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1、(10)授权公告号 CN 101843667 B (45)授权公告日 2012.02.15 CN 101843667 B *CN101843667B* (21)申请号 201010194759.X (22)申请日 2010.06.07 A61K 36/634(2006.01) A61K 9/00(2006.01) A61P 31/00(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 11/14(2006.01) A61P 11/04(2006.01) A61P 11/10(2006.01) A61P 11/00(2006.01) A61K 31/7048(2006.01) 。
2、(73)专利权人 哈尔滨珍宝制药有限公司 地址 150060 黑龙江省哈尔滨开发区哈平路 集中区烟台一路 8 号 (72)发明人 方同华 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 张庆敏 杨静 CN 101474260 A,2009.07.08, 全文 . CN 101390956 A,2009.03.25, 全文 . 吕本强等 . 双黄连粉针剂不良反应及其原因 分析 .中国医院药学杂志 .2008, 第 28 卷 ( 第 20 期 ),1810-1811. 童路 . 双黄连注射剂的不良反应与成分间的 关系. 中成药 .1997,第19卷(第4期),47-48.。
3、 张文清等 . 双黄连的提取精制工艺研究 . 世 界科学技术中医药现代化 .2008, 第 10 卷 ( 第 3 期 ),66-69， 65. (54) 发明名称 一种双黄连药物组合物及其制备方法 (57) 摘要 本发明提供了一种双黄连药物组合物， 其先 由金银花和连翘混合提取得银翘提取物， 然后再 与黄芩提取得到的黄芩提取物混合而成， 金银 花、 连翘和黄芩的重量比为 1 2 1 ； 所述药 物组合物中含 20-40总黄酮、 5-20总皂苷、 20-30总有机酸、 8-18糖类、 0.2-2总氨基 酸、 0.35-1.0连翘苷。 本发明双黄连药物组合物 对所用的金银花、 连翘和黄芩进行提取及。
4、分离有 效成分， 去除杂质及无效成分， 并对各有效成分进 行合理配比， 同时严格限定绿原酸与咖啡酸的含 量， 在保证疗效的同时提高安全性。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 谢京晶 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 2 页 说明书 11 页 CN 101843667 B1/2 页 2 1. 一种双黄连药物组合物， 其特征在于， 其先由金银花和连翘混合提取得银翘提取物， 然后再与黄芩提取得到的黄芩提取物混合而成， 金银花、 连翘和黄芩的重量比为121 ； 所述药物组合物中含 20-40总黄酮、 5-20总皂苷、 20-30总有机酸、 8-18糖类。
5、、 0.2-2总氨基酸、 0.35-1.0连翘苷 ； 总有机酸中绿原酸和咖啡酸占 2.0-5.0； 其采用以 下步骤制备 ： 1)取1重量份金银花， 2重量份连翘， 加6-8倍原料量的水浸渍30分钟后， 煎煮2次， 每 次 1-2 小时， 合并滤液， 浓缩至 70-80测定相对密度为 1.20-1.25 的清膏， 放冷至 40时 缓缓加入乙醇使含醇量达 75， 充分搅拌， 静置 12 小时， 滤取上清液， 回收乙醇至无醇味， 加入浓缩膏重量的 3-4 倍量水， 调节 pH 值至 7.0， 充分搅拌并加热至沸腾， 静置 48 小时， 滤 取上清液， 浓缩至 70-80测定相对密度为 1.10-1。
6、.15， 放冷至 40后进行二次醇沉， 醇沉 浓度为 85， 静置 12 小时， 滤取上清液， 回收乙醇至无醇味， 得银翘提取物 ； 2) 取 1 重量份黄芩加 4-6 倍量水煎煮 2-3 次， 每次 1-2 小时， 合并滤液， 用 2mol/L 盐 酸调节 pH 值至 1.0-2.0， 在 80保温 30 分钟至 1 小时， 静置 12-24 小时， 滤过， 沉淀加 6-8 重量份水， 搅拌， 用 40氢氧化钠溶液调 pH 值至 7.0， 并加等量乙醇， 搅拌使溶解， 滤过， 滤 液用 2mol/L 盐酸调 pH 值至 2.0， 60保温 30 分钟， 静置 12 小时， 滤过， 沉淀用乙醇。
7、洗涤至 pH 值至 4.0， 60以下干燥得黄芩提取物 ； 3) 取黄芩提取物加水， 加热并用 40氢氧化钠溶液调节 pH 值至 7.0 使溶解， 滤过， 并 取银翘提取物加水， 溶解过滤， 合并两种滤液 ； 4)将滤液上XDA-5和D101的混合树脂柱， 以水、 氯化钠和磷酸盐的缓冲液、 梯度乙醇进 行洗脱， 鉴定和定量分析各流分， 进行收集， 按照各组合物有效成分比例合并各流分。 2. 根据权利要求 1 所述的双黄连药物组合物， 其特征在于， 所述药物组合物中含 25-35总黄酮、 10-15总皂苷、 25-30总有机酸、 10-15糖类、 0.6-1总氨基酸、 0.4-0.7连翘苷。 3。
8、. 根据权利要求 1 或 2 所述的双黄连药物组合物， 其特征在于， 黄芩苷占总黄酮的 60-100。 4. 根据权利要求 3 所述的双黄连药物组合物， 其特征在于， 黄芩苷占总黄酮的 85-98， 总有机酸中绿原酸和咖啡酸占 3.0-4.5。 5. 根据权利要求 3 所述双黄连药物组合物， 其特征在于， 所述药物组合物与药学上可 接受的载体制备成注射液、 冻干粉针剂、 口服液、 片剂、 颗粒剂、 栓剂、 胶囊剂或滴丸。 6.根据权利要求1、 2或4中任意一项所述双黄连药物组合物， 其特征在于， 所述药物组 合物与药学上可接受的载体制备成注射液、 冻干粉针剂、 口服液、 片剂、 颗粒剂、 栓剂。
9、、 胶囊 剂或滴丸。 7. 根据权利要求 5 所述双黄连药物组合物， 其特征在于， 所述注射液中黄芩苷含量为 6.5-8.5mg/ml， 连翘苷含量为 0.14-0.21mg/ml， 绿原酸和咖啡酸含量为 0.19-0.28mg/ml， 总氨基酸含量为 0.1-0.3mg/ml。 8. 根据权利要求 6 所述双黄连药物组合物， 其特征在于， 所述注射液中黄芩苷含量为 6.5-8.5mg/ml， 连翘苷含量为 0.14-0.21mg/ml， 绿原酸和咖啡酸含量为 0.19-0.28mg/ml， 总氨基酸含量为 0.1-0.3mg/ml。 9. 制备权利要求 1-8 任意一项所述双黄连药物组合物的。
10、方法， 其特征在于， 包括以下 权 利 要 求 书 CN 101843667 B2/2 页 3 步骤 ： 1)取1重量份金银花， 2重量份连翘， 加6-8倍原料量的水浸渍30分钟后， 煎煮2次， 每 次 1-2 小时， 合并滤液， 浓缩至 70-80测定相对密度为 1.20-1.25 的清膏， 放冷至 40时 缓缓加入乙醇使含醇量达 75， 充分搅拌， 静置 12 小时， 滤取上清液， 回收乙醇至无醇味， 加入浓缩膏重量的 3-4 倍量水， 调节 pH 值至 7.0， 充分搅拌并加热至沸腾， 静置 48 小时， 滤 取上清液， 浓缩至 70-80测定相对密度为 1.10-1.15， 放冷至 4。
11、0后进行二次醇沉， 醇沉 浓度为 85， 静置 12 小时， 滤取上清液， 回收乙醇至无醇味， 得银翘提取物 ； 2) 取 1 重量份黄芩加 4-6 倍量水煎煮 2-3 次， 每次 1-2 小时， 合并滤液， 用 2mol/L 盐 酸调节 pH 值至 1.0-2.0， 在 80保温 30 分钟至 1 小时， 静置 12-24 小时， 滤过， 沉淀加 6-8 重量份水， 搅拌， 用 40氢氧化钠溶液调 pH 值至 7.0， 并加等量乙醇， 搅拌使溶解， 滤过， 滤 液用 2mol/L 盐酸调 pH 值至 2.0， 60保温 30 分钟， 静置 12 小时， 滤过， 沉淀用乙醇洗涤至 pH 值至 。
12、4.0， 60以下干燥得黄芩提取物 ； 3) 取黄芩提取物加水， 加热并用 40氢氧化钠溶液调节 pH 值至 7.0 使溶解， 滤过， 并 取银翘提取物加水， 溶解过滤， 合并两种滤液 ； 4)将滤液上XDA-5和D101的混合树脂柱， 以水、 氯化钠和磷酸盐的缓冲液、 梯度乙醇进 行洗脱， 鉴定和定量分析各流分， 进行收集， 按照各组合物有效成分比例合并各流分。 10. 根据权利要求 9 所述双黄连药物组合物的制备方法， 其特征在于， 步骤 4) 的滤液 先以水进行洗脱， 收集流出液和洗脱液， 得糖类流分 ； 然后以氯化钠和磷酸盐缓冲液洗脱获 得总氨基酸流分 ； 用水冲洗树脂柱至中性后以 1。
13、0-15的乙醇洗脱得总有机酸流分 ； 再以 50-70乙醇洗脱得总黄酮流分 ； 最后以 60-70乙醇进行洗脱， 得总皂苷和连翘苷流分。 权 利 要 求 书 CN 101843667 B1/11 页 4 一种双黄连药物组合物及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种中药组合物， 具体地说， 涉及一种双黄连药物组合物及其制备方 法。 背景技术 0002 中药制剂双黄连为金银花、 连翘和黄芩经提取精制而得， 主要含有黄芩苷、 连翘 苷、 绿原酸等。现代药理研究证明， 双黄连制剂具有抗菌、 抗病毒、 解热等作用， 可以清热解 毒， 清宣风热， 适用于外感风热引起的发热、 咳嗽、 咽痛等病症。临。
14、床上被广泛用于治疗发 热、 微恶风寒或不恶寒、 咳嗽气促、 咳痰色黄、 咽红肿痛等急性上呼吸道感染、 急性支气管 炎、 急性扁桃腺炎、 轻型肺炎等病症。 0003 但随着双黄连制剂在临床上的广泛应用， 其不良反应的报道也屡见不鲜。双黄连 制剂的不良反应主要表现为皮肤潮红、 皮疹， 偶见胃肠道、 呼吸系统反应等。 0004 因此， 需要研究解决双黄连制剂在使用过程中引起的不良反应问题， 从而确定更 加安全的配方。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种配比更加合理的双黄连药物组合物。 0006 本发明的另一个目的是提供该组合物的制备方法。 0007 经研究发现， 双黄连制剂中所含的总黄酮、 。
15、总皂苷、 总有机酸、 糖类、 总氨基酸和连 翘苷是其有效成分， 同时总有机酸中的绿原酸既是抗病毒、 抗菌的有效成分， 也是可疑的致 敏原性物质， 进入机体后可能会导致过敏反应， 而且绿原酸也不稳定， 易分解为咖啡酸。 0008 因此， 本发明从双黄连制剂所用的金银花、 连翘和黄芩中提取、 分离有效成分， 去 除杂质及无效成分， 并对各有效成分进行合理配比， 同时严格限定绿原酸与咖啡酸的含量， 在保证疗效的同时提高安全性。 0009 为了实现本发明目的， 本发明提供一种双黄连药物组合物， 其先由金银花和连翘 混合提取得银翘提取物， 然后再与黄芩提取得到的黄芩提取物混合而成， 金银花、 连翘和黄 。
16、芩的重量比为 1 2 1 ； 所述药物组合物中含 20-40总黄酮、 5-20总皂苷、 20-30总 有机酸、 8-18糖类、 0.2-2总氨基酸、 0.35-1.0连翘苷。 0010 其中， 优选的为， 该组合物中含 25-35总黄酮、 10-15总皂苷、 25-30总有机 酸、 10-15糖类、 0.6-1总氨基酸、 0.4-0.7连翘苷。 0011 黄芩苷占总黄酮的 60-100， 总有机酸中绿原酸和咖啡酸占 2.0-5.0。优选为， 黄芩苷占总黄酮的 85-98， 总有机酸中绿原酸和咖啡酸占 3.0-4.5。 0012 各含量均为重量百分含量。 0013 本发明的药物组合物， 其可与药。
17、学上可接受的载体制备成注射液、 冻干粉针剂、 口 服液、 片剂、 颗粒剂、 栓剂、 胶囊剂、 分散片、 滴丸、 泡腾片或软胶囊。 0014 本发明的药物组合物制备成注射液时， 黄芩苷含量为 6.5-8.5mg/ml， 连翘苷含量 说 明 书 CN 101843667 B2/11 页 5 为 0.14-0.21mg/ml， 绿原酸和咖啡酸含量为 0.19-0.28mg/ml， 总氨基酸含量为 0.1-0.3mg/ ml。 0015 本发明药物组合物的制备方法， 包括以下步骤 ： 0016 1) 取 1 重量份金银花， 2 重量份连翘， 加 6-8 倍原料量的水浸渍 30 分钟后， 煎煮 2 次，。
18、 每次 1-2 小时， 合并滤液， 浓缩至 70-80测定相对密度为 1.20-1.25 的清膏， 放冷至 40时缓缓加入乙醇使含醇量达 75， 充分搅拌， 静置 12 小时， 滤取上清液， 回收乙醇至无 醇味， 加入浓缩膏重量的 3-4 倍量水， 调节 pH 值至 7.0， 充分搅拌并加热至沸腾， 静置 48 小 时， 滤取上清液， 浓缩至 70-80测定相对密度为 1.10-1.15， 放冷至 40后进行二次醇沉， 醇沉浓度为 85， 静置 12 小时， 滤取上清液， 回收乙醇至无醇味， 得银翘提取物 ； 0017 2) 取 1 重量份黄芩加 4-6 倍量水煎煮 2-3 次， 每次 1-2。
19、 小时， 合并滤液， 用 2mol/ L 盐酸调节 pH 值至 1.0-2.0， 在 80保温 30 分钟至 1 小时， 静置 12-24 小时， 滤过， 沉淀加 6-8重量份水， 搅拌， 用40氢氧化钠溶液调pH值至7.0， 并加等量乙醇， 搅拌使溶解， 滤过， 滤液用 2mol/L 盐酸调 pH 值至 2.0， 60保温 30 分钟， 静置 12 小时， 滤过， 沉淀用乙醇洗涤 至 pH 值至 4.0， 60以下干燥得黄芩提取物 ； 0018 3) 取黄芩提取物加水适量， 加热并用 40氢氧化钠溶液调节 pH 值至 7.0 使溶解， 滤过， 并取银翘提取物加水， 溶解过滤， 合并两种滤液 。
20、； 0019 4) 将滤液上 XDA-5 和 D101 混合树脂柱 ( 重量比 0.5 1-1 0.5)， 分别以水、 氯 化钠和磷酸盐的缓冲液、 梯度乙醇进行洗脱， 鉴定和定量分析各流分， 进行收集， 按照各组 合物有效成分比例合并各流分。 0020 本发明步骤 4) 的滤液先以水进行洗脱， 收集流出液和洗脱液， 得糖类流分 ； 然后 以氯化钠和磷酸盐缓冲液洗脱获得总氨基酸流分 ； 用水冲洗树脂柱至中性后以 10-15的 乙醇洗脱可得总有机酸流分 ； 再以 50-70乙醇洗脱得总黄酮流分 ； 最后以 60-70乙醇进 行洗脱， 得总皂苷和连翘苷流分。 0021 本发明双黄连药物组合物对所用的。
21、金银花、 连翘和黄芩进行提取及分离有效成 分， 去除杂质及无效成分， 并对各有效成分进行合理配比， 同时严格限定绿原酸与咖啡酸的 含量， 在保证疗效的同时提高安全性。 具体实施方式 0022 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 0023 实施例 1 0024 本实施例的双黄连药物组合物的制备过程如下 ： 0025 1)取500g金银花， 2000g连翘， 加8倍量水浸渍30分钟后， 煎煮2次， 每次1小时， 合并滤液， 浓缩至相对密度为1.22(75测)， 放冷至40， 缓缓加入乙醇使含醇量达75， 充分搅拌， 静置 12 小时， 滤取上清液， 回收乙醇至无醇味， 加入 3。
22、 倍量水， 调节 pH 值至 7.0， 充分搅拌并加热至沸腾， 静置48小时， 滤取上清液， 浓缩至相对密度为1.13(75测)， 放冷 至 40， 加入乙醇使含醇量达 85， 静置 12 小时， 滤取上清液， 回收乙醇至无醇味， 得银翘 提取物。 0026 2) 取 500g 黄芩酌以碎断， 加 4 倍量水煎煮 2 次， 每次 1 小时， 合并滤液， 用 2mol/L 盐酸调节 pH 值至 1.5， 在 80保温 30 分钟， 静置 24 小时， 滤过， 沉淀加 8 倍量水， 搅拌， 用 说 明 书 CN 101843667 B3/11 页 6 40氢氧化钠溶液调 pH 值至 7.0， 并加。
23、等量乙醇， 搅拌使溶解， 滤过， 滤液用 2mol/L 盐酸调 pH 值至 2.0， 60保温 30 分钟， 静置 12 小时， 滤过， 沉淀用乙醇洗涤至 pH 值至 4.0， 60以 下干燥， 得黄芩提取物。 0027 3) 取黄芩提取物加水适量， 加热并用 40氢氧化钠溶液调节 pH 值至 7.0 使溶解， 滤过， 取银翘提取物加水适量， 溶解过滤， 合并两种滤液， 得混合液。 0028 4) 将混合液上 XDA-5 和 D101 混合树脂柱 (1 1)， 静置吸附 8 小时后， 先以水进 行洗脱， 收集流出液和洗脱液， 得流分 1( 糖类 ) ； 然后用 0.25mol/L 氯化钠和 p。
24、H7.2 磷酸盐 缓冲液， 以 0.5ml/min 的流速进行洗脱， 收集洗脱液， 得流分 2( 总氨基酸 ) ； 用水冲洗树脂 柱至中性， 弃去该部分洗脱液， 再以 10的乙醇， 以 1ml/min 的流速冲洗树脂柱， 收集洗脱 液， 得流分3(总有机酸) ； 再以50乙醇， 以1ml/min的流速冲洗树脂柱， 收集洗脱液， 得流 分 4( 总黄酮 ) ； 最后以 70乙醇进行洗脱， 得流分 5( 总皂苷和连翘苷 )。 0029 5) 将各流分浓缩、 干燥， 混合， 即得。经检测， 含总黄酮 35.53 ( 其中黄芩苷 占 97.04 )， 总皂苷 16.16， 总有机酸 28.21 ( 其。
25、中绿原酸和咖啡酸占 3.6 )， 糖类 14.25， 总氨基酸 1.87， 连翘苷 0.83。 0030 实施例 2 0031 本实施例的双黄连药物组合物的制备过程如下 ： 0032 1) 取 500g 金银花， 2000g 连翘， 加 6 倍量水浸渍 30 分钟后， 煎煮 2 次， 每次 2 小 时， 合并滤液， 浓缩至 70测定相对密度为 1.20 的清膏， 放冷至 40时缓缓加入乙醇使含 醇量达 75， 充分搅拌， 静置 12 小时， 滤取上清液， 回收乙醇至无醇味， 加入 4 倍量水， 调节 pH 值至 7.0， 充分搅拌并加热至沸腾， 静置 48 小时， 滤取上清液， 浓缩至 70测。
26、定相对密度 为 1.10， 放冷至 40后进行二次醇沉， 醇沉浓度为 85， 静置 12 小时， 滤取上清液， 回收乙 醇至无醇味， 得银翘提取物 ； 0033 2) 取 500g 黄芩加 5 倍量水煎煮 3 次， 每次 2 小时， 合并滤液， 用 2mol/L 盐酸调节 pH 值至 2.0， 在 80保温 30 分钟至 1 小时， 静置 24 小时， 滤过， 沉淀加 8 倍量水， 搅拌， 用 40氢氧化钠溶液调 pH 值至 7.0， 并加等量乙醇， 搅拌使溶解， 滤过， 滤液用 2mol/L 盐酸调 pH 值至 2.0， 60保温 30 分钟， 静置 12 小时， 滤过， 沉淀用乙醇洗涤至 。
27、pH 值至 4.0， 60以 下干燥得黄芩提取物 ； 0034 3) 取黄芩提取物加水适量， 加热并用 40氢氧化钠溶液调节 pH 值至 7.0 使溶解， 滤过， 取银翘提取物加水适量， 溶解过滤， 合并两种滤液， 得混合液。 0035 4) 将混合液上 XDA-5 和 D101 混合树脂柱 (1 0.5)， 静置吸附 6 小时后， 先以水 进行洗脱， 收集流出液和洗脱液， 得流分 1( 糖类 ) ； 然后用 0.25mol/L 氯化钠和 pH7.2 磷酸 盐缓冲液， 以 0.5ml/min 的流速进行洗脱， 收集洗脱液， 得流分 2( 总氨基酸 ) ； 用水冲洗树 脂柱至中性， 弃去该部分洗。
28、脱液， 再以 15的乙醇， 以 0.8ml/min 的流速冲洗树脂柱， 收集 洗脱液， 得流分 3( 总有机酸 ) ； 再以 70乙醇， 以 0.8ml/min 的流速冲洗树脂柱， 收集洗脱 液， 得流分 4( 总黄酮 )。最后以 60乙醇进行洗脱， 得流分 5( 总皂苷和连翘苷 )。 0036 5) 将各流分浓缩、 干燥， 混合， 即得。经检测， 含总黄酮 29.03 ( 其中黄芩苷 占 89.60 )， 总皂苷 13.88， 总有机酸 28.04 ( 其中绿原酸和咖啡酸占 3.5 )， 糖类 12.79， 总氨基酸 0.96， 连翘苷 0.58。 0037 实施例 3 说 明 书 CN 1。
29、01843667 B4/11 页 7 0038 取实施例 1 组合物 300g 加 800ml 注射用水溶解， 加入 5药用炭， 用 40氢氧化 钠溶液调 pH 值至 7.0， 搅拌， 煮沸 15 分钟， 冷却， 加注射用水稀释至 1000ml， 搅拌 15 分钟， 经 0.22m 微孔滤膜过滤， 药液冷却至 30 50超滤， 超滤后的药液冷却至 30以下， 经 0.45m、 0.22m 滤芯过滤， 灌装、 灭菌、 包装， 得注射液。 0039 经检测， 注射液中黄芩苷含量为 7.02mg/ml， 连翘苷含量为 0.17mg/ml， 绿原酸和 咖啡酸含量为 0.21mg/ml。 0040 实施。
30、例 4 0041 取实施例 2 组合物 290g 加注射用水至 1000ml 溶解， 加入 5药用炭， 用 40氢氧 化钠溶液调pH值至7.0， 加热至沸并保持微沸15分钟， 冷却， 滤过， 灭菌， 滤过， 灌装， 冷冻干 燥， 压盖， 得冻干粉针剂。 0042 实施例 5 0043 取实施例1组合物450g加水适量溶解， 以40氢氧化钠溶液调pH值至7.0， 搅匀， 4-8冷藏 72 小时， 滤过， 滤液加入 200g 蔗糖， 搅拌使溶解， 或再加入香精适量， 调节 pH 值 至 7.0， 加水制成 1000ml， 搅匀， 静置 12 小时， 滤过， 灌装， 灭菌， 得口服液。 0044 实。
31、施例 6 0045 取实施例 1 组合物 2.25kg 加入 0.6kg 微晶纤维素、 45g 的羧甲基淀粉钠， 混匀， 制 成颗粒， 干燥， 加入 25g 的硬脂酸镁， 混匀， 压制成 1000 片， 包薄膜衣， 得片剂。 0046 实施例 7 0047 取实施例2组合物2.9kg加水溶解后调节pH值至7.0-7.5， 减压浓缩成稠膏， 低温 干燥， 粉碎 ； 另取 780g 半合成脂肪酸酯加热溶化， 温度保持在 402， 加入上述干膏粉， 混 匀， 浇模， 制成 1000 粒， 得栓剂。 0048 实施例 8 0049 取实施例 2 组合物 1.8kg 加入糊精等辅料适量， 混匀， 制成颗。
32、粒， 干燥， 制成 1000g( 无蔗糖 ) ； 或加入组合物重量的 3.5 倍蔗糖、 0.5 倍糊精等辅料适量， 混匀， 制成颗 粒， 干燥， 制成 2000g， 得颗粒剂。 0050 试验例 1 0051 本试验例在于研究本发明药物组合物各组分的检测方法 0052 一 ) 总黄酮 0053 1 仪器与试药 0054 1.1 仪器 紫外 - 可见分光光度仪 ； 电子天平 ； 水浴锅 ； 医用数控超声波清洗器。 0055 1.2 试药 黄芩苷对照品 ( 中国药品生物制品检定所 ) ； 0056 ZrOCL28H2O( 国药集团化学试剂有限公司 )， 甲醇 ( 分析纯 )， 水为超纯水。 005。
33、7 2 方法 0058 2.1 对照品溶液的制备 0059 取黄芩苷对照品适量， 精密称定， 加甲醇溶解并稀释至刻度， 制成 0.29mg/ml 的黄 芩苷对照品溶液， 即得。 0060 2.2 供试品溶液的制备 0061 精密吸取组合物样品水溶液 1ml 至 10ml 容量瓶中， 加水稀释定容， 摇匀， 即得。 0062 2.3 标准曲线的制备 说 明 书 CN 101843667 B5/11 页 8 0063 精密量取对照品溶液 1.5、 2.0、 2.5、 3.0、 3.5ml 置于 10ml 容量瓶中， 加入 2 ZrOCl28H2O 的甲醇溶液 1ml， 再用甲醇稀释至 10ml， 。
34、摇匀， 静置 1h 后， 照紫外 - 可见分光 光度法(中国药典一部附录VA)， 以相应的试剂做空白， 在424nm测定吸光度， 以吸光度为纵 坐标、 取样量为横坐标， 绘制标准曲线， 计算回归方程。 0064 2.4 测定法 0065 精密吸取供试品溶液 1ml， 照标准曲线项下的方法， 自 “置于 10ml 容量瓶中 .” 起， 依法测定吸光度。 0066 二 ) 总皂苷 0067 1 仪器与试药 0068 1.1 仪器紫外 - 可见分光光度仪 ； 电子天平 ； 水浴锅 ； 医用数控超声波清洗器。 0069 1.2试药齐墩果酸对照品(中国药品生物制品检定所) ； 香草醛(北京芳草医药化 工。
35、研制公司 )。 0070 2 方法 0071 2.1 供试品溶液的制备 0072 精密量取 2.0ml 组合物水溶液， 加适量水 (8ml) 后用正丁醇等体积萃取 5 次， 合并 萃取液， 减压蒸干， 甲醇溶解， 过滤， 置于 100ml 容量瓶中， 定容， 即得。 0073 2.2 对照品溶液的制备 0074 精密称取干燥 (105 ) 至恒重的齐墩果酸对照品 15.4mg， 置 10ml 容量瓶中， 加入 甲醇溶解， 摇匀， 定容 ； 精密吸取 1ml， 用甲醇定容至 10ml， 摇匀， 即得。 0075 2.3 标准曲线的制备 0076 分别精密吸取 0.2， 0.25， 0.35， 0。
36、.4， 0.5ml 对照品溶液， 分别置 10ml 具塞试管中， 水浴挥干溶剂， 依次加入 0.5ml 8香草醛乙醇溶液 ( 精密称取香草醛 0.8g， 加 10ml 无水 乙醇使溶解， 摇匀)和5.0ml72硫酸， 摇匀后置60恒温水浴1h， 随后立即取出， 置冰浴中 冷却 15min， 制成系列梯度溶液， 以 0.5ml 8香草醛乙醇溶液和 5.0ml72硫酸为空白对 照， 在536nm测定吸光度， 以吸光度为纵坐标(A)， 取样量为横坐标(C)， 绘制标准曲线， 计算 回归方程。 0077 2.4 测定法 0078 精密吸取供试品溶液2ml， 照标准曲线项下的方法， 自 “置10ml具塞。
37、试管中” 起， 依法测定。 0079 三 ) 总有机酸 0080 1 仪器与材料 0081 1.1 自动电位滴定仪 ； 电子天平 ； 医用数控超声波清洗器。 0082 1.2 试药乙酰水杨酸对照品 ( 中国药品生物制品检定所 ) ； 0.01mol/mlNaOH 滴定 液 ( 国家化学试剂质检中心 )， 甲醇 ( 分析纯 )， 水为超纯水。 0083 1.3 材料 001*1 型阳离子交换树脂 0084 2 方法与结果 0085 2.1 对照品溶液的配制 0086 称取乙酰水杨酸适量置 10ml 容量瓶中， 加 50甲醇溶解并稀释至刻度， 制成 4.01mg/ml 的对照品溶液， 即得。 说 。
38、明 书 CN 101843667 B6/11 页 9 0087 2.2 供试品溶液的制备 0088 精密量取药物组合物水溶液 5ml， 过预先处理好的 001*1 型强酸性阳离子交换树 脂柱 ( 柱体积约 10ml)， 继续用水洗脱， 流出液定容至 50ml， 摇匀， 即得。 0089 2.3 测定方法 0090 精密量取 5ml 供试品溶液置 100ml 滴定杯中， 加水 25ml， 置于自动电位滴定仪上， 用0.01mol/mlNaOH滴定液滴定， 以测量值mv-ml绘制标准曲线， 将结果用空白实验校正， 总 游离有机酸量按乙酰水杨酸计算， 每 1mlNaOH 滴定液 (0.01mol/m。
39、l) 相当于 1.699mg 乙酰水 杨酸。 0091 四 ) 糖类 0092 1 仪器与试药 0093 1.1 仪器高效液相色谱仪， 蒸发光散射检测器， 十万分之一电子天平， 医用数控超 声波清洗器， 超纯水处理系统。 0094 1.2 试剂乙腈 ( 色谱纯 )， 重蒸馏水。 0095 1.3 试药药物组合物水溶液， 果糖对照品、 葡萄糖对照品、 蔗糖对照品 ( 中国药品 生物制品检定所提供 )。 0096 2 色谱条件 0097 色谱柱 ： ALLtech GRACE prevail carbohydrate ES(2504.6mm， 5m) ； 柱温 ： 30 ； 流动相 ： 乙腈水 (。
40、75 25) ； 流速 ： 1.0ml/min ； 检测器温度 100， 气体流速 2.0L/ min。 0098 3 对照品溶液的制备精密称取果糖对照品 13.25mg、 D- 无水葡萄糖对照品 15.65mg、 蔗糖对照品 18.05mg， 置 50ml 量瓶中， 加 10乙腈适量溶解并稀释至刻度， 摇匀， 作为混合对照品溶液。 0099 4 供试品溶液的制备 取药物组合物水溶液作为供试品溶液。 0100 5 测定法 精密吸取上述对照品溶液 5l、 10l 和供试品溶液 2l、 10l， 注入 高效液相色谱仪， 记录色谱图， 计算样品的含量， 即得。 0101 五 ) 总氨基酸 0102 。
41、1 仪器与材料 0103 1.1 仪器 氨基酸自动分析仪 ； 电子天平 ； 0104 1.2 材料 氨基酸自动分析仪用缓冲液和茚三酮显色剂， 5 种缓冲液配比见表 1， 盐 酸为分析纯， 水为重蒸馏水 ； 混合氨基酸对照品溶液 ( 浓度为 0.2moLmL-1) 0105 表 1 氨基酸分析中缓冲液的配比 0106 0107 说 明 书 CN 101843667 B7/11 页 10 0108 2 方法 0109 2.1 色谱条件 0110 色谱柱 ： 阳离子交换树脂分析柱 (ID4.6mm60mm) ； 采用五种缓冲液梯度洗脱， 洗 脱程序见表 2， 洗脱液流速为 0.28mLmin-1； 。
42、茚三酮显色剂柱后衍生显色， 显色剂流速为 0.32mLmin-1； 检测波长 ： 570nm， 440nm( 针对脯氨酸和羟脯氨酸 )。进样量 ： 10l。 0111 表 2 洗脱程序 0112 0113 说 明 书 CN 101843667 B8/11 页 11 0114 2.2 总氨基酸供试品溶液的制备 0115 取药物组合物水溶液约 4ml， 精密称定， 置 5ml 水解管中， 加入 6molL-1盐酸溶液 5-6ml， 水解管充氮气， 密封， 放置 110加热块中水解 22 小时， 冷却至室温， 转移至 50ml 量 瓶中， 用适量水分次洗涤容器， 洗涤液并入量瓶中， 加水稀释至刻度，。
43、 摇匀， 滤过， 精密量取 续滤液 2ml， 置旋转蒸发瓶中反复蒸去盐酸， 残渣用水溶解并定容至 2ml， 作为供试品溶液。 0116 2.3 标准曲线制备 0117 分别精密吸取氨基酸混合对照品溶液 10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100l 进 样， 测定， 以对照品的量为横坐标， 峰面积为纵坐标， 绘制标准曲线， 计算回归方程。 0118 2.4 样品测定 0119 精密吸取总氨基酸供试品溶液 100l， 注入氨基酸分析仪， 记录色谱图， 即得。 0120 六 ) 绿原酸和咖啡酸 0121 1 仪器与试药 0122 1.1 仪器高效液相色谱仪， 十万。
44、分之一电子分子天平， 医用数控超声波清洗器， 超 纯水处理系统。 0123 1.2 试剂 甲醇 ( 色谱纯 )， 冰醋酸 ( 分析纯 )， 重蒸水。 0124 1.3 试药 绿原酸对照品、 咖啡酸对照品 ( 中国药品生物制品检定所提供 ) 0125 2 色谱条件 0126 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 ； 检测波长 ： 324nm ； 流动相 ： A 相为 1冰醋酸 (V/V)， B 相为甲醇， 洗脱程序如表 3 ； 理论板数按绿原酸峰计算应不低于 6000， 在咖啡酸色 谱峰之前应有三个色谱峰， 其中绿原酸与相邻的色谱峰分离度应达到 0.8 以上。 0127 表 3HPLC 梯度洗脱程序 。
45、0128 0129 3 方法 0130 3.1 对照品溶液的制备 0131 取绿原酸对照品， 咖啡酸对照品适量， 精密称定， 加水制成每 1ml 各含 40g、 30g 的混合溶液， 即得。 0132 3.2 供试品溶液的制备 0133 精密吸取药物组合物水溶液 2ml， 至 10ml 棕色量瓶中， 加水稀释至刻度， 摇匀， 即 说 明 书 CN 101843667 B9/11 页 12 得。 0134 3.3 测定法 0135 精密吸取上述供试品溶液与对照品溶液各 10l， 注入高效液相色谱仪， 测定， 即 得。 0136 七 ) 黄芩苷 0137 以甲醇 - 水 - 冰醋酸 (48 52 。
46、1) 为流动相， 检测波长为 276nm， 按高效液相色 谱法进行测定。 0138 八 ) 连翘苷 0139 以乙腈-水(2377)为流动相， 检测波长为277nm， 按高效液相色谱法进行测定。 0140 试验例 2 对小鼠流感病毒性肺炎的影响 0141 取小鼠按体重随机分为 4 组， 分别为感染对照组、 正常对照组、 市售样品组和实施 例 3 组。市售双黄连制剂样品组和实施例 3 组腹腔注射样品， 感染对照组和正常对照组均 给予相同药液容积的注射用水。除正常对照组外， 将小鼠用乙醚轻度麻醉， 以 15 个 LD50 流 感病毒液滴鼻感染， 每只 0.05ml。从感染前一天开始给药或水， 每天。
47、 2 次， 连续 5 天， 第 6 天称取小鼠体重后固定， 放血、 解剖， 摘取全肺称重， 逐个计算肺指数值， 并求出肺指数抑制 率， 结果见表 4。肺组织用 10甲醛固定， 乙醇系列脱水， 二甲苯透明， 石蜡包埋。切片厚度 4-5m， HE 染色， 普通光学显微镜观察肺组织形态学变化。按炎症细胞浸润程度分级标准， 对细胞进行计分， 并进行统计学处理， 进行组间 t 检验比较， 结果见表 5。 0142 表 4 双黄连注射液对流感病毒感染小鼠肺部炎症 ( 肺指数 ) 的影响 (n 10) 0143 组别 剂量 (g/kg 含生药 ) 肺指数值 (xs) 抑制率 ( ) 感染对照组 - 1.59。
48、0.14 - 正常对照组 - 1.020.09 - 市售样品组 20 1.380.11 13.27 实施例 3 组 20 1.360.20 13.85 0144 表 5 双黄连注射液对流感病毒感染小鼠肺部炎症 ( 病毒观察 ) 的影响 (n 10) 0145 组别 剂量 (g/kg 含生药 ) 肺指数值 (xs) 抑制率 ( ) 感染对照组 - 2.680.22 - 正常对照组 - 0.090.16 - 市售样品组 20 1.760.23 31.06 说 明 书 CN 101843667 B10/11 页 13 实施例 3 组 20 1.650.15 32.35 0146 由表 4 和表 5 结果可见， 感染后小鼠肺指数值明显增大， 实施例 3 组样品和市售组 样品在本试验条件下的剂量范围内对流感病毒感染小鼠引起的肺炎有明显的抑制作用， 肺 指数值。