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1、(10)申请公布号 CN 102265830 A (43)申请公布日 2011.12.07 CN 102265830 A *CN102265830A* (21)申请号 201110160947.5 (22)申请日 2011.06.15 A01N 43/16(2006.01) A01P 1/00(2006.01) (71)申请人 北京市农林科学院 地址 100097 北京市海淀区曙光花园中路 9 号 (72)发明人 周莹 李兴红 燕继晔 严红 (74)专利代理机构 北京众合诚成知识产权代理 有限公司 11246 代理人 胡长远 (54) 发明名称 裂褶菌多糖在防治烟草花叶病毒病上的应用 (57)。
2、 摘要 本发明公开了属于生物农药领域的一种裂褶 菌多糖提取物及其制备方法， 按照比例将裂褶菌 菌丝粉加入到热水中， 在100水浴中浸提810 小时， 用纱布过滤， 所得滤渣在按照相同方法再浸 提一次， 合并两次滤液， 真空浓缩， 再与 5 倍体积 的 95乙醇混合， 于 4下静置过夜， 离心， 将沉 淀用乙醇洗涤 2 次， 60烘干即可。本发明还公 开了裂褶菌多糖提取物在防治烟草花叶病毒病上 的用途。本发明裂褶菌多糖提取物对烟草花叶病 毒防治效果好， 对烟草花叶病毒的抑制率可达到 70以上， 为烟草花叶病毒病的防治提供了一种 新的途径 ； 其次， 本发明为天然提取物， 对人类和 环境无害 ； 。
3、此外， 本发明制备方法简单， 成本低。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 CN 102265833 A1/1 页 2 1. 一种裂褶菌多糖提取物， 其特征在于按照如下方法制备 ： (1) 按照裂褶菌菌丝粉和水之间 1g 10-20mL 的比例将裂褶菌菌丝粉加入到 90以 上的热水中， 然后在 100水浴中浸提 8 10 小时， 再用二层纱布过滤， 得到滤液和滤渣 ； (2) 按照滤渣和水之间 1g 10-20mL 的比例将步骤 (1) 所得滤渣加入到 90以上的 热水中， 然后在 100水浴中浸提 8 10 。
4、小时， 再用二层纱布过滤， 收集滤液 ； (3) 合并步骤 (1) 和步骤 (2) 所得滤液， 真空浓缩至原体积的 1/20 1/50， 再与 5 倍 体积的 95乙醇混合均匀， 于 4下静置过夜， 5000rpm 下离心 10min， 倒掉上清液， 沉淀为 白色纤维状 ； 将所得沉淀用 75乙醇洗涤 2 次， 60烘干至恒重， 即得裂褶菌多糖提取物。 2. 权利要求 1 所述的裂褶菌多糖提取物的制备方法， 其特征在于按照如下步骤进行 ： (1) 按照裂褶菌菌丝粉和水之间 1g 10-20mL 的比例将裂褶菌菌丝粉加入到 90以 上的热水中， 然后在 100水浴中浸提 8 10 小时， 再用二。
5、层纱布过滤， 得到滤液和滤渣 ； (2) 按照滤渣和水之间 1g 10-20mL 的比例将步骤 (1) 所得滤渣加入到 90以上的 热水中， 然后在 100水浴中浸提 8 10 小时， 再用二层纱布过滤， 收集滤液 ； (3) 合并步骤 (1) 和步骤 (2) 所得滤液， 真空浓缩至原体积的 1/20 1/50， 再与 5 倍 体积的 95乙醇混合均匀， 于 4下静置过夜， 5000rpm 下离心 10min， 倒掉上清液， 沉淀为 白色纤维状 ； 将所得沉淀用 75乙醇洗涤 2 次， 60烘干至恒重， 即得裂褶菌多糖提取物。 3. 权利要求 1 所述的裂褶菌多糖提取物在防治烟草花叶病毒病上的。
6、应用。 权 利 要 求 书 CN 102265830 A CN 102265833 A1/4 页 3 裂褶菌多糖在防治烟草花叶病毒病上的应用 技术领域 0001 本发明属于植物病害防治领域， 具体地说涉及裂褶菌多糖提取物在防治烟草花叶 病毒病上的用途。 背景技术 0002 烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus， TMV)能侵染茄科、 葫芦科、 十字花科等300 多种植物， 是危害严重的病毒之一。防治烟草花叶病毒病的主要方法是培育抗病品种和化 学药剂， 育种手段由于抗病基因来源少而受到限制， 化学药剂对烟草花叶病毒病的防治不 仅效果不理想， 而且会造成环境污染， 因而其应用也受。
7、到限制。因此， 环境损害小且抗病毒 活性高的植物源农药成为研究的热点。 0003 裂褶菌(Schizophyllum commune Fr.)又称白参、 树花， 属于真菌门， 担子菌亚门、 层菌纲、 非褶菌目、 裂褶菌科、 裂褶菌属。具有较高营养和药用价值。裂褶菌广布于世界各 地， 我国大部分地区都有分布。 裂褶菌多糖具有抗癌、 抗菌等多种生理活性， 如专利申请 具 有抗癌效果的蘑菇多糖体组合物及其制备方法 ( 公开号 ： CN101766644A) 公开了包括裂褶 菌多糖在内几种蘑菇多糖组合物具有提高免疫活性和促进细胞因子的作用 ；免疫刺激剂 ( 公开号 ： CN1798563A) 公开了裂。
8、褶菌多糖在内的多糖复合体作为免疫刺激剂的用途。 0004 经检索， 裂褶菌多糖主要应用于人的医学领域， 在抗植物病毒方面的应用尚未见 报道。 发明内容 0005 本发明目的在于提供一种用于裂褶菌多糖提取物。 0006 本发明另一目的在于提供上述裂褶菌多糖提取物的制备方法。 0007 本发明第三目的在于提供上述裂褶菌多糖提取物在防治烟草花叶病毒病上的用 途。 0008 为实现上述目的， 本发明的技术方案如下 ： 0009 一种裂褶菌多糖提取物， 按照如下方法制备 ： 0010 (1) 按照裂褶菌菌丝粉和水之间 1g 10-20mL 的比例将裂褶菌菌丝粉加入到 90以上的热水中， 然后在 100水。
9、浴中浸提 8 10 小时， 再用二层纱布过滤， 得到滤液和 滤渣 ； 0011 (2) 按照滤渣和水之间 1g 10-20mL 的比例将步骤 (1) 所得滤渣加入到 90以 上的热水中， 然后在 100水浴中浸提 8 10 小时， 再用二层纱布过滤， 收集滤液 ； 0012 (3) 合并步骤 (1) 和步骤 (2) 所得滤液， 真空浓缩至原体积的 1/20 1/50， 再与 5 倍体积的 95乙醇混合均匀， 于 4下静置过夜， 5000rpm 下离心 10min， 倒掉上清液， 沉 淀为白色纤维状 ； 将所得沉淀用 75乙醇洗涤 2 次， 60烘干至恒重， 即得裂褶菌多糖提取 物。 0013 。
10、上述裂褶菌多糖提取物的制备方法， 按照如下步骤进行 ： 说 明 书 CN 102265830 A CN 102265833 A2/4 页 4 0014 (1) 按照裂褶菌菌丝粉和水之间 1g 10-20mL 的比例将裂褶菌菌丝粉加入到 90以上的热水中， 然后在 100水浴中浸提 8 10 小时， 再用二层纱布过滤， 得到滤液和 滤渣 ； 0015 (2) 按照滤渣和水之间 1g 10-20mL 的比例将步骤 (1) 所得滤渣加入到 90以 上的热水中， 然后在 100水浴中浸提 8 10 小时， 再用二层纱布过滤， 收集滤液 ； 0016 (3) 合并步骤 (1) 和步骤 (2) 所得滤液，。
11、 真空浓缩至原体积的 1/20 1/50， 再与 5 倍体积的 95乙醇混合均匀， 于 4下静置过夜， 5000rpm 下离心 10min， 倒掉上清液， 沉 淀为白色纤维状 ； 将所得沉淀用 75乙醇洗涤 2 次， 60烘干至恒重， 即得裂褶菌多糖提取 物。 0017 裂褶菌菌丝粉可通过将裂褶菌烘干、 粉碎、 过 60 目筛而得， 裂褶菌可于市场上购 买。 0018 上述裂褶菌多糖提取物在防治烟草花叶病毒病上的应用。 0019 本发明裂褶菌多糖提取物的使用方法， 将裂褶菌多糖提取物用水稀释成浓度为 0.2mg/mL 的溶液， 喷施于 3 5 叶期的烟草或辣椒等植物的叶片上。 0020 本发明。
12、具有的优点 ： (1) 本发明裂褶菌多糖提取物对烟草花叶病毒防治效果好， 在喷施烟草 72 小时后， 接种烟草花叶病毒， 对烟草花叶病毒的抑制率可达到 70以上， 为 烟草花叶病毒病的防治提供了一种新的途径 ； (2) 本发明裂褶菌多糖提取物属于天然提取 物， 对人类和环境无害， 属于环境友好的生物农药 ； (3) 本发明裂褶菌多糖提取物制备方法 简单， 成本低。 具体实施方式 0021 实施例 1 裂褶菌的培养和菌丝粉的制备 0022 按照如下方法进行 ： 0023 (1) 母种活化 ： 将裂褶菌母种转接在 PDA 固体培养基 (PDA 固体培养基的组成成分 及其重量百分比为 ： 马铃薯淀粉。
13、 20、 葡萄糖 20、 琼脂 20、 其余为水 ) 上活化， 在 28 培养 10 天 ； 0024 (2) 一级菌种制备 ： 将步骤 (1) 得到的平板菌丝切成小于 1mm 的小块， 按照 0.5g 菌丝 /100ml 的接种量将裂褶菌菌丝转入装有 100ml 液体发酵培养基 ( 液体发酵培养基的 组成成份及其重量百分比为 ： 可溶性淀粉 4、 葡萄糖 4、 小麦粉 2、 玉米粉 2、 酵母膏 0.3、 黄豆粉 0.5、 蛋白胨 0.2、 KH2PO41、 MgSO40.5、 VB10.01， 其余为水 ) 的 500ml 摇瓶中， 于 28、 240rpm/min 条件下进行发酵培养 5。
14、 天， 获得一级菌种。 0025 (3) 发酵培养 ： 按照体积百分比为 10的接种量将步骤 (2) 得到的一级菌种培养 液接种到装有 100ml 步骤 (2) 所述液体发酵培养基的 500ml 摇瓶中， 于 28、 240rpm/min 条件下进行发酵培养 6 天， 抽滤、 收集裂褶菌菌丝， 烘干、 粉碎， 过 60 目筛， 得到裂褶菌菌丝 粉。 0026 实施例 2 裂褶菌多糖提取物的制备 0027 按照如下方法进行 ： 0028 (1) 将裂褶菌菌丝粉 10g 加入到 100mL 98的热水中， 在 100水浴中浸提 8 小 时， 过滤得到滤液和滤渣 ； 说 明 书 CN 1022658。
15、30 A CN 102265833 A3/4 页 5 0029 (2) 将步骤 (1) 所得滤渣加入到 100mL 98的热水中， 在 100水浴中浸提 8 小 时， 过滤， 收集滤液 ； 0030 (3) 合并步骤 (1) 和 (2) 的 2 次滤液， 真空浓缩至 5mL， 与 25mL 体积 95乙醇充分 混合， 4下静置过夜， 5000rpm 离心 10min， 倒掉上清液， 沉淀为白色纤维状， 用 75乙醇洗 涤沉淀 2 次， 60烘干至恒重， 称重为 1.12g。 0031 多糖含量的测定 ： 恩酮 - 硫酸测定法 0032 配制试剂 ： 0033 葡萄糖标准液 ： 100ug/mL。
16、( 葡糖糖粉末需 80 度烘干至恒重后配制 )， 容量瓶定容。 0034 蒽酮试剂 ： 0.2g 蒽酮溶于 100mL 浓 H2SO4中， 棕色容量瓶定容。当日配制使用。 0035 制作标准曲线 0036 分别吸取浓度为100ug/mL葡萄糖标准液0， 1.0， 2.0， 3.0， 4.0， 5.0mL， 置于50mL 容量瓶中， 蒸馏水定容至刻度， 精确吸取上述标准溶液各 1.0mL 置于具塞试管中， 于冰水浴 中加入蒽酮试剂 4.0mL， 摇匀， 放置 5min 后， 置于沸水浴中加热 10min， 用冰浴冷却至室温， 在 620nm 波长下， 以第一管为空白， 迅速测其余各管吸光值。以标。
17、准葡萄糖浓度 (ug/mL) 为 横坐标， 以吸光值为纵坐标， 作出标准曲线。 0037 供试液的制备及测定方法 0038 将烘干的多糖用适量的水溶解， 每个样品平行取三份样液各 3mL， 按 sevag 法 ( 氯 仿正丁醇 5 1) 除蛋白后转入 50mL 容量瓶中定容， 即得供试液三份， 空白管以等量蒸 馏水取代提取液。吸取 1mL 已稀释的提取液于试管中， 按制作标准曲线的方法测定吸光值， 根据A620平均值在标准曲线上查出多糖的浓度(ug/mL)， 再换算出样品中多糖的质量(g)。 0039 结果通过恩酮 - 硫酸测定法制作的标准曲线计算出本试验样品中多糖含量为 0.342g。 00。
18、40 实施例 3 裂褶菌多糖提取物的制备 0041 按照如下方法进行 ： 0042 (1) 将裂褶菌菌丝粉 12g 加入到 180mL 95的热水中， 在 100水浴中浸提 9 小 时， 过滤， 得到滤液和滤渣 ； 0043 (2) 将步骤 (1) 所得滤渣加入到 180mL 95的热水中， 在 100水浴中浸提 9 小 时， 过滤， 收集滤液 ； 0044 (3) 合并步骤 (1) 和 (2) 的 2 次滤液， 真空浓缩至 6mL， 滤液与 30mL95乙醇充分 混合， 4下静置过夜， 5000rpm 离心 10min， 倒掉上清液， 沉淀为白色纤维状粗多糖， 用 75 乙醇洗涤 2 次， 。
19、60烘干至恒重， 称重为 1.41g。通过恩酮 - 硫酸测定法制作的标准曲线计 算出样品中多糖含量为 0.452g。 0045 实施例 4 裂褶菌多糖提取物的制备 0046 按照如下方法进行 ： 0047 (1) 将裂褶菌菌丝粉 15g 加入到 300mL 90以上的热水中， 在 100水浴中浸提 10 小时， 过滤， 得到滤液和滤渣 ； 0048 (2)将步骤(1)中所得滤渣加入到300mL 90以上的热水中， 在100水浴中浸提 10 小时， 过滤， 收集滤液 ； 0049 (3) 合并步骤 (1) 和 (2) 的 2 次滤液， 真空浓缩至 6mL， 滤液与 30mL95乙醇充分 说 明 。
20、书 CN 102265830 A CN 102265833 A4/4 页 6 混合， 4下静置过夜， 5000rpm 离心 10min， 倒掉上清液， 沉淀为白色纤维状， 用 75乙醇洗 涤沉淀 2 次， 60烘干至恒重， 称重为 1.75g。通过恩酮 - 硫酸测定法制作的标准曲线计算 出多样品中多糖含量为 0.570g。 0050 实施例 5 裂褶菌多糖提取物抗烟草花叶病毒活性试验 0051 按照如下方法进行 ： 0052 (1) 喷雾处理 ： 将实施例 2、 3、 4 中得到的裂褶菌多糖提取物分别用水稀释得到 浓度为 0.2mg/mL 的溶液， 然后分别对三至四叶期的枯斑三生烟进行整株喷雾。
21、， 设三个重 复， 每个重复三株， 每株三片叶子 ； 同时用清水喷施于三至四叶期的枯斑三生烟作为对照 (CK)， 设置三个重复， 每个重复三株， 每株三片叶子。 0053 (2) 病毒接种液的制备 ： 病毒来源为北京市农林科学院植物与环境保护研究所植 病综防研究室保存的 TMV 普通株系 ( 以普通烟为繁殖寄主， 活体保存 )， 将感染烟草花叶病 毒 TMV 普通株系的普通烟的叶片去除主脉， 与 pH8.0 的 0.01mol/L PBS 按 1g/20mL 混合， 每 20mL PBS 加 0.015g 金刚砂， 将叶片充分研磨， 得到接种液。 0054 (3) 接种 ： 按步骤 (1) 的。
22、方法喷雾处理枯斑三生烟植株 72 小时后， 用步骤 (2) 得 到的接种液进行汁液摩擦接种 ( 植病研究方法 ( 第三版 )， 方中达， 中国农业出版社 ) 接种 后立即用清水冲洗， 于防虫温室中培养， 培养条件为28光照12小时， 18无光照12小时， 交替进行。 0055 (4) 枯斑抑制率计算 ： 接种 72 小时后调查枯斑三生烟叶片产生枯斑数量， 枯斑抑 制率计算公式 ： 0056 X( ) (CK-Y)/CK100( 式 I) 0057 式 I 中， X 为枯斑抑制率 ； CK 为清水对照叶片的平均枯斑数， 单位 ： 个 ； Y 为经裂褶 菌多糖提取物诱导处理后叶片的平均枯斑数， 单位 ： 个。 0058 表 1 裂褶菌多糖提取物抗烟草花叶病毒活性试验结果 0059 0060 结果 ( 见表 1) 实施例 2、 3、 4 所得的裂褶菌多糖提取物处理过的烟草对烟草花叶 病毒的抑制率均在 70以上， 说明裂褶菌多糖提取物能够诱导烟草对烟草花叶病毒产生抗 性。 说 明 书 CN 102265830 A 。