草的总蛋白和空白对照蛋白提取液。28培养几天后观察各处理真菌生长的情况，并据此来评价LRGLP1转基因烟草的体外抗真菌活性。结果如图3所示，LRGLP1转基因烟草蛋白对核盘菌、链格孢以及串珠状赤霉菌的生长具有明显的抑制作用。说明书CN104131014A1/3页10序列表SEQID昆明理工大学岷江百合类萌发素蛋白基因LRGLP1的应用4PATENTINVERSION351908DNALILIUMREGALEWILSONMRNA19085UTR159CDS607133UTR7149081ACATG。
38、GGAAGTCCTTCACCTTTGAGAAAATCGTCTCGATTGCTAAAATATAACGCACATA60TGGCTACCCACTACTTCCTCTGGCTCGCCGTCCTTGCCCTAGCCCCCTCCCATTCAATGG120CTTCTGATCCTGACTCACTGCAGGATTTCTGTGTGGCTGACCCAAACTCCCAAGTGATTG180TGAATGGATTAGTCTGCAAGGACCCAAAGCAAGCCCAACCTGCTGATTTTTTCTTCCCCG240GACTGAACCAGCCAGGGAGCACAACCAACCAGCTGGGGTCTAACGTCACTCTTG。
39、TCAGCG300CCGCAAACCTTCCGGGGCTCAACGCCCTTGGAATCTCTGTGGCTCGCCTGGACTTTGCAC360CGTATGGCCTCATTCCCCCTCACTACCATCCACGTGCGACCGAGATCCTGACATTGCTGG420AGGGTACTCTCTACGTTGGCTTCGTCACTTCCTTCCCCGACTTCCGTCTCATCAGCAAGA480TCCTCAAGGCCGGTGATGTCTTTGTCTTCCCCAAAGGACTCGTCCACTTCCAGTTTAATC540AGGACGGCACCAAACCAGCAGTTTCCCTGTCAGGCTTGA。
40、GCAGCCAGAACCCAGGACTGG600序列表CN104131014A102/3页11TCACTGTAGCTAATGCCGTTTTCGGATCTAACCCGCCTATCTGGGATGATGTTCTGGCCA660AGGCCTTCCAGTTGGACAAGAAGACAGTTGATTGGCTCCAGGCTCAGTTCTAGTCGGGTT720GCCCTAATGATAGCCTGCTGATAGTAGCAAAACATGTCGATGTTTGTATTGACTATAAAG780TAATAAGCAAGCAGATGCTTTCATGATTGTATGTTCAATTTTCCATTACATAATTAAGTG840T。
41、TATAATATATTTAAATATGTTTTTTTTTCTAATTAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA900AAAAAAAA9082217PRTLILIUMREGALEWILSON2METALATHRHISTYRPHELEUTRPLEUALAVALLEUALALEUALAPRO151015SERHISSERMETALASERASPPROASPSERLEUGLNASPPHECYSVAL202530ALAASPPROASNSERGLNVALILEVALASNGLYLEUVALCYSLYSASP354045PROLYSGLNALAGLNPROALAASPPHEPHEPHEPROGLY。
42、LEUASNGLN505560PROGLYSERTHRTHRASNGLNLEUGLYSERASNVALTHRLEUVALSER65707580ALAALAASNLEUPROGLYLEUASNALALEUGLYILESERVALALAARG859095LEUASPPHEALAPROTYRGLYLEUILEPROPROHISTYRHISPROARG100105110ALATHRGLUILELEUTHRLEULEUGLUGLYTHRLEUTYRVALGLYPHE115120125VALTHRSERPHEPROASPPHEARGLEUILESERLYSILELEULYSALA130135140GLYA。
43、SPVALPHEVALPHEPROLYSGLYLEUVALHISPHEGLNPHEASN145150155160GLNASPGLYTHRLYSPROALAVALSERLEUSERGLYLEUSERSERGLN165170175ASNPROGLYLEUVALTHRVALALAASNALAVALPHEGLYSERASNPRO180185190PROILETRPASPASPVALLEUALALYSALAPHEGLNLEUASPLYSLYS195200205序列表CN104131014A113/3页12THRVALASPTRPLEUGLNALAGLNPHE210215324DNA人工序列3ACGCACATATGGCTACCCACTACT24423DNA人工序列4CGACTAGAACTGAGCCTGGAGCC23序列表CN104131014A121/1页13图1图2图3说明书附图CN104131014A13。