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1、10申请公布号CN104130933A43申请公布日20141105CN104130933A21申请号201410377035722申请日20140802C12M1/00200601C12M1/38200601C12M1/3420060171申请人张金木地址350004福建省福州市台江区义洲长寿园8座40172发明人张金木54发明名称一种荧光恒温PCR扩增仪57摘要本发明涉及一种荧光恒温PCR扩增仪,它由三个恒温水浴槽与一个测量筒组成,通过步进电机、滚珠丝杆、直线导轨引导样品管载盘中的样品在三个恒温水浴槽中实现PCR扩增反应,并在反应结束后在测量筒内进行荧光检测。它用于在生物体外扩增特定的DN。
2、A片段,同时利用荧光信号的变化检测PCR扩增反应最终产物的量的变化。51INTCL权利要求书2页说明书3页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书3页附图2页10申请公布号CN104130933ACN104130933A1/2页21一种荧光恒温PCR扩增仪,其特征它由三个不同温度的恒温水浴槽和一个测量筒组成,通过步进电机、滚珠丝杆、直线导轨构成的机械臂引导样品管载盘移动,使样品管依序浸于三个恒温水浴槽中,样品在三个恒温水浴槽中实现不同阶段的PCR扩增反应,从而完成变性、复性和延伸三个过程,并在扩增反应结束后在测量筒进行荧光检测,样品管在每个槽中停留时间和在槽。
3、间的移动,都是通过控制器控制,三个不同温度的恒温水浴槽中各安装1只带保护管的铂热电阻,其补偿电阻采用精密线绕电阻,同时在控制器中装有3至4只精密线绕电阻,其电阻值按照DNA变性、复性和延伸三个环节的设定温度点附近的温度查铂热电阻分度表获得,将精密线绕电阻对应的温度值记录保存在控制器的非易失存储器中,用于校正仪表温度,控制器在每次开机后进行温度误差校验一次,它通过单多通道模拟电子开关分时选通精密线绕电阻接入输入信号放大电路实现校验,校验时由定时送检获得各铂热电阻温度的测量误差,以及精密线绕电阻所显示温度与所述保存在非易失存储器中的应当显示温度之差,由控制器对铂热电阻所测温度进行补偿,每个恒温水浴。
4、槽均呈圆形其外壁安装有电加热管,在三个恒温水浴槽中心附近安装一台电风扇用于降温散热,并在安装荧光恒温PCR扩增仪的室内安装有空调器,控制室内温度稳定在三个恒温水浴槽中最低设定温度以下,另一个为测量筒,在测量筒底部装有一台电风扇和小功率加热器,并装1只小型铂热电阻的温度传感器,其中小功率加热器用于加快测量筒内水分蒸发,电风扇用于将空气中水分排出,以保持测量筒内干燥,在测量筒内对准样品管的位置安装有由激发光源和光接收装置组成的检测装置,其激发光源由LED发光二极管、滤光镜和反光杯构成,不同的LED发光二极管再配滤光镜才能更好地实现不同激发波长,光接收装置由滤光镜和光电倍增管组成,样品管载盘由步进电。
5、机驱动旋转使样品依序进入测量位置,在样品管载盘外沿固定一个遮挡光线用的遮光条,同时在测量筒内安装有光电开关,当遮光条通过光电开关缝隙时,光电开关动作用于定位样品管载盘上1号样品管,即当1号样品管进入测量位置时,其遮光条所处位置应使光电开关刚好动作,从而起动检测,然后步进电机依序转过一个转角,实现依序定位检测各样品管中的样品,传动轴两端分别与步进电机的轴和样品管载盘固定,在滚珠丝杆上有一丝杆螺母固定于直线导轨滑块上使之沿直线导轨移动,该丝杆螺母中除与丝杆配合的孔外还有一个与垂直的传动轴配合的轴孔,传动轴是一种阶梯结构的轴与丝杆螺母通过铜套实现动配合,同时在传动轴上还装一个齿条,齿条的孔通过铜套与。
6、传动轴实现滑动配合,齿条与丝杆螺母间通过垂直方向的小轴连接定位,使齿条仅作垂直方向移动,齿条的一端靠传动轴的肩限位另一端靠轴套和肖限位,这样当步进电机通过齿轮带动齿条作垂直方向移动时,就带动固定在传动轴上的样品管载盘做垂直方向移动,从而实现样品管载盘在三个恒温水浴槽和一个测量筒间移动,在滚珠丝杆一端装一台步进电机用于通过滚珠丝杆和丝杆螺母准确传递样品管载盘沿水平方向移位距离的转数和转角,为了防止反应体系中液体产生蒸气,在样品管载盘上加装一个盖,盖上有电热片加热器使盖子温度比恒温水浴槽稍高,样品管载盘靠外圆圈沿圆周均等分布用于放置样品管的孔,在样品管的孔靠外,用螺丁固定一遮光条,以识别样品管的1。
7、号孔,温度控制根据PCR反应环节所设定的三个恒温水浴槽温度加热恒温水浴槽,其恒温保持是以小功率的加热或散热,使温度控制的回差保持在PCR扩增允许的范围内。2根据权利要求1所述的一种荧光恒温PCR扩增仪,其特征在于还包括权利要求书CN104130933A2/2页3所述控制器由单多通道模拟电子开关、输入信号放大电路、输入信号放大电路、输入调理电路、输入调理电路、输入多选一开关、A/D转换电路、单片机、RS232电路、加热电源、步进电机驱动电路组成,其中输入信号放大电路中包含由高精度的LT1014或OPA121等精密运算放大器,它和输入调理电路组成专用光信号放大电路,输入信号放大电路由OP07组成的。
8、温度毫伏信号放大电路及其输入调理电路构成,RS232电路用于与上位机通信。权利要求书CN104130933A1/3页4一种荧光恒温PCR扩增仪技术领域0001本发明涉及一种荧光恒温PCR扩增仪,它由三个恒温水浴槽与一个测量筒组成,通过步进电机、滚珠丝杆、直线导轨引导样品管载盘中的样品在三个恒温水浴槽中实现PCR扩增反应,并在反应结束后在测量筒内进行荧光检测。它用于在生物体外扩增特定的DNA片段,同时利用荧光信号的变化检测PCR扩增反应最终产物的量的变化。现有技术0002人们在体外实验中发现,DNA在高温时可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,配合生物学手段通过温度变化控制DN。
9、A的变性和复性,并且多次重复“变性解链退火合成延伸”的循环就能以几何级数大量扩增特定的基因。DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。在PCR技术的发展过程中,热稳定DNA聚合酶的发现以及温度循环的自动化大大简化了PCR扩增程序。荧光定量PCR扩增技术是在PCR反应体系中加入荧光基团,随着PCR反应的循环其荧光信号强度的积累,用于实时监测整个PCR进程。0003目前,PCR扩增仪一般分为普通PCR扩增仪和荧光PCR扩增仪,按热传导介质不同分有气流式PCR扩增仪、金属模块式PCR扩增仪和水浴锅PCR扩增仪等,它们原理相似,但由于精确的温度控制是决定PCR反应能否成功的关键,因此在仪器结构、加。
10、热致冷方式和荧光检测方式等方面各不相同,以适应各种要求。PCR扩增仪的应用有感染性、遗传性疾病及恶性肿瘤的分子诊断和研究、亲子鉴定、克隆基因等。发明内容0004现有恒温式PCR扩增仪扩增结束后都不进行检测,其扩增反应的终点产物的检测是由其它设备实现,这对少量样品的PCR扩增就显得很麻烦,而恒温式PCR扩增仪具有价廉操作简便的特点,它比其它形式扩增仪更具控温精度高、变换温度快捷等优越性。非恒温式PCR扩增仪是在扩增结束后由该扩增仪对扩增反应的最终产物进行检测。目前荧光PCR扩增仪是采用超低温CCD成像,该系统一次对多点成像但灵敏度低精确度差,另有的采用光学系统逐个扫描样品并检测,但其扫描系统复杂。
11、造价昂贵,检测速度慢,因此对于大多数少量样品的扩增是很不经济的。本发明介绍一种荧光恒温PCR扩增仪,其特征是它由三个不同温度的恒温水浴槽和一个测量筒组成,通过步进电机、滚珠丝杆、直线导轨构成的机械臂引导样品管载盘移动,使样品管依序浸于三个恒温水浴槽中,样品在三个恒温水浴槽中实现不同阶段的PCR扩增反应,从而完成变性、复性和延伸三个过程,并在扩增反应结束后在测量筒进行荧光检测。样品管在每个槽中停留时间和在槽间的移动,都是通过控制器控制。该荧光恒温PCR扩增仪温度可调、恒温精度高、温度均匀,价格低廉,适用于基层实验室使用。0005三个不同温度的恒温水浴槽中各安装1只带保护管的铂热电阻的温度传感器,。
12、铂热电阻的补偿电阻采用精密线绕电阻,同时在控制器中装有3至4只精密线绕电阻,其说明书CN104130933A2/3页5电阻值按照DNA变性、复性和延伸三个环节的设定温度点附近的温度查铂热电阻分度表获得,由于不同的引物设计其反应温度不同因此多一个精密线绕电阻。将精密线绕电阻对应的温度值记录保存在控制器的非易失存储器中,用于校正仪表温度。控制器在每次开机后进行温度误差校验一次,它通过单多通道模拟电子开关分时选通精密线绕电阻接入输入信号放大电路实现校验。校验时由定时送检获得各铂热电阻温度的测量误差,以及精密线绕电阻所显示温度与所述保存在非易失存储器中的应当显示温度之差,由控制器对铂热电阻所测温度进行。
13、补偿。每个恒温水浴槽均呈圆形其外壁安装有电加热管,在三个恒温水浴槽中心附近安装一台电风扇用于降温散热。并在安装荧光恒温PCR扩增仪的室内安装有空调器,控制室内温度稳定在三个恒温水浴槽中最低设定温度以下。另一个为测量筒,在测量筒底部装有一台电风扇和小功率加热器,并装1只小型铂热电阻的温度传感器,将测量筒温度控制在30至35范围,其中小功率加热器用于加快测量筒内水分蒸发,电风扇用于将空气中水分排出,以保持测量筒内干燥。该电风扇在测量时关闭,其它扩增时间开启。在测量筒内对准样品管的位置安装有由激发光源和光接收装置组成的检测装置。其激发光源由LED发光二极管、滤光镜和反光杯构成,单色LED发光二极管价。
14、格低、能耗少、寿命长,但是需要不同的LED发光二极管再配滤光镜才能更好地实现不同激发波长。光接收装置由滤光镜和光电倍增管组成,激发光源和光接收装置中的滤光镜都是用于排除环境光和无用光信号的影响,用以提高光检测精度。样品管载盘由步进电机驱动旋转使样品依序进入测量位置。在样品管载盘外沿固定一个遮挡光线用的遮光条,同时在测量筒内安装有光电开关,当遮光条通过光电开关缝隙时,光电开关动作用于定位样品管载盘上1号样品管。即当1号样品管进入测量位置时,其遮光条所处位置应使光电开关刚好动作,从而起动检测,然后步进电机依序转过一个转角,实现依序定位检测各样品管中的样品。步进电机通过传动轴传递步进电机的转角,传动。
15、轴两端分别与步进电机的轴和样品管载盘固定。在滚珠丝杆上有一丝杆螺母固定于直线导轨滑块上使之沿直线导轨移动,该丝杆螺母中除与丝杆配合的孔外还有一个与垂直的传动轴配合的轴孔,传动轴是一种阶梯结构的轴与丝杆螺母通过铜套实现动配合,同时在传动轴上还装一个齿条,齿条的孔通过铜套与传动轴实现滑动配合,齿条与丝杆螺母间通过垂直方向的小轴连接定位,使齿条仅作垂直方向移动,齿条的一端靠传动轴的肩限位另一端靠轴套和肖限位,这样当步进电机通过齿轮带动齿条作垂直方向移动时,就带动固定在传动轴上的样品管载盘做垂直方向移动,从而实现样品管载盘在三个恒温水浴槽和一个测量筒间移动。0006滚珠丝杆直线导轨可以外购。在滚珠丝杆。
16、一端装一台步进电机用于通过滚珠丝杆和丝杆螺母准确传递样品管载盘沿水平方向移位距离的转数和转角。在直线导轨两端各固定在支架上。为了防止反应体系中液体产生蒸气,在样品管载盘上加装一个盖,盖上有电热片加热器使盖子温度比恒温水浴槽稍高。0007样品管载盘靠外圆圈沿圆周均等分布用于放置样品管的孔,在样品管的孔靠外,用螺丁固定一遮光条,以识别样品管的1号孔,控制器由单多通道模拟电子开关、输入信号放大电路、输入信号放大电路、输入调理电路、输入调理电路、输入多选一开关、A/D转换电路、单片机、RS232电路、加热电源、步进电机驱动电路组成。其中输入信号放大电路中包含由高精度的LT1014或OPA121等精密运。
17、算放大器,它和输入调理电路组成专用光信号放大电路。输入信号放大电路由OP07组成的温度毫伏信号放大电路及其输说明书CN104130933A3/3页6入调理电路构成。RS232电路用于与上位机通信,它将荧光信号采集后送计算机分析研究和处理,得出量化的实时结果。0008所述一种荧光恒温PCR扩增仪在其中控制器控制下,根据PCR反应环节所设定的三个恒温水浴槽温度加热恒温水浴槽,其恒温保持是以小功率的加热或散热,使温度控制的回差保持在PCR扩增允许的范围内。附图说明0009图1是一种荧光恒温PCR扩增仪的结构示意图。0010图2是一种荧光恒温PCR扩增仪的构成方框示意图。实施例0011一种荧光恒温PC。
18、R扩增仪的构成示意图如图1所示。它由恒温水浴槽13、测量筒18、机械臂,及由样品管载盘10、盖25、电热片加热器19组成的样品管载盘组件,以及电风扇16、空调器14和电源电路组成。其中恒温水浴槽13有三个每个恒温水浴槽外壁安装有电加热管12,恒温水浴槽13内装1只带保护管的铂热电阻15。测量筒18底部装有一台电风扇20和小功率加热器19,并装1只小型铂热电阻用于干燥环境。测量筒18内还安装有光电开关23及由激发光源22和光接收装置21组成的检测装置。其激发光源22由LED发光二极管和反光杯、滤光镜构成,光接收装置21由滤光镜和光电倍增管组成,反光杯可采用LED发光二极管手电筒用的反光杯。机械臂。
19、由滚珠丝杆2、直线导轨3、导轨滑块4、丝杆螺母5、步进电机1、步进电机8、步进电机9、传动轴7、齿条6、支架24构成。丝杆螺母5的孔通过铜套与传动轴7配合,传动轴7上装有齿条6与丝杆螺母5间通过小轴连接定位使之限定在垂直方向移动,步进电机9通过齿轮带动齿条6作垂直方向移动。齿条6另一端靠轴套和肖在传动轴7上定位。样品管载盘10靠外圆圈沿圆周均等分布24个孔用于放置样品管11。控制器17中由单多通道模拟电子开关、输入信号放大电路、输入调理组成的温度毫伏信号的输入放大电路和由输入信号放大电路、输入调理组成的光输入信号放大电路,以及输入多选一开关、A/D转换电路、单片机、RS232电路和步进电机驱动电路组成。其中输入信号放大电路由高精度LT1014放大电路组成及由OP07组成的温度毫伏信号的输入放大电路。RS232电路用于与上位机通信。说明书CN104130933A1/2页7图1说明书附图CN104130933A2/2页8图2说明书附图CN104130933A。