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1、10申请公布号CN104131021A43申请公布日20141105CN104131021A21申请号201410375519822申请日20140801C12N15/70200601C12N15/6620060171申请人中国农业科学院兰州兽医研究所地址730046甘肃省兰州市盐场堡徐家坪1号72发明人周继章陈启伟李兆才曹小安宫晓炜74专利代理机构北京方圆嘉禾知识产权代理有限公司11385代理人董芙蓉54发明名称抗菌肽共表达载体及其构建和表达方法57摘要本发明公开了抗菌肽共表达载体及其构建和表达方法，所述抗菌肽为四种，四种抗菌肽的编码基因分别两两连接到在同一宿主菌中同时表达的双表达载体PET。
2、DUET1、PRSFDUET1。本发明的抗菌肽共表达载体可以同时高效稳定的表达四种抗菌肽，从而具有高效广谱抗菌和抗病毒活性，表达的抗菌肽蛋白结构和天然抗菌肽保持一致，解决了融合表达时改变蛋白结构而影响抗菌肽活性及产量的问题。51INTCL权利要求书1页说明书5页序列表2页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页序列表2页附图1页10申请公布号CN104131021ACN104131021A1/1页21抗菌肽共表达载体，其特征在于所述抗菌肽为四种，四种抗菌肽的编码基因分别两两连接到在同一宿主菌中同时表达的双表达载体PETDUET1、PRSFDUET1。2根。
3、据权利要求1的共表达载体，其特征在于所述抗菌肽为LEAP2、TAP、SBD1、LYSOZYME。3根据权利要求2的共表达载体，其特征在于所述抗菌肽的编码基因与双表达载体的连接关系为PETDUET1L2T和PRSFDUET1S1LY。4根据权利要求1的共表达载体，其特征在于宿主菌为大肠杆菌。5权利要求1的抗菌肽共表达载体的构建方法，其特征在于利用引物扩增抗菌肽的编码基因，通过酶切、连接、转化将四种抗菌肽的编码基因分别两两插入双表达载体PETDUET1、PRSFDUET1。6根据权利要求5的构建方法，其特征在于所述抗菌肽为LEAP2、TAP、SBD1、LYSOZYME，与双表达载体的连接关系为PE。
4、TDUET1L2T和PRSFDUET1S1LY。7根据权利要求6的构建方法，其特征在于包括下述步骤1以抗菌肽LEAP2、TAP、SBD1、LYSOZYME编码基因作为PCR模版扩增出抗菌肽基因；2使用ECORI、NOTI分别双酶切载体PETDUET1、PRSFDUET1；3利用ECORI、NOTI分别双酶切LEAP2、SBD1抗菌肽的编码基因，将其与双酶切后的PETDUET1、PRSFDUET1载体连接得到表达载体；4利用BGLII、XHOI双酶切步骤3得到的表达载体，使用BGLII、XHOI双酶切TAP、LYSOZYME抗菌肽的编码基因，分别与双酶切后的表达载体连接得到共表达载体。8根据权利。
5、要求7的构建方法，其特征在于步骤1各抗菌肽的特异性引物分别为LEAP2FCCGGAATTCATGACTCCATTTTGGAG；LEAP2RATAGCGGCCGCTCATTCCTGGGCCACACT；TAPFCGCAGATCTAATCCTGTAAGCTGTGTTA；TAPRCCGCTCGAGACTTCTTTCTACAGCATAAAT；SBD1FCCGGAATTCCAAGGAGTAAGAAATCGTCTAAG；SBD1RATAGCGGCCGCCTTCTTTCTGCAGCATTTTACT；LYSOZYMEFCGCAGATCTAGGTCTTTGCTAATCTTGGTG；LYSOZYMERCCGCTCG。
6、AGCAGCCGGCAGCCTCTGATCCA。9权利要求1的共表达载体的表达方法，其特征在于将共表达载体转化到同一宿主菌进行涂板，过夜培养，挑取单克隆菌落接种于LB培养基中，摇菌过夜，转接至新LB培养基中，加入IPTG进行诱导。10根据权利要求9的表达方法，其特征在于培养最终达到OD值0608，所用IPTG浓度为1MM/L。权利要求书CN104131021A1/5页3抗菌肽共表达载体及其构建和表达方法技术领域0001本发明涉及能够同时表达多种抗菌肽的共表达载体，属于生物工程技术领域。背景技术0002由于抗生素与化学合成药物在畜牧生产中多年滥用，很多病原菌都出现了耐药性，药物残留等问题，因此研。
7、究人员开始利用现代生物学技术研发绿色、高效、有利于生物体健康、有利于环境保护以及提高养殖效益的、能够代替抗生素的新型生物治疗制剂。0003在目前已有的生物制剂中，抗菌肽是一种广泛存在于自然界生物有机体内的小分子活性物质，通常由1545个氨基酸残基组成，可经诱导产生，作用于微生物细胞膜，使细胞膜穿孔，破坏细胞膜的完整性，导致细胞质外溢而达到杀菌的目的，具有高效、广谱及不产生耐药性等优势。迄今为止，人们已经从细菌、真菌、植物、动物中分离出了多种抗菌肽，由于不易产生耐药性，抗菌肽具有广阔的应用前景。0004LEAP2II型肝表达抗菌肽是近年来在脊椎动物中发现的一种新型抗菌肽，具有较强的抗微生物活性。。
8、LEAP2基因包含3个外显子和2个内含子，只有1个拷贝。通过放射性杂交图发现LEAP2基因位于5号染色体的长臂3区1带，编码由77个氨基酸残基组成的前体蛋白质，多分布于肝脏。LEAP2对多种细菌尤其是革兰氏阳性菌有很好的抑制和杀灭效果，具有很好的开发前景。0005TAP牛气管抗菌肽是从牛的气管黏膜上皮细胞中发现，也是第一个被发现的动物防御素，由38个氨基酸残基组成，含3对分子内二硫键，相对分子质量为43KD。牛防御素TAP对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、克雷伯肺炎杆菌、绿脓杆菌和念珠菌属等乳房炎病原菌有较强的抗菌活性。大量研究还表明，动物防御素在免疫调节、激素调节及刺激伤口愈合等方面也有重要作用。。
9、0006绵羊体内有两种动物防御素，SBD1和SBD2。SBD1存在于气管和整个消化道从舌到结肠中，含有6个保守的半胱氨酸残基，这6个半胱氨酸残基形成二硫键，有利于防御素保持稳定的结构，而且还是其抗微生物活性及细胞毒效应的主要结构。0007溶菌酶LYSOZYME又称胞壁质酶MURAMIDASE，是水解酶的一种，是一种无毒、无害的高盐基水解酶，广泛分布于动物、植物以及微生物中。溶菌酶通过裂解革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌细胞壁的多糖成分而将其破坏，从而具有杀灭多种病菌的作用。此外，溶菌酶的抗菌活性还表现在其他方面，例如，溶菌酶可以直接结合带有负电荷的病毒蛋白，与脱辅基蛋白、DNA以及RNA等形成复盐，。
10、从而使病毒失去活性。因此，溶菌酶以其独特的作用机理，为其在各个领域发挥其抗菌、抗病毒等活性奠定了基础。0008传统的制备抗菌肽的方法是组织器官提取法，如有机溶剂提取法、水浸提法和有机酸提取法等。这类方法存在着许多问题，如含量低导致提取效率低，杂质种类复杂导致纯度不理想，易失活导致提取后的活性不理想，严重制约了抗菌肽的开发和应用。，0009针对上述问题，近年来本领域尝试利用基因工程生产抗菌肽，迄今为止，抗菌肽已在原核表达系统、昆虫细胞表达系统、酵母表达系统得到了表达。但是在表达过程中发现，说明书CN104131021A2/5页4表达的抗菌肽对宿主细胞有毒性，而且对宿主本身的蛋白酶非常敏感导致降解。
11、，降低了抗菌肽的表达量。发明内容0010针对现有技术的缺陷，本发明公开了一种共表达载体，能够在同一宿主菌中同时稳定、高效表达多达四种抗菌肽，共表达多肽具有高效广谱抗菌和抗病毒活性，蛋白结构和天然抗菌肽保持一致，解决了融合表达时改变蛋白结构而影响抗菌肽活性及产量的问题。0011为实现上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的0012抗菌肽共表达载体，所述抗菌肽为四种，四种抗菌肽的编码基因分别两两连接到在同一宿主菌中同时表达的双表达载体PETDUET1、PRSFDUET1。0013本发明并不限定具体的抗菌肽类型，基于本发明所公开的构建方法，目前已有的具有良好生物活性的抗菌肽均可通过选择设计具有针对性。
12、的特异性引物将其连接到上述双表达载体中。0014优选的，所述抗菌肽为LEAP2、TAP、SBD1、LYSOZYME，所述抗菌肽的编码基因与双表达载体的连接关系为PETDUET1L2T和PRSFDUET1S1LY。0015本发明所用的载体PETDUET1、PRSFDUET1是双表达载体，每一个载体上有两个启动子，属于单一载体双启动子系统，每个编码基因都有独立的一个启动子，每个启动子独立驱动各个蛋白的表达。0016与传统的构建融合基因相比，本发明的双表达载体避免了基因之间的相互影响，保证了抗菌肽的稳定表达，克服了串联表达表达量不足的缺点，并且通过在同一宿主菌中表达的双质粒表达系统，PETDUET1。
13、和PRSFDUET1作为复制子相同不相容的两个质粒，在AMP和KANA两种抗生素存在的压力下子代菌能够有效存活，不会被抗生素杀死，从而可以同时转化进入同一宿主菌后有效的表达外源抗菌肽蛋白。0017为了便于规模化生产，降低培养难度，本发明所用的宿主菌为大肠杆菌，其培养简单，遗传背景清楚，可以采用发酵罐实现大规模、高密度发酵生产。0018常规的生物工程中所用的大肠杆菌均可用于本发明，包括但不限于大肠杆菌BL21，BL21DE3，和BL21DE3PLYSS等。0019相应的，本发明公开了上述抗菌肽共表达载体的构建方法，针对具体的抗菌肽，利用引物扩增抗菌肽的编码基因，通过酶切、连接、转化将四种抗菌肽的。
14、编码基因分别两两插入双表达载体PETDUET1、PRSFDUET1。0020本领域技术人员应该了解，针对不同的抗菌肽编码基因，根据抗菌肽编码基因以及共表达PETDUET1和PRSFDUET1的多克隆位点，即可利用引物合成软件PRIMER设计引物，扩增出各个抗菌肽基因，因此本发明的构建方法可以普遍适用于多种抗菌肽共表达载体的构建。0021具体的，针对本发明所公开的四种优选抗菌肽，构建方法包括下述步骤00221以抗菌肽LEAP2、TAP、SBD1、LYSOZYME编码基因作为PCR模版扩增出抗菌肽基因；00232使用ECORI、NOTI分别双酶切载体PETDUET1、PRSFDUET1；00243。
15、利用ECORI、NOTI分别双酶切LEAP2、SBD1抗菌肽的编码基因，将其与双酶切说明书CN104131021A3/5页5后的PETDUET1、PRSFDUET1载体连接得到表达载体；00254利用BGLII、XHOI双酶切步骤3得到的表达载体，使用BGLII、XHOI双酶切TAP、LYSOZYME抗菌肽的编码基因，分别与双酶切后的表达载体连接得到共表达载体。0026通过上述构建方法，实现了将携带四个抗菌肽基因的两个共表达载体转化进入同一个宿主菌，能够稳定、高效表达LEAP2、TAP、SBD1、LYSOZYME四种抗菌肽蛋白。0027其中，步骤1的编码基因即可从相关的生物制品公司和实验室购买。
16、成品或者合成，针对上述四种具体的抗菌肽，采用PCR扩增所用对应的引物序列如下0028LEAP2FCCGGAATTCATGACTCCATTTTGGAG含ECORI酶切位点0029LEAP2RATAGCGGCCGCTCATTCCTGGGCCACACT含NOTI酶切位点0030TAPFCGCAGATCTAATCCTGTAAGCTGTGTTA含BGLII酶切位点0031TAPRCCGCTCGAGACTTCTTTCTACAGCATAAAT含XHOI酶切位点0032SBD1F_CCGGAATTCCAAGGAGTAAGAAATCGTCTAAG含ECORI酶切位点0033SBD1RATAGCGGCCGCCTT。
17、CTTTCTGCAGCATTTTACT含NOTI酶切位点0034LYSOZYMEFCGCAGATCTAGGTCTTTGCTAATCTTGGTG含BGLII酶切位点0035LYSOZYMERCCGCTCGAGCAGCCGGCAGCCTCTGATCCA含XHOI酶切位点。0036PCR的条件和参数采用本领域常规实验条件即可。0037相应的，本发明还公开了上述共表达抗菌肽的表达方法，通过将共表达载体转化到同一宿主菌进行涂板，过夜培养，挑取单克隆菌落接种于LB培养基中，摇菌过夜，转接至新LB培养基中，加入IPTG进行诱导产生四种抗菌肽。0038其中，培养最终达到OD值0608，所用IPTG浓度为1MM。
18、/L。0039其中，所用的菌株采用适合于外源蛋白表达的菌株，优选的是BL21DE3、BL21DE3PLYSS等。附图说明0040图1为四种抗菌肽的编码基因扩增电泳图，其中M为10KMAKER，A为TAP抗菌肽的441BP编码基因、B为LYSOZYME抗菌肽编码基因441BP、C为SBD1抗菌肽编码基因174BP、D为LEAP2抗菌肽编码基因168BP；0041图2是四种共表达的抗菌肽的SDSPAGE图，M为MAKER，1是同时转入空质粒PETDUET1和PRSFDUET1的BL21DE3全细胞裂解物；2是同时转入PETDUET1L2T和PRSFDUET1S1LY共表达载体未加IPTG诱导的BL。
19、21DE3全细胞裂解物；3是同时转入PETDUET1L2T和PRSFDUET1S1LY共表达载体加入BL21DE3中经1MMIPTG诱导表达四个毒素蛋白4小时后的SDSPAGE图。具体实施方式0042在下述实施例中，申请人提供了一种具体的共表达载体构建和表达过程，并且详细描述了所用原料的来源，仅为示意，并非构成特别限定。本领域技术人员采用符合公知定义的相关原料和实验条件也可实现本发明的发明目的。0043在下述实施中，所用原料来源如下0044LEAP2、TAP、SBD1、LYSOZYME四种抗菌肽的编码基因来自于GENBANK数据库，说明书CN104131021A4/5页6LEAP2编号为Q95。
20、JB4、TAP编号为AF0141061、SBD1编号为U752501、LYSOZYME编号为V004281。0045PETDUET1和PRSFDUET1双表达载体购自NOVAGEN公司。0046表达菌BL21DE3购自北京全式金生物技术有限公司。0047所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。0048限制性内切酶BGLII、ECORI、NOTI、XHOI，T4DNA连接酶和2POWERTAQPCRMASTERMIX均购自大连宝生物有限公司；IPT6、SDS十二烷基磺酸钠、核酸MARKER、AGAROSEDNAEXTRACTIONKIT、DNA快速纯化回收试剂盒、质粒快速提取试剂盒均购自大连宝生。
21、物工程公司；细菌基因组提取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司合成；琼脂糖购自INVITROGEN公司；预染蛋白MARKER购自FERMENTAS公司。0049实施例1抗菌肽共表达载体的构建00501LEAP2、TAP、SBD1、LYSOZYME编码基因的扩增0051利用引物，扩增抗菌肽LEAP2、TAP、SBD1、LYSOZYME编码基因，得到各个抗菌肽基因。0052PCR反应体系50LMASTERMIX，上下游引物各2L，模版16L，去离子水30L；DNA胶回收试剂盒回收四个抗菌肽编码基因；00532PETDUET1L2和PRSFDUET1S1载体的构建0054将PETDUET1、PRSFD。
22、UET1两个载体进行ECORI、NOTI双酶切。005540L酶切体系10H缓冲液4L，ECORI、NOTI各1L，载体24L，去离子水10L。0056酶切产物1琼脂糖电泳后胶回收试剂盒回收；0057然后用ECORI、NOTI双酶切的LEAP2、SBD1基因。005840L酶切体系10H缓冲液4L，ECORI、NOTI各1L，目的基因24L，去离子水10L。0059酶切产物1琼脂糖电泳后胶回收试剂盒回收，然后分别与双酶切的PETDUET1、PRSFDUET1的载体连接，构建两个连接体系006010T4DNALIGASEBUFFER25L，LEAP2编码基因胶回收产物14L，PETDUET12L。
23、，T4DNALIGASELL，去离子水55L；006110T4DNALIGASEBUFFER25L，SBD1编码基因胶回收产物14L，PRSFDUET12L，T4DNALIGASELL，去离子水55L。006216连接过夜，分别转化TRANS109态细胞，挑取单克隆菌落分别进行菌液PCR鉴定、酶切鉴定、菌液测序确定LEAP2、SBD1分别连接到PETDUET1L2和PRSFDUET1S1载体上；00633PETDUET1L2T和PRSFDUET1S1LY载体的构建0064PETDUET1L2和PRSFDUET1S1进行BGLII、XHOI双酶切。006540L酶切体系10H缓冲液4L，BGLI。
24、I、XHOI各1L，载体24L，去离子水10L，酶切产物1琼脂糖电泳后胶回收试剂盒回收。0066BGLII、XHOI双酶切的TAP、LYSOZYME编码基因。006740L酶切体系10H缓冲液4L，ECORI、PSTI各1L，目的基因24L，去离说明书CN104131021A5/5页7子水10L，酶切产物1琼脂糖电泳后胶回收试剂盒回收，然后构建两个链接体系006810T4DNALIGASEBUFFER25L，TAP编码基因胶回收产物14L，PETDUET1L22L，T4DNALIGASELL，去离子水55L；006910T4DNALIGASEBUFFER25L，LYSOZYME编码基因胶回收产。
25、物14L，PRSFDUET1S12L，T4DNALIGASELL，去离子水55L。007016连接过夜，分别转化TRANS109态细胞，挑取单克隆菌落分别进行菌液PCR鉴定、酶切鉴定、菌液测序确定TAP、LYSOZYME分别连接到PETDUET1L2和PRSFDUET1S1载体上。0071实施例2LEAP2、TAP、SBD1、LYSOZYME四种抗菌肽共表达载体的共表达0072PETDUET1L2T和PRSFDUET1S1LY各05L质粒同时转化BL21DE3宿主菌，挑取单克隆菌落接种于新鲜10MLLB培养基中，摇菌过夜，按1100比例转接新鲜10MLLB培养基中，OD值达0608时取1ML菌。
26、液作为未诱导样品，然后加入终浓度10MM的10LIPTG诱导表达四小时收取1ML菌液样品；0073在上述共表达完成后，对所表达获得的LEAP2、TAP、SBD1、LYSOZYME四种抗菌肽进行了SDSPAGE检测。0074其中，所配制的SDSPAGE溶液组成如下0075TRIS甘氨酸缓冲液25MMOL/LTRIS、250MMOL/L甘氨酸PH80、01SDS。00762SDS上样BUFFER100MMOL/LTRISC1PH80、200MMOL/L巯基乙醇、4SDS、02溴酚蓝、20甘油。0077考马斯亮蓝染色液45ML甲醇、45ML水、10ML冰醋酸中溶解025G考马斯亮蓝R250。0078。
27、脱色液30甲醇、10冰乙酸，蒸馏水补体积至100ML。0079SDSPAGE检测过程为00801洗净玻璃板，固定在电泳槽上，用20琼脂糖封边。按分子克隆的配方配制15的分离胶5ML，迅速注入两玻璃板之间，胶顶覆盖1ML双蒸水。待分离胶凝固后倾出覆盖层液体，用去离子水冲洗凝胶顶部数次，倒置空干液体，加入2ML5的浓缩胶溶液，插上梳子，垂直放置电泳槽使其凝固。00812小心移去梳子，在电泳装置上、下槽间加入TRIS甘氨酸缓冲液，用注射器冲洗加样孔数次，将电源负极与上槽相连。00823收集的菌液12000RPM离心2MIN，用50LPH74的PBS悬浮，加入等体积的2SDS上样BUFFER，混匀，水。
28、浴煮沸10MIN，用微量进样器上样101，打开电源，用80V电压电泳至溴酚蓝进入分离胶，把电压提高到120V，继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。00834染色取下凝胶用蒸馏水冲洗，用5倍凝胶体积的考马斯亮蓝染色液浸泡凝胶，放在脱色摇床上室温染色3H。00845脱色用30甲醇、10冰乙酸的混合液，在脱色摇床上脱色过夜，其间更换染色液34次。待蓝色背景完全脱净后，将凝胶浸入蒸馏水中终止脱色。0085参考附图2所示，显示本发明的共表达载体成功实现了四种抗菌肽的共表达，其中TAP53KDA、LEAP261KDA、SBD164KDA、LYSOZYME16KDA。说明书CN104131021A1/2页800010002序列表CN104131021A2/2页9序列表CN104131021A1/1页10图1图2说明书附图CN104131021A10。