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1、10申请公布号CN104073019A43申请公布日20141001CN104073019A21申请号201410309181622申请日20140701C09B23/06200601C12Q1/68200601G01N21/6420060171申请人浙江大学地址310058浙江省杭州市西湖区余杭塘路388号72发明人方维佳郑怡74专利代理机构浙江杭州金通专利事务所有限公司33100代理人黄芳54发明名称一种不对称菁染料化合物及应用57摘要本发明提供了一种不对称菁染料化合物I，及其作为淬灭剂的应用。本发明提供的不对称菁染料的荧光淬灭剂化合物，可有效淬灭650NM通道的荧光，同时可以对稳定DNA。
2、双链，使PCR过程中解链温度增加23，不但可以应用于常规的实时荧光定量PCR检测方法，而且可以有效地使用在针对单核苷酸多态性分析领域。51INTCL权利要求书1页说明书8页序列表2页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书8页序列表2页附图1页10申请公布号CN104073019ACN104073019A1/1页21一种不对称菁染料化合物，其结构如式I所示式I中R1为H、NO2、OH或C1C4烷基；R2为H、C1C4烷基、苯基或卤素取代苯基；R3、R4为H、C1C4烷基或活性基团，并且R3、R4中至少一个为活性基团。2如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所。
3、述活性基团为下列之一羧酸，羧酸的丁二酰亚胺酯，肼，胺，马来酰亚胺，亚磷酰胺。3如权利要求1所述的不对称菁染料化合物，其特征在于所述化合物为下列之一4权利要求1所述的不对称菁染料化合物作为荧光淬灭剂的应用。5如权利要求4所述的应用，其特征在于所述淬灭剂为650NM通道淬灭剂。权利要求书CN104073019A1/8页3一种不对称菁染料化合物及应用一技术领域0001本发明涉及一种不对称菁染料化合物，及其作为荧光淬灭剂尤其是650NM通道通道荧光淬灭剂的应用。二背景技术0002核酸杂交技术是分子生物学的基本技术之一，可以用来对遗传疾病进行诊断，人体鉴定，微生物鉴定，亲子鉴定，近年来正逐渐用于病毒的特。
4、异，敏感和快速诊断。0003核酸杂交技术一个很重要的方面是对杂交的探测，一个经常使用的工具是荧光寡核苷酸探针，一种特别有用的荧光探针类型是自淬灭探针，此探针包括了报告染料和淬灭染料，二者之间通过荧光共振能量转移FRET过程发生作用。尽管使用该基序的不同探针的设计可能在细节上存在差异，FRET探针含有连接到寡核苷酸上的荧光团和淬灭剂。0004实时荧光定量PCR技术通过检测PCR产物中荧光信号强度来达到定量的目的，该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已在动植物基因工程，微生物和医学领域中得到广泛应用。00。
5、05荧光染料广泛用于生物学研究和诊断，荧光染料优于常规的放射性材料，因为荧光染料通常具有足够的检测灵敏度，廉价并且无毒，具有可区分颜色范围的各种荧光团使得能平行检测多种生物学靶标的多重实验更加可行，在体外和体内描述不同生物学靶标之间在空间和时间上的关系常要求能平行显示多个靶标。此外，大量荧光染料为进行高通量和自动化试验打开了新的通道。而在基于DNA的FRET检测中，FAM以其完美匹配的光源，廉价的成本，高度的稳定性，较高的量子产率成为各种检测中最常用的报告染料，特别是在实时荧光定量PCR技术中的应用更加广泛。0006目前大部分淬灭基团为偶氮染料淬灭剂，即暗淬灭剂，这类淬灭剂不占据发射带宽，并且。
6、大部分能够多路复用。对上述暗淬灭剂的一种改进为BLACKHOLE淬灭剂，例如BHQ142硝基4甲基苯基偶氮基基2甲氧基5甲基苯基偶氮基苯胺为BIOSEARCHTECHNOLOGIES，INC，它能够淬灭可见光谱，这些非荧光常用作荧光受体的替代物，目的是为了降低背景荧光并以此提高灵敏度。0007然而，已知的非荧光淬灭剂的缺点是其淬灭功效不足，这导致了高背景信号，进而又导致了信号动力学特征受到限制。三发明内容0008本发明的目的是提供新的淬灭剂，其具有低背景信号和/或高淬灭功效。本发明提供一种不对称菁染料的荧光淬灭剂化合物，可有效淬灭650NM通道的荧光。0009本发明采用的技术方案是0010一种。
7、不对称菁染料化合物，其结构如式I所示0011说明书CN104073019A2/8页40012式I中0013R1为H、NO2、OH或C1C4烷基；0014R2为H、C1C4烷基、苯基或卤素取代苯基；0015R3、R4为H、C1C4烷基或活性基团，并且R3、R4中至少一个为活性基团。0016所述活性基团是指可以与其它化学基团反应而形成共价化学键的基团，在合适的反应条件下具有共价活性，是与其它底物连接的点，包括亲电、亲核和光活性基团。0017本发明化合物是具有化学活性和可以被至少一个活性基团取代的，活性基团的功能是作为连接其它部分的位点，此处活性基团与载体或者固相支撑物上的合适的活性基团进行化学反应。
8、。0018典型的，本发明化合物包含的活性基团，可以是丙烯酰胺，羧酸的活化酯，酰基叠氮，酰腈，醛，酮，烷基卤，烷基磺酸酯，酸酐，苯胺，氨基，芳基卤，叠氮，氮丙碇，硼酸酯，重氮烷，环氧化物，卤代乙酰胺，卤代三嗪，亚胺基酯，异氰酸酯，异硫氢酸酯，马来酰亚胺，亚磷酰胺，磺酸酯，磺酰氯，顺铂等。一般而言，活性基团为羧基，羧酸的丁二酰亚胺酯，肼，氨基或马来酰亚胺。0019本发明化合物至少含有一个活性基团选择性的与氨基反应，这个具有氨基反应活性的基团可以是琥珀酰亚胺酯，磺酰卤，四氟苯酯或异硫氰酸酯。因此，本发明化合物可以与样品中含有氨基的分子形成共价键。或者，本发明化合物也可以至少含有一个可以与硫醇基团反应。
9、的活性基团，具有硫醇基团反应活性的基团可以是马来酰亚胺，卤代烷或卤代乙酰胺酯。又或者，所述活性基团还可以是可以与羟基基团反应的基团，例如亚磷酰胺。0020优选的，所述活性基团为下列之一羧酸COOH，羧酸的丁二酰亚胺酯，肼NHNH2，氨NH2，马来酰亚胺，亚磷酰胺。0021所述化合物更优选为下列之一0022说明书CN104073019A3/8页50023合成本发明不对称箐染料化合物的通用方法如下式所述其中用R5表示00240025具体方法如下季胺化的苯并噻唑衍生物III与4甲基喹啉季胺盐例如化合物II，在吡啶中回流，反应完毕后，将DMF倒入搅拌的水中，加入盐酸酸化，过滤，用稀盐说明书CN1040。
10、73019A4/8页6酸洗涤，干燥，即得。0026本发明化合物优选将羧基转化为其活性形式，例如琥珀酰亚胺酯与氨基反应。例如染料I2，I3溶解在DMF中加入2琥珀酰亚胺基1，1，3，3四甲基脲四氟硼酸酯与DIEA产品用稀盐酸析出，洗涤然后干燥。0027在具体的使用中，带有活性基团例如琥珀酰亚胺酯的本发明化合物与经过氨基改性的寡核苷酸经标准固相寡核苷酸步骤合成并脱掉氨基保护在DMF中，加入弱碱例如NET3，DIEA等反应30MIN1H后用乙醇沉淀寡核苷酸，洗涤出去多余的本发明化合物，然后对标记上本发明化合物的寡核苷酸进行纯化，即得到荧光寡核苷酸探针。0028本发明还涉及所述的不对称菁染料化合物作为。
11、荧光淬灭剂的应用。0029优选的，所述淬灭剂为650NM通道淬灭剂。本发明化合物可有效淬灭650NM通道如LIZDYE等的荧光，同时可以对稳定DNA双链，使PCR过程中解链温度增加，即TM值升高，提示其在荧光定量PCR分子检测领域将有较好的应用前景。0030本发明的有益效果主要体现在本发明提供的不对称菁染料的荧光淬灭剂化合物，可有效淬灭650通道的荧光，同时可以对稳定DNA双链，使PCR过程中解链温度增加23，不但可以应用于常规的实时荧光定量PCR检测方法，而且可以有效地使用在针对单核苷酸多态性分析领域。四附图说明0031图1为实施例9扩增的实时荧光曲线FLUORESCENCEHISTORY图。
12、；1为不加淬灭基团的CY5荧光基团，2为加入淬灭剂化合物I3的CY5荧光基团，3为加入淬灭基团BHQ2的CY5荧光基团，纵坐标为荧光值FLUORESCENCE，横坐标为循环数CYCLES。五具体实施方式0032下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此0033实施例1化合物III的合成003400352，3二甲基苯噻唑对甲苯磺酸盐180MG，052MMOL，二苯甲脒160MG，08MMOL和醋酸酐2ML回流30分钟，冷却后将其滴入乙醚中得到产品170MG。0036产物核磁数据1HNMR182S，3H，234S，3H，606M，1H，76M，1H，439S，3H，7。
13、586M，13H。0037实施例2化合物II的合成0038说明书CN104073019A5/8页700394甲基喹啉48ML，00363MOL与24溴甲基2硝基苯基丙酸甲酯根据NAOKIYAMAKAWAETAL，BIOORGANICMEDICINALCHEMISTRY19201132993311制备1644G，005445MOL混合，在110下反应过夜，冷却后，加入甲醇20ML溶解后悬蒸得到粘稠状固体，然后加入丙酮200ML搅拌，搅拌2H后有产物析出，过滤，干燥得到产品64G。0040产物核磁数据1HNMR151S，3H，266S，3H，36D，3H，37M，1H，595S，2H，7586M，。
14、9H。0041实施例3化合物I1的合成00420043化合物III60MG013MMOL与化合物II89MG，02MOL溶解在2ML吡啶中，加热回流30分钟后，反应结束后，旋蒸除去吡啶，剩余物倒入水中，滴加5盐酸，产物析出后进行过滤，将过滤得到的产物溶解在30ML11的甲醇和水中，加入80MG的氢氧化钠水解，水解后，再次滴入浓盐酸，产物析出后，过滤，干燥得最终产品。0044产物核磁数据1HNMR156M，3H，382M，1H，439S，3H，55M，3H，665M，1H，671M，1H，854M，1H，7386M，12H，0045实施例4化合物I2的合成00460047化合物I1367MG，0。
15、056MMOL溶解在05MLDMF中，加入005MLDIEA后加入TSTU34MG，012MMOL。混合物在室温下搅拌23H，TLC监控反应，反应结束后，加入2ML5HCL，析出物用稀盐酸洗涤过滤后干燥得产品35MG。0048核磁数据1HNMR。0049156M，3H，2，46M，4H，382M，1H，439S，3H，55M，3H，665M，1H，671M，1H，854M，1H，7386M，12H，0050实施例5化合物IV的合成0051说明书CN104073019A6/8页800522，3二甲基6硝基苯噻唑对甲苯磺酸盐189MG，052MMOL，二苯甲脒160MG，08MMOL和醋酸酐2ML。
16、回流30分钟，冷却后将其滴入乙醚中得到产品170MG。0053产物核磁数据1HNMR182S，3H，234S，3H，606M，1H，76M，1H，439S，3H，7586M，13H。0054实施例6化合物I3的合成00550056化合物IV71G0014MOL与化合物II633GG，001MOL溶解在20MLDMF100ML吡啶中，回30分钟后，反应结束后，旋蒸除去吡啶，剩余物倒入水中，滴加5盐酸，产物析出后进行过滤，将过滤得到的产物溶解在30ML11的甲醇和水中，加入56G的氢氧化钠水解，水解后，再次滴入浓盐酸使产物析出后，过滤，干燥后的产物取324MG，0056MMOL溶解在05MLDMF。
17、中，加入005MLDIEA后加入TSTU34MG，012MMOL。混合物在室温下搅拌23H，TLC监控反应，反应结束后，加入2ML5HCL，析出物用稀盐酸洗涤过滤后干燥得产品。0057产物核磁数据1HNMR156M，3H，2，46M，4H，382M，1H，439S，3H，55M，3H，665M，1H，671M，1H，854M，1H，7386M，11H。0058实施例7化合物I4的合成00590060100MG化合物I3溶解在10ML二甲基乙酰胺中，降温到0，加入100MG肼，反应化合物在0下搅拌1H，反应结束后真空下除去溶解，剩余物经柱层析纯化后得到产品。0061产物核磁数据1HNMR156M。
18、，3H，382M，1H，439S，3H，55M，3H，665M，1H，671M，1H，854M，1H，7386M，11H。0062实施例8化合物I5的合成0063说明书CN104073019A7/8页90064200MG化合物I3溶解在10ML二甲基乙酰胺中，降温到0，加入180MGN2氨基乙基马来酰亚胺三氟乙酸盐，然后加入02ML三乙胺，反应混合物在0下搅拌1H后，真空蒸出溶剂，剩余物经柱层析得产品。0065产物核磁数据1HNMR156M，3H，346T，2H，373T，2H，382M，1H，439S，3H，55M，3H，665M，1H，671M，1H，694D，2H，854M，1H，738。
19、6M，11H。0066实施例9验证淬灭基团作用0067选取一套工作正常的探针标记CY5荧光基团，一条合成时加入淬灭剂化合物I3，一套合成时不加入淬灭基团，一套合成时加入BHQ3淬灭基团，具体序列如下0068INFAFP5GACCRATCYTGTCACCTCTGAC30069INFARP5AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA30070INFAP15CY5TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCAC30071INFAP25CY5TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCAC化合物I330072INFAP35CY5TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACBHQ330073然后使用。
20、同样的试剂，同样的流感病毒核酸模板、同样的扩增程序进行PCR反应。0074PCR反应液配制25L反应体系0075试剂组分初始浓度加入量L终浓度RTREACTIONBUFFER75ENZYMEMIX51FP上游引物10PM1400NMRP下游引物10PM1400NMINFAP1、INFAP2或INFAP3探针10PM05200NM待检样品15L5COPIES100NGDDH2O补至25L体积0076PCR反应条件HRRTPCRMASTERMIX0077说明书CN104073019A8/8页100078由图可见，由于INFAP1探针未加入淬灭基团，CY5荧光不能被淬灭，所以荧光背景很高，在扩增时没有扩增信号，而加入本发明淬灭基团的INFAP2探针和加入BHQ3淬灭基团的INFAP3，CY5荧光被淬灭基团淬灭，在反应开始时荧光背景很低，随着PCR扩增的进行，探针被酶切后不能被淬灭基团淬灭，荧光慢慢释放出来，就有了明显的扩增曲线，而本发明淬灭基团的淬灭效果较BHQ3好，故背景更低。说明书CN104073019A101/2页1100010002序列表CN104073019A112/2页12序列表CN104073019A121/1页13图1说明书附图CN104073019A13。