技术领域
本发明涉及植物繁殖技术领域。更具体地说，本发明涉及一种土沉香愈伤组织成苗的快速繁殖方法。
背景技术
土沉香(Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg)为瑞香科沉香属多年生常绿乔木，是我国特有珍贵的药用树种，其含树脂的木材即为2005版《中华人民共和国药典》中规定的中药沉香。沉香是名贵的理气中药。《本草纲目》记载为“性辛，微温无毒，有降气、纳肾、调中、平肝之效，为香窜冲动药”。并具有较高的经济价值及园林、绿化等生态价值。
土沉香只有在受到外界伤害或刺激时才会产生沉香,并且自然状态下结香率低。由于长期以来人为的掠夺式砍伐导致土沉香野生资源枯竭，土沉香在1987年已经被列为中国珍稀濒危三级保护植物，1999年被国务院列入国家二级重点保护野生植物。因此，通过人工栽培、优良品种选育以及组织培养等手段对土沉香野生资源进行保护已迫在眉睫。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种土沉香愈伤组织成苗的快速繁殖方法，通过对土沉香无芽茎段进行愈伤诱导，在短时间内培育出大量适合移栽的土沉香种苗，显著提高了土沉香种苗的增殖系数和种苗质量，可实现规模化生产，满足市场上对土沉香种苗的需求。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种土沉香愈伤组织成苗的快速繁殖方法，包括以下步骤：
步骤一、将土沉香无菌苗无芽茎段剪切成小段，得到外植体；
步骤二、将得到的外植体接种于愈伤组织诱导培养基，培养得愈伤组织，将得到的愈伤组织转接至丛生芽诱导培养基中，进而培养得丛生芽，将得到的丛生芽转接至生根培养基中，培养得完整带根植株；
步骤三、待完整带根植株表面角质形成后移栽到基质中培养数天后，移栽至大田培养。
优选的是，步骤二中愈伤组织培养过程在黑暗条件下进行，培养35天；
丛生芽培养过程在光照条件下进行，每日光照12h，控制温度为22～26℃，培养30天；
完整带根植株培养过程在光照条件下进行，每日光照12h，控制温度为22～26℃，培养30天。
优选的是，每升愈伤组织诱导培养基包含0.1～1.0mg的芸苔素内酯、0.1～1.0mg的激动素、0.01～0.05mg的萘乙酸、30mg的蔗糖和5mg的琼脂，其余为MS培养基。
优选的是，每升丛生芽诱导培养基包含0.1～0.5mg的噻苯隆、0.5～2.0mg的赤霉素、0.1～0.5mg的激动素、30mg的蔗糖和5mg的琼脂，其余为MS培养基。
优选的是，每升生根培养基包含0.1～0.5mg的NAA、10mg的蔗糖和5mg的琼脂，其余为MS培养基。
优选的是，步骤三的具体过程为：
向所述生根培养基中加入少量自来水，敞口放置2～4天，待所述完整带根植株表面角质形成后，洗净其根部的生根培养基得幼苗，将所述幼苗移栽到基质中培养30天后再移栽至大田培养。
优选的是，所述外植体的长度为1cm。
本发明至少包括以下有益效果：
通过采取外植体选择、愈伤组织的诱导培养、愈伤组织的分化培养和炼苗与移栽等步骤，本发明有效解决了土沉香工厂化育苗的问题，具有培养时间短，繁殖系数高，成活率高，植株健壮等优点，可满足市场对土沉香种苗的需求。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
<实施例1>
一种土沉香愈伤组织成苗的快速繁殖方法，包括以下步骤：
步骤一、将土沉香无菌苗无芽茎段剪切成1cm长的小段，得到外植体；
步骤二、将步骤一中得到的外植体接种到愈伤组织诱导培养基中，于黑暗条件下培养35天得到愈伤组织，其中，所述愈伤组织诱导培养基包括：MS培养基、0.1mg/L芸苔素内酯、0.1mg/L激动素、0.01mg/L萘乙酸、30mg/L蔗糖和5mg/L琼脂；
步骤三、将步骤二中得到的愈伤组织转接至丛生芽诱导培养基中，于22℃、每日光照12h的光照条件下培养30天得丛生芽，其中，所述丛生芽诱导培养基包括：MS培养基、0.1mg/L噻苯隆、0.5mg/L赤霉素、0.1mg/L激动素、30mg/L蔗糖和5mg/L琼脂；
步骤四、将步骤三中得到的丛生芽转接至生根培养基中，于22～26℃、每日光照12h的光照条件下培养30天，得完整带根健壮植株，其中，所述生根培养基包括：MS培养基、0.1mg/L NAA、10mg/L蔗糖和5mg/L琼脂；
步骤五、向所述生根培养基中加入少量自来水，敞口放置2天，待完整带根健壮植株的表面角质形成后，将所述完整带根健壮植株取出，洗净其根部培养基得幼苗，将所述幼苗移栽到基质中培养30天后，再移栽到大田培养。
<实施例2>
一种土沉香愈伤组织成苗的快速繁殖方法，包括以下步骤：
步骤一、将土沉香无菌苗无芽茎段剪切成1cm长的小段，得到外植体；
步骤二、将步骤一中得到的外植体接种到愈伤组织诱导培养基中，于黑暗条件下培养35天得到愈伤组织，其中，所述愈伤组织诱导培养基包括：MS培养基、1.0mg/L芸苔素内酯、1.0mg/L激动素、0.05mg/L萘乙酸、30mg/L蔗糖和5mg/L琼脂；
步骤三、将步骤二中得到的愈伤组织转接至丛生芽诱导培养基中，于26℃、每日光照12h的光照条件下培养30天得丛生芽，其中，所述丛生芽诱导培养基包括：MS培养基、0.5mg/L噻苯隆、2.0mg/L赤霉素、0.5mg/L激动素、30mg/L蔗糖和5mg/L琼脂；
步骤四、将步骤三中得到的丛生芽转接至生根培养基中，于26℃、每日光照12h的光照条件下培养30天，得完整带根健壮植株，其中，所述生根培养基包括：MS培养基、0.5mg/L NAA、10mg/L蔗糖和5mg/L琼脂；
步骤五、向所述生根培养基中加入少量自来水，敞口放置4天，待完整带根健壮植株的表面角质形成后，将所述完整带根健壮植株取出，洗净其根部培养基得幼苗，将所述幼苗移栽到基质中培养30天后，再移栽到大田培养。
<实施例3>
一种土沉香愈伤组织成苗的快速繁殖方法，包括以下步骤：
步骤一、将土沉香无菌苗无芽茎段剪切成1cm长的小段，得到外植体；
步骤二、将步骤一中得到的外植体接种到愈伤组织诱导培养基中，于黑暗条件下培养35天得到愈伤组织，其中，所述愈伤组织诱导培养基包括：MS培养基、0.5mg/L芸苔素内酯、0.5mg/L激动素、0.03mg/L萘乙酸、30mg/L蔗糖和5mg/L琼脂；
步骤三、将步骤二中得到的愈伤组织转接至丛生芽诱导培养基中，于24℃、每日光照12h的光照条件下培养30天得丛生芽，其中，所述丛生芽诱导培养基包括：MS培养基、0.3mg/L噻苯隆、1.2mg/L赤霉素、0.3mg/L激动素、30mg/L蔗糖和5mg/L琼脂；
步骤四、将步骤三中得到的丛生芽转接至生根培养基中，于24℃、每日光照12h的光照条件下培养30天，得完整带根健壮植株，其中，所述生根培养基包括：MS培养基、0.3mg/L NAA、10mg/L蔗糖和5mg/L琼脂；
步骤五、向所述生根培养基中加入少量自来水，敞口放置3天，待完整带根健壮植株的表面角质形成后，将所述完整带根健壮植株取出，洗净其根部培养基得幼苗，将所述幼苗移栽到基质中培养30天后，再移栽到大田培养。
<对比例1>
一种土沉香愈伤组织成苗的快速繁殖方法，其过程与实施例3基本相同，不同之处在于：步骤一中选用土沉香无菌苗带芽茎段剪切成1cm长的小段，每段包含一芽，得到外植体。
<对比例2>
一种土沉香愈伤组织成苗的快速繁殖方法，其过程与实施例3基本相同，不同之处在于：步骤一中选用土沉香无菌苗叶片剪切成1×1cm的小块，得到外植体。
将实施例1、实施例2、实施例3和对比例1、对比例2的丛生芽增殖系数、生根率和移栽成活率进行统计后得到结果，见表1。
表1、丛生芽增殖系数、生根率和移栽成活率对比表
丛生芽增殖系数是指单个茎段增殖生长产生的芽数，生根率是指单个茎段产生的丛生芽生根芽数占总芽数的比值，从表1不难看出，相比于采用带芽茎段或叶片碎片做外植体进行愈伤组织成苗培养，采用无芽茎段做外植体进行愈伤组织成苗培养在丛生芽增殖系数、生根率和移栽成活率上均有较大程度的提高。
<对比例3>
一种土沉香愈伤组织成苗的快速繁殖方法，其过程与实施例3基本相同，不同之处在于：所述愈伤组织诱导培养基中芸苔素内酯浓度为0.05mg/L、激动素浓度为0.05mg/L、萘乙酸浓度为0.005mg/L。
<对比例4>
一种土沉香愈伤组织成苗的快速繁殖方法，其过程与实施例3基本相同，不同之处在于：所述愈伤组织诱导培养基中芸苔素内酯浓度为1.5mg/L、激动素浓度为1.5mg/L、萘乙酸浓度为0.1mg/L。
将实施例1、实施例2、实施例3和对比例3、对比例4中每一例均采样100个，经过愈伤组织培养后，对愈伤组织的诱导率和生长速度进行统计，结果见表2。
表2、愈伤组织的诱导率和生长速度对比表
实施例1 实施例2 实施例3 对比例3 对比例4 诱导率 100％ 100％ 100％ 90％ 83％ 生长速度 很快 很快 很快 一般 慢
愈伤组织的诱导率是指外植体完全脱分化为愈伤组织的个数占采样总数的比例，生长速度是指外植体完全脱分化为愈伤组织需要的时间，从表2不难看出，愈伤组织诱导培养基中芸苔素内酯、激动素和萘乙酸三种成分的含量过高或过低均对愈伤组织的诱导率以及生长速度有负面影响。
<对比例5>
一种土沉香愈伤组织成苗的快速繁殖方法，，其过程与实施例3基本相同，不同之处在于：所述丛生芽诱导培养基中噻苯隆浓度为0.05mg/L、赤霉素浓度为0.25mg/L、激动素浓度为0.05mg/L。
<对比例6>
一种土沉香愈伤组织成苗的快速繁殖方法，，其过程与实施例3基本相同，不同之处在于：所述丛生芽诱导培养基中噻苯隆浓度为1.0mg/L、赤霉素浓度为3.0mg/L、激动素浓度为1.0mg/L。
将实施例1、实施例2、实施例3和对比例5、对比例6中每一例均采样100个，经过丛生芽诱导培养后，对丛生芽增殖系数进行统计并计算每一例的平均值，结果见表3。
表3、丛生芽增殖系数对比表
从表3不难看出，丛生芽诱导培养基中噻苯隆、赤霉素和激动素的浓度过低对诱导愈伤组织产生丛生芽的效果不强，而噻苯隆、赤霉素和激动素的浓度过高又会强烈抑制愈伤组织产生丛生芽。
<对比例7>
一种土沉香愈伤组织成苗的快速繁殖方法，，其过程与实施例3基本相同，不同之处在于：所述生根培养基中NAA的浓度为0.05mg/L。
<对比例8>
一种土沉香愈伤组织成苗的快速繁殖方法，，其过程与实施例3基本相同，不同之处在于：所述生根培养基中NAA的浓度为1.0mg/L。
将实施例1、实施例2、实施例3和对比例7、对比例8中每一例均采样100个，经过生根培养后，对生根率进行统计并计算每一例的平均值，结果见表4。
表4、生根率对比表
实施例1 实施例2 实施例3 对比例7 对比例8 生根率 100％ 100％ 100％ 70％ 40％
从表4不难看出，生根培养基中NAA的浓度过低不能有效促进丛生芽生根，而生根培养基中NAA的浓度过高又会抑制丛生芽生根。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。