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1、(10)申请公布号 CN 102943124 A (43)申请公布日 2013.02.27 CN 102943124 A *CN102943124A* (21)申请号 201210534043.9 (22)申请日 2012.12.12 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 芮屈生物技术 （上海） 有限公司 地址 201108 上海市闵行区金都路 4299 号 综合楼 2005 室 (72)发明人 张玉丽 裘建英 张云福 裘霖 (74)专利代理机构 上海翼胜专利商标事务所 ( 普通合伙 ) 31218 代理人 翟羽 施春花 (54) 发明名称 糖尿病病理演变前期 SORL-1 基。
2、因的 mRNA 水 平原位杂交检测试剂盒及检测方法和应用 (57) 摘要 本发明公开一种原位杂交检测试剂盒， 包 括杂交探针和标记物。还公开使用本试剂盒原 位杂交检测与糖尿病病理演变前期密切相关的 SORL-1 基因 mRNA 的方法， 包括以下步骤 ：（1） 在 杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件 下， 将底物中待测 RNA 与杂交探针接触， 形成杂交 复合体 ； 和 （2） 检测所述杂交复合体。本发明的 试剂盒和检测方法可在 mRNA 水平上检测 SORL-1 基因表达量， 比现有的临床生化检测指标更早期， 能实现真正的糖尿病病理演变前期 mRNA 水平筛 查， 做到糖尿病的预防性。
3、诊治， 将糖尿病消灭在萌 芽状态。同时， 本发明的检测方法简单方便， 成本 低 , 便于医院推广应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 11 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 11 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种原位杂交检测试剂盒， 包括杂交探针和标记物， 其特征在于， 所述的杂交探针为 序列表 SEQ ID NO.1 所示序列。 2. 如权利要求 1 所述的试剂盒， 其特征在于， 所述的标记物选自放射性物质、 化学发光 或显色物质、 生物素、 金属鲎、 荧。
4、光素、 酶及纳米材料。 3. 如权利要求 1 所述的试剂盒， 其特征在于， 该试剂盒还包括杂交液。 4. 如权利要求 1 所述的试剂盒， 其特征在于， 该试剂盒还包括增效剂。 5. 如权利要求 1 所述的试剂盒， 其特征在于， 该试剂盒还包括显色剂。 6. 一种 SORL-1 基因原位杂交检测方法， 其特征在于， 该方法包括以下步骤 ： （1） 在权利要求 1 所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下， 将底物 中待测 RNA 与杂交探针接触， 形成杂交复合体 ； 和 （2） 检测所述杂交复合体。 7. 如权利要求 6 所述的检测方法， 其特征在于， 所述的可形成稳定杂交复合体的条件。
5、 为 ： 核酸杂交的温度为 42 ； 核酸杂交的时间为 16 24 小时。 8. 如权利要求 6 所述的检测方法， 其特征在于， 所述的底物选用人的血液细胞标本。 9. 如权利要求 6 所述的检测方法， 其特征在于， 所述的血液细胞标本选自糖尿病患者、 高危人群、 正常人标本。 10.SFRP4 基因在制备检测糖尿病原位杂交试剂盒中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102943124 A 2 1/6 页 3 糖尿病病理演变前期 SORL-1 基因的 mRNA 水平原位杂交检 测试剂盒及检测方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及生物检测领域， 更具体地说， 是涉及与糖尿病病理演变 mRNA。
6、 表达改变 ( 病理演变过程 ) 的相关检测技术。 背景技术 0002 2011 年统计的最新数据显示全国已经确诊的糖尿病有 9240 万， 糖尿病前期的人 群有 1.48 亿。糖尿病并发症是一种常见的慢性并发症， 是由糖尿病病变转变而来， 后果相 当严重， 如足病 （足部坏疽、 截肢） 、 肾病 （肾功能衰竭、 尿毒症） 、 眼病 （模糊不清、 失明） 、 脑病 （脑血管病变） 、 心脏病、 皮肤病、 性病等是糖尿病最常见的并发症， 是导致糖尿病患者死亡 的主要因素。糖尿病的病理生理变化是由于胰岛素分泌不足和组织糖利用障碍， 导致血糖 过高代谢障碍。 糖尿病有原发性与继发性两种。 原发性病因。
7、尚未清楚;， 可能与遗传等因素 有关， 继发性见于慢性胰腺炎、 癌症、 血色病、 胰大部分手术切除、 脑垂体前叶机能亢进、 促 肾上腺皮质机能亢进、 肾上腺嗜铬细胞瘤、 胰岛 细胞瘤、 妊娠糖尿病等。近来科学家们都 把糖尿病的发病机制的放在基因病理生理学水平进行深入研究， 发现了一些与糖尿病发病 有关一些基因， 如SORL-1基因是近来发现与患糖尿病有关， 发现SORL-1蛋白在糖尿病患者 体内的水平明显增高， 研究人员认为这一指标可以通过简单的血液测试， 指示正常体重的 中年人患糖尿病的风险。这将给他们更强的动力来尽早改善生活方式， 以预防糖尿病。临 床上当患者被确诊为二型糖尿病时， 往往这。
8、一疾病早已在患者体内发展了多年， 而且已经 对血管和眼部造成了伤害， 及早筛查出糖尿病的早期风险是很有价值的， 这样人们就可以 尽早采取预防性疗法。 0003 本发明人在长期研究中发现， 导致重大疾病死亡率不降的重要原因是不能做到真 正的早期诊治。因此， 开发出用于糖尿病发病前期的相关基因水平筛查试剂盒有非常大的 临床价值。 0004 随着分子生物技术日益完善， 功能基因组学， 疾病基因组学等研究的深入展开， 为 了寻求更早期的诊断糖尿病、 治疗糖尿病、 以及预防糖尿病， 已取得长足进步。 至今， 我们已 有可能在基因的一级转录功能产物 mRNA 水平上做更精确的早期筛查和诊断， 在糖尿病前 。
9、期做预测和筛查， 这样就能将糖尿病的发病率降下来， 可以大大降低社会成本， 进一步提高 国民的健康体质。 0005 发明人在研究中发现用双标记技术， 同步检测蛋白质与检测 mRNA， 有时候 mRNA 有 表达， 但蛋白质有时候没有转录出来， 它们有时候存在表达时空不对应现象， 检测 mRNA 会 更准确。 0006 本发明人在研究中发现 SORL-1 基因在糖尿病患者、 高危人群、 正常对照人有明显 的表达量变化， 将SORL-1作为筛查糖尿病病变前期有非常重要的临床意义。 SORL-1在糖尿 病患者病变中高表达。他作于糖尿病预警有非常重要的临床意义。 0007 发明人在长期的研究中， 得出。
10、了一种新理念， 重大疾病的临床诊治模式一定要改 说 明 书 CN 102943124 A 3 2/6 页 4 变， 不能只停留现在治已病 （发病后诊治） ， 要做到预防性诊治， 做到治已病， 只有这样才能 降低重大疾病的发病率和死亡率， 降低社会成本和医疗成本。 因此， 发明人在开发和生产重 大疾病的 mRNA 水平筛查试剂盒及治疗药物中， 在理论和技术上都做了创新。特别是筛选临 床标本 （正常人群、 高危人群、 疾病患者） ， 突破了正常组织与病理组织比较的一贯性研发思 路， 来寻找和开发病变前期的 mRNA 水平， 与疾病早期基因病理生理学演变密切相关， 而且 临床意义非常重要 mRNA 。
11、靶标， 将临床上疾病形成后诊治模式变成重大疾病的预防性诊治， 争取了疾病诊治的时间和空间， 达到预防疾病。 0008 根据现有的文献资料采用原位杂交技术和组化免疫方法检测SORL-1基因mRNA水 平表达量的检测技术及试剂盒未见报道。 0009 本发明人在针对创新性发明的要求， 设计了 （糖尿病患者、 高危人群、 正常对照） 不 同数据例组， 用原位杂交技术进行检测， 结果表明以上糖尿病病人高表达， 高危人群有不同 程度表达 10-20%, 正常对照都是不表达。表明 SORL-1 基因是糖尿病病变前期筛查的重要 标志物。 0010 原位杂交技术 （in situ hybridization） 。
12、是将分子生物学与细胞化学技术结合起 来， 以标记的核酸分子为探针， 在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。 其原理是使含 有特异序列、 经过标记的核酸单链 （即探针） ， 在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链 即靶核酸发生杂交， 再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测， 从而在细 胞原位显示特异的 DNA 或 RNA 分子。 0011 原位杂交的探针是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子 （虽不明确 该分子全部序列， 但已知其针对何靶分子） ， 探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、 cDNA 探针、 cRNA 探针和合成寡核苷酸探针。为了便于示踪， 探针必须用一。
13、定的手段加以标 记， 以利于以后的检测。常用的标记物包括放射性核素和非放射性标记物两大类。常用的 同位素标记物有 3H、35S、125I 和32P。同位素标记物虽然有灵敏性高、 背底较为清晰等优点， 但 是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害， 近来有被非同位素取代的趋势。非同位素 标记物中目前最常用的有生物素、 地高辛和荧光素三种。检测这些标记物的方法都是极其 灵敏的。 0012 根据所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA,RNA-DNA, RNA-RNA杂交。 但不论哪一种形式的杂交， 都必须经过五大过程， 即组织细胞的固定， 预杂交、 杂交、 冲洗和 显示。本发明采用 RN。
14、A-RNA 的杂交方式， 合成的探针 （RNA） 和检测的靶 RNA 是采用碱基互 补 （杂交互补） 的原理， 同时经过长时间研究和观察， 启动和中止处得残基对检测的结果没 有影响。 0013 鉴于目前临床上人类重大疾病诊断大部分是晚期， 治疗也是晚期， 导致死亡率不 降的诊治模式。本发明的初衷是想改变目前临床上重大疾病的诊治模式， 从治已病变成预 防性治未病， 达到重大疾病预防性诊治目的， 在理念和技术做出了创新性的突破， 提供疾病 变化mRNA水平筛查技术， 使临床上有了一项新的疾病变化前期mRNA水平筛查的技术， 为临 床重大疾病的诊治争取时间和空间， 实现重大的预防。 0014 综上所。
15、述， 本发明的目的首先是提供一种原位杂交检测试剂盒， 其包含原位杂交 检测探针和标记物。其次， 本发明还要提供上述试剂盒用于与糖尿病前期筛查及早期预警 相关的原位杂交检测方法。 说 明 书 CN 102943124 A 4 3/6 页 5 发明内容 0015 为实现本发明的目的， 本发明的技术方案如下 ： 本发明首先提供一种原位杂交检测试剂盒， 其包括杂交探针和标记物， 其中， 所述 的杂交探针序列为序列表 SEQ ID NO.1 所示序列， 是 SORL-1 基因序列 CDS 中的一段， 从 601-1080bp， 共 480bp， SORL-1 基因为序列表 SEQ ID NO.2 所示序。
16、列， 位于染色体 11q23.2-24.2“ 上， 全长 10973bp。 0016 本发明试剂盒的一个优选方案是， 所述的标记物选自放射性物质、 化学发光或显 色物质、 生物素、 金属鲎、 荧光素、 酶及纳米材料。 0017 本发明试剂盒的一个优选方案是还包括杂交液。 0018 本发明试剂盒的一个优选方案是还包括增强剂。 0019 本发明试剂盒的一个优选方案是还包括显色剂。 0020 本发明的糖尿病病变前期 SORL-1 筛查试剂盒应用价值在于， 对糖尿病前期筛查 及预警有非常重要临床意义， 进一步配合临床做预防性治疗。 0021 本发明还提供一种 SORL-1 基因原位杂交的检测方法， 包。
17、括以下步骤 ： （1） 在上面所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下， 将底物中待测 RNA 与杂交探针接触， 形成杂交复合体 ； 和 （2） 检测所述杂交复合体。 0022 本发明所述的检测方法， 其中优选地是， 所述的可形成稳定杂交复合体的条件为 ： 核酸杂交的温度为 42 ； 核酸杂交的时间为 16 24 小时。 0023 本发明所述的检测方法， 其中优选地是， 所述的底物选用人的血液细胞标本或其 它器官组织细胞标本。更优选地是， 所述的血液标本或其它器官组织细胞标本来自糖尿病 患者、 高危人群、 健康正常人群。 0024 本发明的检测试剂盒是采用核酸杂交技术和组化免疫方法相。
18、结合， 以 SORL-1 为 检测对象， 合成探针为序列表SEQ ID NO.1所示序列， 480bp， 检测的底物是人体血液标本白 细胞或组织细胞的 RNA 的表达量。原位杂交技术的显示方法能提供 SORL-1 的半定量或定 量表达程度判定。根据杂交后免疫组化显色判定以上 RNA 的表达量， 正常人 SORL-1 基因不 表达， 即无显色， 在糖尿病病人高度表达， 大量染色， 高危人群有轻度染色。 0025 本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针， 杂交液， 显色剂， 增效剂等组成。本试 剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知， 具体操作步骤是标本处理、 预杂交、 杂 交、 免疫组化染色。
19、、 镜下进行定量分析、 结果报告， 其中杂交的具体步骤包括 ： 1). 将待测标本放入反应槽中 ； 2). 仪器自动弃去液体， 自动加消化液 ； 3). 仪器自动弃去液体， 自动后固定 ； 4). 仪器自动弃去液体， 自动预杂交 （42） ； 5). 仪器自动弃去液体， 自动清洗 ； 6). 仪器自动弃去液体， 自动杂交 （42） ； 7). 仪器自动弃去液体， 自动清洗 ； 8). 仪器自动弃去液体， 自动与 DIG 抗体培养 （室温） ； 说 明 书 CN 102943124 A 5 4/6 页 6 9). 仪器自动弃去液体， 自动清洗， 显色 ； 10). 取出封片镜检。 0026 本发。
20、明的一个优选实施例的方案是 ： 以 SORL-1 合成的核酸探针用地高辛标记 （地 高辛标记的 cDNA、 RNA 和寡核苷酸探针， 不但探针的具有生物素标记优点， 还克服了生物素 标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点） ， 将该杂交探针与人体血 液白细胞的待测RNA核酸进行杂交， 再用免疫组化的方法显色， 在光镜下观察RNA的存在和 定位 , 根据染色的细胞数， 判断目的 RNA 的表达量。 0027 本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术， 该方法通过检测底物细胞中的 SORL-1 表达量， 用来确定糖尿病病理演变前期的 mRNA 变化量， 预警糖尿病基因病理生理学 变化。
21、。因为 SORL-1 在正常人中不表达， 在糖尿病患者高表达， 如果高危人群有表达表明有 发生糖尿病的风险， 及时进行 （介入） 预防性治疗。 0028 一个试剂盒可以多人份使用或一人份使用。 0029 本发明具有如下有益效果 ： 本发明的临床意义是更早期跟踪检测糖尿病发生的风险。在生化指标未产生异常之 前， 及早做到以上基因 mRNA 表达异常的信息采集， 给临床医生一个真正的早期预警和预防 性治疗参考和指导。 0030 此外， 本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、 特异性强的特点， 同时， 本发明的检测 方法操作方便、 简单， 能在区级以上医院普遍使用和推广。 附图说明 0031 图 1 是本。
22、发明 SORL-1 基因原位杂交技术流程图。 0032 图 2 是本发明实施例中糖尿病病人 SORL-1 表达图片。 0033 图 3 是本发明实施例中轻度血糖升高的高危人群图片。 0034 图 4 是本发明实施例中正常人 SORL-1 表达图片。 具体实施方式 0035 下面结合实施例， 更具体地说明本发明的内容。 应该理解， 下面的实施例用于说明 而非限定本发明内容， 任何形式上的改变或变通将落入本发明的保护范围。 0036 实施例 1 按照常规方法制备本实施例的原位杂交试剂盒， 该试剂盒包括以 SORL-1 基因设计的 杂交探针、 标记物、 说明书， 其中 ： 本实施例的探针标记物选用地。
23、高辛。 0037 试剂盒杂交液组成 ： 消化液100L/ 管1 管 / 盒 无色透明液体 保护液100L/ 管1 管 / 盒 无色透明液体 预杂交液1300L/ 管2 管 / 盒 无色透明液体 正义杂交液10L/ 管1 管 / 盒 无色透明液体 反义杂交液10L/ 管1 管 / 盒 无色透明液体 封闭液1000L/ 管1 管 / 盒 无色透明液体 碱性磷酸酶抗体1L/ 管1 管 / 盒 无色透明液体 显色剂 A175L/ 管1 管 / 盒 黄色液体 显色剂 B320L/ 管1 管 / 盒 无色透明液体 说 明 书 CN 102943124 A 6 5/6 页 7 缓冲液90mL/ 瓶1 瓶 /。
24、 盒 浅黄色或无色透明液体 缓冲液80mL/ 瓶1 瓶 / 盒 浅黄色或无色透明液体 缓冲液20mL/ 瓶3 瓶 / 盒 浅黄色或无色透明液体 缓冲液90mL/ 瓶1 瓶 / 盒 浅黄色或无色透明液体 固定液90mL/ 瓶1 瓶 / 盒 无色透明液体 阳性对照标本6 片 / 盒 配制试剂使用浓度 1). 将 10 缓冲液用三蒸水按 1:10 稀释成 1 缓冲液 ； 2). 将 20 缓冲液用三蒸水按 1:10 稀释成 2 缓冲液 ； 按 1:100 稀释成 0.2 缓冲液 ; 按 1:200 稀释成 0.1 缓冲液 ； 3). 将 10 缓冲液用三蒸水按 1:10 稀释成 1 缓冲液 ； 4)。
25、.10缓冲液用三蒸水按1:10稀释成缓冲液 (取1#， 2#， 3#各10mL, 加水 至 100mL 既可 )。 0038 实施例 2 应用核酸原位杂交检测方法对各组血液标本 SORL-1 基因表达量的实施过程 ： 1). 取待测标本两张 ； 2).在玻璃缸里加入消化液(消化液100L加1缓冲液99.9ml， 即为使用浓度)50 ml， 37水浴预热 10min， 放进 16 张玻片， 37处理 12 min, 再用 1 缓冲液洗 5min ； 3). 用 0.2% 的保护液 ( 保护液 1ml 加 1 缓冲液 , 99ml 即为使用浓度 ) 洗 10min, 三蒸水洗 5min（以上过程都。
26、在玻璃缸进行） ， 取出玻片， 让其自然干燥 ； 4). 将玻片放入保湿盒内 , 加预杂交液 25L/ 片 （加在有细胞的地方） ， 盖上盖玻片， 盖紧保湿盒， 放在 42恒温水浴箱中 3h 以上 ； 5). 取出玻片 , 弃去盖玻片， 将玻片放入玻璃缸内 , 用 70%、 90%、 95% 的乙醇各洗 2min， 取出， 自然干燥 ； 6) .将玻片放入保湿盒内， 一张加正义杂交液25L/片， 另一张加反义杂交液25L/ 片， 盖上盖玻片 , 盖紧保湿盒， 放在 42恒温水浴箱中 16-24h ； 7). 取出玻片 , 弃去盖玻片 , 将玻片放入玻璃缸内 ： 在 42恒温水浴箱中用 2 缓冲。
27、液洗两次 , 每次 15min ； 在 42恒温水浴箱中用 0.2 缓冲液洗一次 , 每次 15min ； 在 42恒温水浴箱中用 0.1 缓冲液洗两次 , 每次 15min ； 8). 用 1 缓冲液洗 30s, 取出玻片 , 自然干燥 ； 9). 将玻片放入保湿盒内 , 加 0.5% 封闭液 （1ml 封闭液加 5ml 1 缓冲液） 100L/ 片 , 盖紧保湿盒， 在室温下作用 30min。 （此步骤不需加盖玻片） ； 10). 取出玻片 , 用 1 缓冲液洗 30s, 自然干燥 ； 11).将玻片放入保湿盒内, 加X-AP抗体(取一管碱性磷酸酶抗体， 向其中加入1.8ml 1 缓冲液 。
28、)100L/ 片 , 盖紧保湿盒在室温下作用 30min， 时间不能过长， 否则会产生假 阳性 （此步骤不需加盖玻片） ； 12). 取出玻片， 用 1 缓冲液洗 3 次 , 每次 15min ； 13). 用 1 缓冲液洗 2min， 加显色剂 ( 显色剂 A73.3L， 显色剂 B157.5L 加到 30mL 1 缓冲液中 , 混匀 )， 室温避光 16h 到 18h 以上 ； 说 明 书 CN 102943124 A 7 6/6 页 8 14). 用三蒸水洗 5min， 自然干燥，（用甘油加 10% 的 1 缓冲液混匀） 封片镜检。 0039 本发明的核酸原位杂交检测方法将目的基因用地高。
29、辛标记， 成为 RNA 核酸探针， 将探针与人体白细胞的待测 RNA 核酸进行杂交， 再用免疫组化的方法显色， 因此在光镜下 观察 RNA 的存在和定位 , 根据染色的细胞数， 判断目的 RNA 的表达量。 0040 糖尿病病人 20 名， 高危人群 （轻度血糖升高人） 20 名， 正常对照组 20 名。抽所有 待检人的外周血 3-5 毫升 （分离白细胞） 做原位杂交。结果表示， 所有糖尿病患者 SORL-1 基 因 mRNA 表达量高， 细胞染色深 ； 高危人群表达稍降低， 小数染色 ； 正常对照组 SORL-1 基因 不表达， 细胞不染色， 具体结果见图 2、 图 3、 图 4。 糖尿病人。
30、数表达量 % 高危人数表达量 % 正常人数表达量 % 1 70 1 62 1 0 2 60 2 14 2 0 3 64 3 20 3 0 4 604 154 0 5 62 5 19 5 0 6 68 6 16 6 0 7 65 7 18 7 0 8 56 8 14 8 0 9 68 9 18 9 0 10 68 10 14 10 0 11 64 11 16 11 0 12 69 12 14 120 13 62 13 20 13 0 14 68 14 22 14 0 15 60 15 19 15 0 16 56 16 14 16 0 17 70 17 16 17 0 18 70 18 20 18。
31、 0 19 62 19 12 19 0 20 70201620 0 说 明 书 。 CN 102943124 A 8 1/11 页 9 SEQUENCE LISTING 芮屈生物技术 （上海） 有限公司 糖尿病病理演变前期 SORL-1 基因的 mRNA 水平原位杂交检测试剂盒及检测方 法和应用 。 2 PatentIn version 3.5 1 480 DNA Homo sapiens 1 aataggagtg aagctgttat cgcccagttc taccacagcc ctgcggacaa caagcggtac 60 atctttgcag acgcttatgc ccagtacctc。
32、 tggatcacgt ttgacttctg caacactctt 120 caaggctttt ccatcccatt tcgggcagct gatctcctcc tacacagtaa ggcctccaac 180 cttctcttgg gctttgacag gtcccacccc aacaagcagc tgtggaagtc agatgacttt 240 ggccagacct ggatcatgat tcaggaacat gtcaagtcct tttcttgggg aattgatccc 300 tatgacaaac caaataccat ctacattgaa cgacatgaac cctctggc。
33、ta ctccactgtc 360 ttccgaagta cagatttctt ccagtcccgg gaaaaccagg aagtgatcct tgaggaagtg 420 agagattttc agcttcggga caagtacatg tttgctacaa aggtggtgca tctcttgggc 480 2 10973 序 列 表 CN 102943124 A 9 2/11 页 10 DNA Homo sapiens 2 cccggagcgg cgcgggcggc ctggagcccc gggagcggcg cgcgcggtcc cggcccagcg 60 gctctcctgg cc。
34、tcgcgctg cacattctct cctggcggcg gcgccacctg cagtagcgtt 120 cgcccgaaca tggcgacacg gagcagcagg agggagtcgc gactcccgtt cctattcacc 180 ctggtcgcac tgctgccgcc cggagctctc tgcgaagtct ggacgcagag gctgcacggc 240 ggcagcgcgc ccttgcccca ggaccggggc ttcctcgtgg tgcagggcga cccgcgcgag 300 ctgcggctgt gggcgcgcgg ggatgccagg 。
35、ggggcgagcc gcgcggacga gaagccgctc 360 cggaggaaac ggagcgctgc cctgcagccc gagcccatca aggtgtacgg acaggttagt 420 ctgaatgatt cccacaatca gatggtggtg cactgggctg gagagaaaag caacgtgatc 480 gtggccttgg cccgagatag cctggcattg gcgaggccca agagcagtga tgtgtacgtg 540 tcttacgact atggaaaatc attcaagaaa atttcagaca agttaaact。
36、t tggcttggga 600 aataggagtg aagctgttat cgcccagttc taccacagcc ctgcggacaa caagcggtac 660 atctttgcag acgcttatgc ccagtacctc tggatcacgt ttgacttctg caacactctt 720 caaggctttt ccatcccatt tcgggcagct gatctcctcc tacacagtaa ggcctccaac 780 cttctcttgg gctttgacag gtcccacccc aacaagcagc tgtggaagtc agatgacttt 840 ggc。
37、cagacct ggatcatgat tcaggaacat gtcaagtcct tttcttgggg aattgatccc 900 tatgacaaac caaataccat ctacattgaa cgacatgaac cctctggcta ctccactgtc 960 ttccgaagta cagatttctt ccagtcccgg gaaaaccagg aagtgatcct tgaggaagtg 1020 agagattttc agcttcggga caagtacatg tttgctacaa aggtggtgca tctcttgggc 1080 序 列 表 CN 102943124 A 。
38、10 3/11 页 11 agtgaacagc agtcttctgt ccagctctgg gtctcctttg gccggaagcc catgagagca 1140 gcccagtttg tcacaagaca tcctattaat gaatattaca tcgcagatgc ctccgaggac 1200 caggtgtttg tgtgtgtcag ccacagtaac aaccgcacca atttatacat ctcagaggca 1260 gaggggctga agttctccct gtccttggag aacgtgctct attacagccc aggaggggcc 1320 ggc。
39、agtgaca ccttggtgag gtattttgca aatgaaccat ttgctgactt ccaccgagtg 1380 gaaggattgc aaggagtcta cattgctact ctgattaatg gttctatgaa tgaggagaac 1440 atgagatcgg tcatcacctt tgacaaaggg ggaacctggg agtttcttca ggctccagcc 1500 ttcacgggat atggagagaa aatcaattgt gagctttccc agggctgttc ccttcatctg 1560 gctcagcgcc tcagtcag。
40、ct cctcaacctc cagctccgga gaatgcccat cctgtccaag 1620 gagtcggctc caggcctcat catcgccact ggctcagtgg gaaagaactt ggctagcaag 1680 acaaacgtgt acatctctag cagtgctgga gccaggtggc gagaggcact tcctggacct 1740 cactactaca catggggaga ccacggcgga atcatcacgg ccattgccca gggcatggaa 1800 accaacgagc taaaatacag taccaatgaa gg。
41、ggagacct ggaaaacatt catcttctct 1860 gagaagccag tgtttgtgta tggcctcctc acagaacctg gggagaagag cactgtcttc 1920 accatctttg gctcgaacaa agagaatgtc cacagctggc tgatcctcca ggtcaatgcc 1980 acggatgcct tgggagttcc ctgcacagag aatgactaca agctgtggtc accatctgat 2040 gagcggggga atgagtgttt gctgggacac aagactgttt tcaaacg。
42、gcg gaccccccat 2100 gccacatgct tcaatggaga ggactttgac aggccggtgg tcgtgtccaa ctgctcctgc 2160 acccgggagg actatgagtg tgacttcggt ttcaagatga gtgaagattt gtcattagag 2220 序 列 表 CN 102943124 A 11 4/11 页 12 gtttgtgttc cagatccgga attttctgga aagtcatact cccctcctgt gccttgccct 2280 gtgggttcta cttacaggag aacgagaggc 。
43、taccggaaga tttctgggga cacttgtagc 2340 ggaggagatg ttgaagcgcg actggaagga gagctggtcc cctgtcccct ggcagaagag 2400 aacgagttca ttctgtatgc tgtgaggaaa tccatctacc gctatgacct ggcctcggga 2460 gccaccgagc agttgcctct caccgggcta cgggcagcag tggccctgga ctttgactat 2520 gagcacaact gtttgtattg gtccgacctg gccttggacg tcatc。
44、cagcg cctctgtttg 2580 aatggaagca cagggcaaga ggtgatcatc aattctggcc tggagacagt agaagctttg 2640 gcttttgaac ccctcagcca gctgctttac tgggtagatg caggcttcaa aaagattgag 2700 gtagctaatc cagatggcga cttccgactc acaatcgtca attcctctgt gcttgatcgt 2760 cccagggctc tggtcctcgt gccccaagag ggggtgatgt tctggacaga ctggggagac。
45、 2820 ctgaagcctg ggatttatcg gagcaatatg gatggttctg ctgcctatca cctggtgtct 2880 gaggatgtga agtggcccaa tggcatctct gtggacgacc agtggattta ctggacggat 2940 gcctacctgg agtgcataga gcggatcacg ttcagtggcc agcagcgctc tgtcattctg 3000 gacaacctcc cgcaccccta tgccattgct gtctttaaga atgaaatcta ctgggatgac 3060 tggtcacagc。
46、 tcagcatatt ccgagcttcc aaatacagtg ggtcccagat ggagattctg 3120 gcaaaccagc tcacggggct catggacatg aagattttct acaaggggaa gaacactgga 3180 agcaatgcct gtgtgcccag gccatgcagc ctgctgtgcc tgcccaaggc caacaacagt 3240 agaagctgca ggtgtccaga ggatgtgtcc agcagtgtgc ttccatcagg ggacctgatg 3300 tgtgactgcc ctcagggcta tcag。
47、ctcaag aacaatacct gtgtcaaaga agagaacacc 3360 tgtcttcgca accagtatcg ctgcagcaac gggaactgta tcaacagcat ttggtggtgt 3420 序 列 表 CN 102943124 A 12 5/11 页 13 gactttgaca acgactgtgg agacatgagc gatgagagaa actgccctac caccatctgt 3480 gacctggaca cccagtttcg ttgccaggag tctgggactt gtatcccact gtcctataaa 3540 tgtgacct。
48、tg aggatgactg tggagacaac agtgatgaaa gtcattgtga aatgcaccag 3600 tgccggagtg acgagtacaa ctgcagttcc ggcatgtgca tccgctcctc ctgggtatgt 3660 gacggggaca acgactgcag ggactggtct gatgaagcca actgtaccgc catctatcac 3720 acctgtgagg cctccaactt ccagtgccga aacgggcact gcatccccca gcggtgggcg 3780 tgtgacgggg atacggactg ccaggatggt tccgatgagg atccagtcaa ctgtgagaag 3840 aagtgcaatg gattccgctg cccaaacggc acttgcatcc catccagcaa acattgtgat 3900 ggtctgcgtg attgctctga tggctccgat gaacagcact gcgagcccct ctgtacgcac 3960 ttcatggact ttgtgtgtaa gaaccgccag cagtgcctgt tccactccat ggtctgtgac 4020 ggaatcatcc agtgc。