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1、(10)授权公告号 CN 101940178 B (45)授权公告日 2012.05.09 CN 101940178 B *CN101940178B* (21)申请号 201010269159.5 (22)申请日 2010.08.31 A01K 61/00(2006.01) (73)专利权人 厦门大学 地址 361005 福建省厦门市思明南路 422 号 (72)发明人 王德祥 梁翠 黄建荣 虞晋晋 柯才焕 (74)专利代理机构 厦门南强之路专利事务所 35200 代理人 马应森 戴深峻 CN 1317945 C,2007.05.30, 全文 . Mary Smiddy et alGreate。
2、r high-pressure resistance of bacteria in oysters than in buffer. Innovative Food Science and Emerging Technologies .2005,( 第 6 期 ),83-90. 陈晓汉等 . 静水压休克诱导近江牡蛎三倍体 的发生 .广西科学 .1994, 第 1 卷 ( 第 1 期 ), 第 47-52 页 . 朱传忠等 . 鱼类多倍体育种技术及其在水产 养殖中的应用 .淡水渔业 .2004, 第 34 卷 ( 第 3 期 ), 第 53-56 页 . DANIEL L. BERLIN et a。
3、l.Response of Pathogenic Vibrio Species to High. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY .1999, 第 65 卷 ( 第 6 期 ),27762780. (54) 发明名称 高静水压处理提高牡蛎成活率的方法 (57) 摘要 高静水压处理提高牡蛎成活率的方法， 涉及 一种水产动物的育苗方法。用静水压处理牡蛎胚 胎， 所述静水压的压力为1040MPa， 所述用静水 压处理牡蛎胚胎的时间为 10 50min， 所述牡蛎 胚胎可为牡蛎胚胎中至少有 50的牡蛎受精卵 发育至囊胚期。所述用高静水压处理牡蛎胚胎之 前，。
4、 先用筛网将所述牡蛎胚胎进行过滤浓缩， 浓缩 后的牡蛎胚胎浓度可 100 个 /mL。所述用于浓 缩牡蛎胚胎的筛网的孔径可为 25 60m。其对 象、 原理和方法等方面均与现有的方法有显著区 别。 处理后的牡蛎胚胎成活率显著升高， 能够极大 地提高牡蛎的养殖成功率， 具有良好的应用前景。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 韦晓磊 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 CN 101940178 B1/1 页 2 1. 高静水压处理提高牡蛎成活率的方法， 其特征在于 ： 用高静水压处理牡蛎胚胎， 静 水压力为 10 40MPa，。
5、 处理开始时刻为至少 50的牡蛎受精卵发育至囊胚期， 处理持续时 间为 10 50min。 2. 如权利要求 1 所述的高静水压处理提高牡蛎成活率的方法， 其特征在于 ： 所述用高 静水压处理牡蛎胚胎之前， 先用筛网将所述牡蛎胚胎进行过滤浓缩。 3. 如权利要求 2 所述的高静水压处理提高牡蛎成活率的方法， 其特征在于 ： 所述过滤 浓缩后的牡蛎胚胎浓度 100 个 /mL。 4. 如权利要求 2 所述的高静水压处理提高牡蛎成活率的方法， 其特征在于 ： 所述筛网 的孔径为 25 60m。 5. 如权利要求 1 所述的高静水压处理提高牡蛎成活率的方法， 其特征在于 ： 所述牡蛎 胚胎通过如下步。
6、骤获得 ： 1) 挑选性腺饱满的牡蛎亲贝， 用显微镜区别雌雄亲本 ； 2) 采用人工授精的方法获得精子和卵子， 混合精子和卵子， 获得受精卵 ； 3) 将受精卵置于正常孵化条件下进行孵化， 处理开始时刻为牡蛎胚胎中至少有 50 的牡蛎受精卵发育至囊胚期。 6. 如权利要求 5 所述的高静水压处理提高牡蛎成活率的方法， 其特征在于 ： 步骤 2) 中 所述精子与卵子的比例为 10 1。 7. 如权利要求 5 所述的高静水压处理提高牡蛎成活率的方法， 其特征在于 ： 步骤 3) 中 的正常孵化条件为 ： 受精卵置于沙滤海水中， 每个充气头以 1L/min 的出气量往所述沙滤 海水中充入空气， 在 。
7、25水温的条件下， 培养 22h。 权 利 要 求 书 CN 101940178 B1/4 页 3 高静水压处理提高牡蛎成活率的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种水产动物的育苗方法， 特别涉及利用高静水压处理提高牡蛎幼体 成活率的方法。 背景技术 0002 静水压 (hydrostatic pressure) 是自然界中一个常见的物理参数， 生活在水生 环境中的生物或多或少都受静水压的影响， 但只有深海生物才时刻处于高静水压 (high hydrostatic pressure， HHP) 之中。高静水压是指压力在 10MPa 以上的静水环境， 它相当 于1000m水深所产生的压强。 地。
8、球表面有50以上的面积都是被水深超过1000m的海洋所 覆盖， 其中生活着大量耐受高静水压的生物类群。静水压是影响海洋生物垂直分布区系的 重要环境因子， 其重要性仅次于温度。 0003 目前， 有关高静水压的研究主要集中在食品保鲜工业方面， 其工作原理是运用超 高静水压(压力大于150MPa)将食品中的细菌、 病毒等灭活， 由于这是一个非热源的灭菌过 程， 它不会使食品中的风味蛋白质等变性， 因此最大限度的保留食品原有的风味。运用高 静水压灭活食品中的微生物， 其压力往往在 100MPa 以上， 最常用的压力约为 200MPa。高静 水压的另一个运用领域是将植物或细菌的种子在萌发之前用高静水压。
9、处理， 以期获得生长 快， 抗逆性好的后代。 虽然有文献将高静水压处理植物或菌类的种子描述成一个 “诱导突变 的过程” ( 王岁楼， 吴晓宗， 段旭昌， 孙君社， 鸡腿菇漆酶产生菌的高静水压诱变研究， 食品科 技， 2006， 6 ： 29-32 ； )， 但更多的研究认为该过程可重复， 不属于诱变的过程， 而是诱导新的 代谢途径的过程 (Xuncheng Liu， Mei Zhang， Jun Duan and Keqiang Wu.Gene expression analysis ofgerminating rice seeds responding to high hydrostatic。
10、 pressure. Journal of PlantPhysiology， 2008， 165(18) ： 1855-1864 ； Naparat Prapaiwonga， Richard K.Wallacea and CovadongaR.Arias， Bacterial loads and microbial composition in high pressure treated oysters during storage.International Journal of Food Microbiology， 2009， 131(2-3) ： 145-150)。目前将高静水压运用于提。
11、高生物种植或养殖成 活率的研究仅见于植物的种子、 细菌以及猪牛精子的冷冻保存方面， 未见有将此技术运用 于提高水生动物养殖成活率的研究。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种高静水压处理提高牡蛎成活率的方法。 0005 本发明的具体步骤如下 ： 用静水压处理牡蛎胚胎， 所述静水压的压力为 10 40MPa， 所述用静水压处理牡蛎胚胎的时间为 10 50min， 所述牡蛎胚胎可为牡蛎胚胎中至 少有 50的牡蛎受精卵发育至囊胚期。 0006 所述静水压的压力最好为 10MPa， 所述用静水压处理牡蛎胚胎的时间最好为 50min， 所述处理的开始时刻为牡蛎胚胎中 50的牡蛎受精卵发育至面盘幼。
12、虫， 0007 所述用高静水压处理牡蛎胚胎之前， 最好先用筛网将所述牡蛎胚胎进行过滤浓 说 明 书 CN 101940178 B2/4 页 4 缩， 浓缩后的牡蛎胚胎浓度可 100 个 /mL。 0008 所述用于浓缩牡蛎胚胎的筛网的孔径可为 25 60m。 0009 所述牡蛎胚胎可以通过如下步骤获得 ： 0010 1) 挑选性腺饱满的牡蛎亲贝， 用显微镜区别雌雄亲本 ； 0011 2) 采用人工授精的方法获得精子和卵子， 混合精子和卵子， 获得受精卵 ； 0012 3) 将受精卵置于正常孵化条件下进行孵化， 处理开始时刻为牡蛎胚胎中至少有 50的牡蛎受精卵发育至囊胚期。 0013 根据不同牡。
13、蛎胚胎的生长特性， 选择不同的孵化条件， 优选的孵化条件为 ： 受精卵 置于沙滤海水中， 每个充气头以 1L/min 的出气量往所述沙滤海水中充入空气， 在 25水 温的条件下， 培养 22h。 0014 本发明与已有的研究存在明显的差异， 具体如下 ： 0015 与植物的种子、 细菌、 以及猪牛等家畜的精子相比， 牡蛎胚胎具有显著的特殊性。 首先， 牡蛎胚胎是动物， 而水稻、 灵芝等属于植物或真菌， 植物的种子可以在离水的条件下 存活相当长的时间， 它们在结构和成份上与牡蛎胚胎有很大的区别 ； 其次， 植物、 真菌等配 子的有效作用压力一般在 80MPa 左右， 而牡蛎胚胎的有效作用压力在 。
14、20MPa 左右 ； 第三， 在 自然条件下， 陆生的植物、 真菌等的种子没有机会接触到高静水压的条件， 即使偶尔被海流 带入深海， 仍然没成活的可能， 而体外受精水生动物的胚胎(如牡蛎等)一般能在海里浮游 几天至数周， 甚至一年多 ( 如锦绣龙虾 )， 被海流带入深海再回到浅海的可能性很高， 高静 水压对于牡蛎胚胎而言， 并非特别特殊的人工条件。 因此， 牡蛎胚胎与陆生植物的巨大区别 决定了它们之间采用高静水压技术时方法上的显著区别。 0016 与牡蛎诱导三倍体或四倍体的目的不同， 本发明中的高静水压处理牡蛎胚胎的目 的是抑制其体内某些正常代谢通路， 从而启动生物体内的代谢补偿通路， 实现提。
15、高抗逆性 或者提高产率的目的。 而牡蛎三倍体或四倍体的诱导， 其目的在于使染色体组加倍， 获得不 育的后代实现增产的目的。 0017 不同的原理与目的必然有不同的处理方法。牡蛎三倍体或四倍体的 “开始处理时 刻” 必须在受精卵排出第一极体或者第一次卵裂的时候进行休克处理 ( 包括冷休克、 热休 克、 压力休克、 药物休克等 )， 此过程一般需要在受精后 30min 内完成， 而本发明所述方法的 “开始处理时刻” 一般在受精后 5h 以上， 甚至在受精后 36h。 0018 综上所述， 本发明在实验对象、 实验原理、 实验方法等方面均与现有的研究有显著 区别。本发明所述方法处理后的牡蛎胚胎成活率。
16、显著升高， 能够极大地提高牡蛎的养殖成 功率， 具有良好的应用前景。 具体实施方式 0019 本发明以中国东南沿海养殖量最大的僧帽牡蛎为研究对象， 设计了 3 因素 3 水平 的正交实验， 用于探究静水压对于牡蛎胚胎发育的影响。 3个实验因子及3个实验水平分别 是 ： 胚胎发育阶段 ( 即受精后开始进行高静水压处理的时刻， 对应的 3 个水平分别是 ： 50 的胚胎发育至囊胚期、 50的胚胎发育至单轮幼虫、 或 50的胚胎发育至面盘幼虫时期 ) ； 静水压的持续时间 ( 分别是 10、 30、 50min) ； 静水压强的大小 ( 分别是 10、 20、 40MPa)。以牡 蛎受精后第 15 。
17、天的成活率为指标， 分析了 9 个实验组牡蛎胚胎的成活率。由于活的胚胎是 说 明 书 CN 101940178 B3/4 页 5 悬浮的， 死亡的个体是沉淀的。牡蛎成活率的检测方法为 ： 用 1mL 的玻璃移液管吸取 1mL 养 殖水， 在透光的条件下计算其中的牡蛎幼体数量， 3 次平均获得的每 mL 养殖水中牡蛎幼体 数量与最开始时刻 ( 未处理前 ) 的每毫升养殖水中牡蛎幼体数量的比值就是成活率。 0020 结果显示， 静水压的大小是影响僧帽牡蛎成活率的关键因素， 其次是静水压持续 时间， 不同胚胎发育阶段对于牡蛎成活率的影响最小。最佳的实验组合是 ： 当 50的胚胎 发育至面盘幼虫时， 。
18、采用 10MPa 的静水压处理 50min， 能够获得最高的成活率。60L 养殖水 体中培养 15 天的相对成活率 (42.7 ) 显著高于对照组 (1.9 )。胚胎染色体的制片以及 倍性分析仪分析结果显示， 各实验组均未发现三倍体或者多倍体的胚胎 ( 表 1)。 0021 表 1 染色体众数观察记录表 0022 二倍体 18 19 20 21 对照组 2 1 23 4 实验组 ( 实施例 1) 4 2 18 3 0023 从表 1 可以看出， 对照组染色体数为 20 的中期分裂相检测到 23 个， 明显多于染色 体数为 18、 19、 21 的中期分裂相， 对应的数量为 2、 1、 4 ； 。
19、实验组染色体数为 20 的中期分裂相 检测到 18 个， 也明显多于染色体数为 18、 19、 21 的中期分裂相， 对应的数量为 4、 2、 3。 0024 实施例 1 0025 现以其中的一组参数为例， 阐述本发明的操作方法如下 ： 0026 1. 挑选性腺饱满的牡蛎亲贝， 用显微镜区别雌雄亲本 ； 0027 2. 采用人工授精的方法获得精子、 卵子， 按照 10 1 的比例混合精子、 卵子， 获得 受精卵 ； 0028 3. 受精卵置于沙滤海水中培养， 每个充气头以 1L/min 的出气量往所述沙滤海 水中充入空气 ； 0029 4.将受精卵置于正常孵化条件下进行孵化， 在50的胚胎发育。
20、至面盘幼体期(又 称 D 形幼体期 ) 时， 开始进行压力诱导 ； 0030 5.由于静水压仪(可参见中国专利ZL02241798.2.)的空间有限， 为了取得较好的 处理效果， 在将牡蛎胚胎移入压力容器腔 ； 先用 25m 孔径 ( 即 500 目 ) 的筛网将牡蛎胚胎 进行浓缩 ； 0031 6. 快速加压至 10MPa， 持续 50min ； 0032 7.50min 后迅速释放压力， 取出牡蛎胚胎， 放入养殖池中进行常规牡蛎育苗 ； 0033 8. 经过这样处理过的牡蛎仍然是正常二倍体， 且 15 天后的成活率 (42.7 ) 显著 高于对照组 (1.9 )。 0034 实施例 2 0035 牡蛎幼体处于囊胚期， 10MPa的压力处理10min， 其余步骤与实施例1类似， 15天后 的成活率为 14.7。 0036 实施例 3 0037 牡蛎幼体处于原肠胚， 40MPa的压力处理10min， 其余步骤与实施例1类似， 15天后 说 明 书 CN 101940178 B4/4 页 6 的成活率为 16.7。 0038 实施例 4 0039 牡蛎幼体处于原肠胚， 10MPa的压力处理30min， 其余步骤与实施例1类似， 15天后 的成活率为 11.8。 0040 以上实施例对照组 15 天的成活率约为 1.9。 说 明 书 。