技术领域
本发明涉及一种治疗乙肝的中药冻干粉针制剂及其制备方法，属于中 药新药研发领域。
背景技术
乙型病毒性肝炎是世界范围内一种常见和多发的传染性疾病，严重威 胁着人类健康。据世界卫生组织统计，全世界有2亿多人处于慢性乙肝病 毒携带状态，其中70％为亚洲华人。目前，用于治疗病毒性肝炎的药物， 全世界估计达600种以上，但至今无疗效令人满意者，主要原因是药物的 副作用与肝炎的复发这两个问题难以解决。因此研制一种有效、安全、质 量可控的乙肝治疗药物为医药界普遍关注的问题。
胡黄连始载于《新修本草》，言其“主骨蒸劳热，补肝胆，明目，治冷 热泄痢，益颜色，厚肠胃，治妇人胎蒸虚惊，治三消五痔，大人五心烦热。 解巴豆毒。以人乳浸点目甚良。”既清虚热，又清湿热、血热、疳热。国内 外药理试验表明，胡黄连提取物不仅可明显的抑制广泛的肝炎病毒，降低 血脂作用，还有较强的保肝利胆作用。实验研究发现，胡黄连提取物有增 加肝细胞生存率，降低血中AST、ALT等酶活性，促进肝脏核酶和蛋白质的 合成等作用，对湿热熏蒸证的患者疗效尤为显著。可见，胡黄连可祛邪以 扶正，具有清热利湿，除骨蒸劳热，补肝利胆的功效，是一味标本兼治的 良药。
有文献报道从胡黄连中提取的胡黄连环烯醚萜总苷类成分是胡黄连中 保肝降酶、抑制乙肝病毒的主要有效物质，特别适用于治疗急性乙型肝炎。 这就需要快速发挥疗效的制剂，目前使用的注射剂型为液体，色泽较深， 经常出现色泽变深甚至混浊至沉淀，因此有效期短，冻干粉针剂则有效解 决溶液型注射剂稳定性差的问题，有效期长，运输方便。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种治疗乙肝的中药冻干粉针制剂， 具体涉及胡黄连环烯醚萜总苷冻干粉针剂及其制备方法。
本发明为固体状态，含水量低，同时在抽真空中进行干燥，且干燥后 回充氮气，不易氧化，稳定性高，有利于长期贮存，有效期长，可以加入 适量的填充剂，使用更安全，产品外形完好，保存更持久，易于储藏和运 输。本发明每支含胡黄连环烯醚萜总苷为94.5％～100％，所述的胡黄连环烯 醚萜总苷的纯度为90％以上，其中胡黄连苷-II的含量为80％以上。不加或 加入适量的填充剂。填充剂的选用不限于甘露醇、葡萄糖、氯化钠。填充 剂的最优用量为0～5％。加或不加抗氧剂，抗氧剂的选用不限于亚硫酸氢 钠、亚硫酸钠。抗氧剂的最优用量为0～0.5％。
本发明所述的胡黄连环烯醚萜总苷的制备方法可采用本领域已公开的 制备方法制备。
本发明所述的治疗乙肝的中药冻干粉针剂，其制备方法为胡黄连环烯 醚萜总苷、加或不加填充剂，加或不加抗氧剂，溶于适量的注射用水中， 过滤，滤液加补加注射用水至一定量，加入活性炭脱色出热源，继用0.45 μm、0.22μm微孔滤膜分级过滤除菌，分装至西林瓶中，冷冻干燥，回充 高纯度氮气，加塞扎盖，包装，即得。
对于本发明及其制备方法进行了必要的质量检测(澄明度检察、无菌 检查、热原检查、含量测定)和稳定性考察，实验结果见表1，表2。
表1 室温留样观察初步稳定性试验报告 项目 放置时间 0月 1月 2月 3月 6月 考察 项目 外观性状 浅黄白色或 类白色疏松 块 浅黄白色或 类白色疏松 块 浅黄白色或 类白色疏松 块 浅黄白色或 类白色疏松 块 浅黄白色或 类白色疏松 块 溶液颜色 微黄色 微黄色 微黄色 微黄色 微黄色 澄明度 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 水分 1.26 1.22 1.17 1.20 1.13 无菌 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 热原 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 溶血 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 刺激性 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 含量 苷-II (mg/支) 25.86 25.53 25.96 25.16 25.40 总苷(mg/ 支) 30.16 29.78 30.31 29.40 29.69
表2 加速试验报告 项目 放置时间 0月 1月 2月 3月 考 察 项 目 外观性状 浅黄白色或类 白色疏松块 浅黄白色或类 白色疏松块 浅黄白色或类 白色疏松块 浅黄白色或类 白色疏松块 溶液颜色 微黄色 微黄色 微黄色 微黄色 澄明度 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 水分 1.15 1.20 1.10 1.07 无菌 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 热原 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 溶血 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 刺激性 符合规定 符合规定 符合规定 符合规定 含 量 苷-II (mg/支) 25.33 25.89 25.85 25.68 总苷(mg/ 支) 29.59 30.13 30.16 29.96
试验结果表明本品在室温下及加速条件下稳定性均良好。
本发明人使用实施例1中方法制得的冻干粉针剂，完成了以下药效学 试验，试验证明：胡黄连环烯醚萜总苷冻干粉针剂具有较强的保肝降酶、 对抗乙肝病毒作用，动物试验疗效确切，主要药效学结果如下：
试验例1 胡黄连环烯醚萜总苷冻干粉针剂对CCl4致小鼠急性肝损伤的预防 保护作用
胡黄连环烯醚萜总苷冻干粉针剂小(3.75mg/kg)、中(7.5mg/kg)、大 (15mg/kg)三个剂量组给药两天后，应用0.12％的CCl4花生油溶液 0.1ml/10g造成小鼠急性肝损伤模型，造模后16小时摘眼球取血测血清 ALT、AST值。结果见表3，表4。
表3 胡黄连环烯醚萜总苷冻干粉针剂对小鼠CCl4急性肝损伤血清ALT的影响
( X±SD) 组别 剂量(mg/kg) n ALT(U/L) 正常对照组 模型对照组 阳性对照组 - - 40 10 10 10 51.14±10.41 942.28±509.30△△△ 404.24±232.47** 冻干 粉针 剂 小剂量组 中剂量组 大剂量组 3.75 7.5 15 10 10 10 458.16±363.61* 369.60±176.69** 245.40±193.85***
注：与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；
与正常组比较△△△P＜0.001。
表4 胡黄连环烯醚萜总苷冻干粉针剂对小鼠CCl4急性肝损伤血清AST的影
响( X±SD) 组别 剂量(mg/kg) n AST(U/L) 正常对照组 模型对照组 阳性对照组 - - 40 10 10 10 124.16±34.74 891.75±402.10△△△ 506.37±179.60* 冻干 粉针 剂 小剂量组 中剂量组 大剂量组 3.75 7.5 15 10 10 10 550.75±312.21* 448.84±223.69** 265.31±138.11***
注：与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；
与正常组比较△△△P＜0.001。
结果显示，胡黄连环烯醚萜总苷冻干粉针剂三个剂量组与模型组相比， ALT、AST值均有不同程度降低；提示胡黄连环烯醚萜总苷冻干粉针剂三个 剂量组对CCl4诱发的小鼠急性肝损伤有明显的预防保护作用。
试验例2 胡黄连环烯醚萜总苷冻干粉针剂对鸭乙型肝炎病毒的影响
1日龄北京鸭，静脉注射麻鸭DHBV-DNA阳性血清，建立鸭乙型肝炎动 物模型，应用阳性对照药阿昔洛韦及胡黄连环烯醚萜总苷冻干粉针剂三个 剂量(10mg/kg，20mg/kg，40mg/kg)静脉注射给药10天，于给药前(T0)、 给药第5天(T5)、第10天(T10)和停药后第3天(P3)采血，用斑点杂 交法测定鸭血清中DHBV-DNA水平；用ELISA方法检测血清DHBV前S表面 抗原(DHBpresAg)水平。研究结果见表5，表6。
表5 胡黄连环烯醚萜总苷冻干粉针剂注射给药对鸭血清DHBV-DNA的影响 实验 批次 组别 剂量 mg/kg 鸭数 鸭血清DHBV-DNA OD值( X±SD) T0 T5 T10 P3 1 生理盐水 阿昔洛韦 冻干粉针 100 10 20 40 12 12 12 12 12 0.596±0.214 0.281±0.213 0.28±0.242 0.243±0.219 0.249±0.097 0.607±0.201 0.067±0.049** 0.048±0.05** 0.041±0.045** 0.039±0.037*** 0.563±0.234 0.039±0.037** 0.158±0.227 0.071±0.104* 0.113±0.099** 0.46±0.242 0.106±0.128** 0.187±0.223 0.131±0.088 0.122±0.066*** 2 生理盐水 阿昔洛韦 冻干粉针 100 10 20 40 12 11 12 12 12 0.488±0.181 0.411±0.201 0.493±0.246 0.449±0.213 0.467±0.195 0.42±0.265 0.078±0.041*** 0.065±0.038*** 0.055±0.036*** 0.055±0.041*** 0.288±0.18 0.04±0.027*** 0.246±0.223* 0.207±0.111** 0.09±0.074*** 0.303±0.16 0.16±0.167* 0.38±0.265 0.247±0.207* 0.186±0.144** 3 生理盐水 阿昔洛韦 冻干粉针 100 10 20 40 12 12 12 12 12 0.526±0.173 0.544±0.184 0.371±0.201 0.418±0.137 0.543±0.173 0.553±0.232 0.118±0.046*** 0.098±0.079** 0.054±0.043*** 0.098±0.099*** 0.613±0.197 0.081±0.07*** 0.346±0.22 0.205±0.109** 0.141±0.111*** 0.534±0.226 0.215±0.181** 0.441±0.281 0.256±0.14* 0.268±0.125**
注：给药组给药第5、10天(T5、T10)和停药第3天(P3)鸭血清DHBV-DNA OD值与感染前(T0)OD值比 较，统计学采用成对t检验；*p＜0.05，**p＜0.01，***P＜0.001。
表6 胡黄连环烯醚萜总苷冻干粉针剂注射给药对鸭血清DHBpresAg的影响 实验 批次 组别 剂量 mg/kg 鸭数 鸭血清DHBpresAg OD值( X±SD) T0 T5 T10 P3 1 生理盐水 阿昔洛韦 冻干粉针 100 10 20 40 12 12 12 12 12 0.924±0.239 1.004±0.175 0.908±0.219 1.044±0.225 1.155±0.202 1.04±0.163 0.748±0.143** 0.727±0.168* 0.347±0.224*** 0.448±0.258*** 1.041±0.118 0.611±0.213*** 0.627±0.165** 0.54±0.342** 0.651±0.304** 1.027±0.119 0.72±0.275* 0.731±0.234 0.685±0.31* 0.671±0.305*** 2 生理盐水 阿昔洛韦 冻干粉针 100 10 20 40 12 11 12 12 12 1.326±0.198 1.318±0.201 1.143±0.258 1.244±0.256 1.371±0.215 1.351±0.183 1.021±0.2** 0.95±0.216 0.425±0.281*** 0.55±0.319*** 1.385±0.126 0.858±0.260*** 0.802±0.211** 0.656±0.419** 0.796±0.369** 1.362±0.137 0.911±0.295* 0.836±0.397 0.827±0.362* 0.818±0.363** 3 生理盐水 阿昔洛韦 冻干粉针 100 10 20 40 12 12 12 12 12 0.672±0.091 0.662±0.075 0.583±0.104 0.632±0.111 0.678±0.087 0.678±0.079 0.537±0.091** 0.510±0.102 0.252±0.149*** 0.31±0.159*** 0.705±0.051 0.444±0.127*** 0.461±0.152* 0.362±0.211** 0.436±0.184** 0.689±0.056 0.495±0.146* 0.5±0.132 0.441±0.168* 0.442±0.173**
注：给药组给药第5、10天(T5、T10)和停药第3天(P3)鸭血清DHBpresAg OD值与感染前(T0)OD值 比较，统计学采用成对t检验；*p＜0.05，**p＜0.01，***P＜0.001。
斑点杂交结果显示，胡黄连环烯醚萜总苷冻干粉针剂三个剂量组给药 后各时间点鸭血清DHBV-DNA OD值与给药前比较有不同程度下降(P＜0.001、 P＜0.01或P＜0.05)，对鸭血清DHBV-DNA的抑制率最高可达80％以上；表面 抗原检测结果显示，胡黄连环烯醚萜总苷冻干粉针剂各剂量组给药第5天、 第10天和停药后第3天的鸭血清DHBpresAg OD值与给药前比较有不同程 度下降(P＜0.001、P＜0.01或P＜0.05)；结果表明：胡黄连环烯醚萜总苷冻 干粉针剂注射给药对鸭乙型肝炎病毒有一定的抑制作用。
具体实施方式
发明人通过以下的实施例来进一步详细阐述本发明，但本发明不限于 此实施范围。
实施例1
取胡黄连环烯醚萜总苷30.0g，加入注射用水约2800ml，65℃水浴使 溶解，加入配制量1.5‰的活性炭(4.5g)，搅拌半小时，过滤，于滤器上 加水至3000ml，继以0.45μm、0.22μm微孔滤膜分级过滤，滤液以每瓶3ml 定量分装于10ml西林瓶中，冷冻干燥，回充高纯度氮气，加塞，轧盖，包 装，即得。
实施例2
取胡黄连环烯醚萜总苷30.0g，加入1％甘露醇，溶于65℃注射用水约 2800ml，加入配制量1.5‰的活性炭(4.5g)，搅拌半小时，过滤，于滤器 上加水至3000ml，继以0.45μm、0.22μm微孔滤膜分级过滤，滤液以每瓶 3ml定量分装于10ml西林瓶中，冷冻干燥，回充高纯度氮气，加塞，轧盖， 包装，即得。
实施例3
取胡黄连环烯醚萜总苷30.0g，加入0.9％NaCl、0.2％NaHSO3，溶于65 ℃注射用水约2800ml，加入配制量1.5‰的活性炭(4.5g)，搅拌半小时， 过滤，于滤器上加水至3000ml，继以0.45μm、0.22μm微孔滤膜分级过滤， 滤液以每瓶3ml定量分装于10ml西林瓶中，冷冻干燥，回充高纯度氮气， 加塞，轧盖，包装，即得。
实施例4
取胡黄连环烯醚萜总苷30.0g，加入0.5％葡萄糖、0.2％NaHSO3，溶于 65℃注射用水约2800ml，加入配制量1.5‰的活性炭(4.5g)，搅拌半小时， 过滤，于滤器上加水至3000ml，继以0.45μm、0.22μm微孔滤膜分级过滤， 滤液以每瓶3ml定量分装于10ml西林瓶中，冷冻干燥，回充高纯度氮气， 加塞，轧盖，包装，即得。
实施例5
取胡黄连环烯醚萜总苷30.0g，加入0.5％葡萄糖、0.3％NaHSO3，溶于 65℃注射用水约2800ml，加入配制量1.5‰的活性炭(4.5g)，搅拌半小时， 过滤，于滤器上加水至3000ml，继以0.45μm、0.22μm微孔滤膜分级过滤， 滤液以每瓶3ml定量分装于10ml西林瓶中，冷冻干燥，回充高纯度氮气， 加塞，轧盖，包装，即得。