发明领域
本发明总体涉及稳定FSH制剂的领域，具体地涉及稳定液体FSH制 剂的领域。通过加入盐，在优选的实施方案中，通过加入具有药用盐的碱 金属阳离子的盐，即Na-盐或K-盐或其组合来实现稳定。
背景
促性腺激素是这样的激素家族，其基本上主要涉及雌性和雄性中的生 育周期。促性腺激素可以来自尿液，用于研究和治疗目的，然而一些促性 腺激素也可以重组产生。
具体地，促性腺激素可以用于治疗不育。
本文涉及并且都属于相同糖蛋白家族的四种主要的促性腺激素是促 卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、黄体生成素(LH)和绒毛膜促性腺激 素(hCG)。所有这些促性腺激素由α和β亚基组成；α亚基是所有促性腺 激素共有的，即对于所有上述四种促性腺激素是相同，而β亚基则在每一 种中是不同的。
如上提及，促性腺激素是一组异源二聚糖蛋白激素，其调节雄性和雌 性中的性腺功能。它们包括促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)、促甲状 腺激素(TSH)和(人)绒毛膜促性腺激素(hCG)
FSH天然由垂体前叶分泌并且功能是支持卵泡发育和排卵。FSH包括 92个氨基酸α亚基(也是其他糖蛋白激素例如LH和hCG共有的)，和FSH 独有的111个氨基酸的β亚基，其赋予激素生物学特异性(Pierce和 Parsons，1981，Glycoprotein hormones：structure and function(糖蛋白激素： 结构和功能)，Ann Rev Biochem.，50：465-495)。每个亚基通过加入复合碳水 化合物残基来翻译后修饰。两个亚基携带用于N-连接聚糖连接的两个位 点，α亚基在氨基酸52和78处而β亚基在氨基酸残基7和24处(Rathnam 和Saxena，(1975)Primary amino acid sequence of follicle-stimulating hormone from human pituitary glands.I.alpha subunit(来自人垂体的促卵泡 激素的一级氨基酸序列.I.α亚基)，J Biol Chem(生物化学杂志).250 (17)：6735-6746；Saxena和Rathnam，(1976)Amino acid sequence of the beta subunit of follicle-stimulating hormone from human pituitary glands(来自人 垂体的促卵泡激素的β亚基的氨基酸序列)，J Biol Chem(生物化学杂志). 251(4)：993-1005))。因此FSH被糖基化至约30质量％(Dias和Van Roey， (2001)Structural biology of human follitropin and its receptor(人促滤泡素及 其受体的结构生物学).Arch Med Res.32(6)：510-519；Fox等(2001) Three-dimensional structure of human follicle-stiumulating hormone(人促卵 泡激素的三维结构).Mol Endocrinol.15(3)，379-89).
从更年期后人尿液中纯化的FSH已经在不育治疗中使用了许多年；同 时在自然生殖中促进排卵并且提供卵母细胞用于辅助生殖技术。FSH的两 种重组形式，Gonal-F(Merck Serono)和Puregon(Schering-Plough)在90年 代中期是可获得的。这些都在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达(Howles， C.M.(1996)，genetic engineering of human FSH(Gonal-F))(人FSH(Gonal-F) 的遗传改造)，Hum Reprod(人类生殖).Update，2：172-191)。CG通常用于不 育治疗，因为该化合物具有LH活性。
人FSH和hCG都是由α亚基和β亚基组成的异源二聚体。在两种激 素中α亚基是相同的。β亚基赋予两种激素之间的差异。FSH的成熟β亚 基由111个氨基酸组成，而hCG的成熟β亚基由145个氨基酸组成，另外， FSH和hCGβ亚基的一级氨基酸序列在整个β链都是不同的。FSH和hCG 两者的β链都包含6个二硫键，然而由于它们不同的氨基酸序列，它们确 实在它们的更高级结构上不同，导致了带电、极性和疏水区域的不同折叠 和分布(Fox等(2001).Three dimensionalstructure of human follicle-stimulating hormone(人促卵泡激素的三维结构).Mol Endocrinol.15(3)，379-89)
尽管FSH和hCG的β亚基都是糖基化的，FSH的β亚基仅包含N-糖 基化(N-7和N-24)，而hCG的β亚基包含N-和O-糖基化 (N-13，N-30，O-121，O-127，O-132和O-138)。在hCG的β亚基中的额外糖 基化使得其比FSH的β亚基更疏水。β亚基提供受体相互作用的特异性。
CHO细胞通常用于制备药物重组蛋白。结构分析已经鉴定唾液酸仅 通过α2，3-连接相连。许多人糖蛋白包含唾液酸残基的α2，3-和α2，6-连接的 混合物。因此，使用CHO系统表达的重组蛋白在其末端唾液酸连接的类 型上与它们的天然对应物不同。
不育
在本发明的语境中，“不育”应该被限定为怀孕和生育后代的能力减 少或没有。能够怀孕但是重复流产的妇女也被认为是不育的。不育在专用 名词上也被定义为无避孕的规律性交一年怀孕失败。不育是由很多原因造 成的。研究已经显示半数多一点的不育病例是由女性疾病导致的。剩余的 由精液疾病以及不可解释的因素所导致。
目前存在治疗不育的一些可能性。
那些可能性是定时的性交，使用辅助生殖技术(ARTs)，子宫内膜异位、 纤维瘤和女性性功能障碍(FSD)的医药处理，以及外科手术来校正异常。
在辅助生殖技术中，使用刺激排卵的药物。在LH和hCG之后，FSH 是用于该用途的那些化合物之一。
对于施用，这些化合物的液体制剂是适合的。不幸的是，在过去已经 显示，加入液体制剂的防腐剂，具体地，苄醇(BA)、苯酚和间甲酚对于蛋 白施加去稳定的作用(Maa，Y.F.和Chung，C.H.1996，Aggregation of recombinant human growth hormone induced by phenolic compounds(由酚类 化合物诱导的重组人生长激素的聚集).Int.J.Pharm.140：155-168；Lam， X.M.，Patapoff，T.W.，和Nguyen，T.H.1997，The effect of benzyl alcohol on recombinant human interferon-gamma(苄醇对于重组人γ-干扰素的作用). Pharm.Res.14：725-729；Hoffmann，J.A.和Lu，J.2002，FSH and FSH variant formulations comprising benzyl alcohol as a preservative(包含苄醇作为防腐 剂的FSH和FSH变体).EP0974359B1，1-50)。
因此重要的是提供稳定的制剂，尤其鉴于待施用的FSH的剂量应该减 少解离或聚集形式副作用如免疫原性反应的风险(如果非天然FSH存在的 话)。然而由防腐剂导致的不稳定事件减少了在液体制剂中的活性促性腺激 素，即FSH的实际水平。
因此，本发明的目的是提供稳定的FSH制剂，尤其是液体制剂，以及 稳定它们的方法。
发明概述
本发明涉及使用用于稳定液体FSH制剂的包含药用碱金属阳离子的 盐以稳定液体FSH制剂。待稳定的液体制剂可以是含有或不含防腐剂的制 剂。
优选下述实施方案：
1.包含药用碱金属阳离子的盐用于稳定液体FSH制剂的用途，其中所 述盐选自由药用Na+盐和K+盐或其组合组成的组。
2.根据项目1的用途，其中所述盐是Na+盐。
3.根据项目1或2任一项的用途，其中所述盐是NaCl或Na2SO4。
4.根据项目1或2任一项的用途，其中所述盐是Na2SO4。
5.根据项目1或2任一项的用途，其中所述盐是NaCl和Na2SO4的组 合。
6.根据项目1-5中任一项的用途，其中以20-500mM的量，或30-300 mM的量或50-200mM的量包含所述盐。
7.根据项目1-6中任一项的用途，其中所述FSH制剂是rFSH制剂。
8.根据项目1-7中任一项的用途，其中所述制剂还包含防腐剂。
9.根据项目8的用途，其中所述制剂包含苄醇、苯酚和/或间甲酚。
10.根据项目1-9中任一项的用途，其中所述制剂是可注射制剂。
11.用于稳定液体FSH制剂的方法，其中所述方法包括将包含药用碱 金属阳离子的盐加入所述制剂中的步骤，其中所述盐选自由Na+盐和K+盐或其组合组成的组。
12.根据项目11的方法，其中所述盐如上述2-6定义。
13.根据项目11和/或12的方法，其中所述待稳定的FSH是rFSH。
14.根据项目11-13中任一项的方法，其中所述制剂还包含防腐剂。
15.根据项目14所述的方法，其中所述防腐剂选自由苄醇、苯酚和间 甲酚组成的组。
16.根据项目1-10中任一项的用途，其中所述液体制剂是重构的液体 制剂，其获自冻干的制剂。
17.项目11-15中任一项的方法，其中所述加入盐的步骤在冻干步骤之 前进行。
18.项目17的方法，其中重构步骤在所述冻干步骤之后进行。
19.项目17和/或项目18的方法，其中所述盐包含在冻干制剂中或其 中所述盐包含在重构液体中。
提供有稳定盐的制剂因此是以冻干状态贮存的备选实施方案。冻干以 本领域技术人员通常所知的方式进行。接着可以贮存冻干制剂直到最终用 于患者。在施用前，接着将冻干制剂与任一种已知的重构介质，例如无菌 水重构。盐包含在冻干制剂中或包含在重构液体中。
20.上述项目中任一项的用途或方法，其中所述液体制剂是单次用制剂 或多剂量制剂，优选地用于注射。
在优选的实施方案中，盐包含在液体中，所述液体制剂本身不是冻干 的而是在贮存中作为液体保存。
具体地，在优选的实施方案中，本发明涉及液体FSH制剂的稳定，其 中所述碱金属阳离子选自由Na+和K+组成的组。特别优选的，所述盐是 NaCl或Na2SO4。
如上所述，液体FSH制剂适合用于治疗不育。在该方面，清楚的是， 液体FSH制剂可以是不稳定的；对于包括用于单次使用的那些在内的所有 液体FSH制剂，这是真实的。如果液体FSH制剂包括防腐剂(例如这对于 所有多剂量制剂是必须的)，那么不稳定性甚至可能是更显著的。该防腐剂 可以是每一种用于保存FSH制剂的防腐剂，因此，防腐剂可以是由FDA 批准的用于FSH制剂的防腐剂，具体地，例如批准用于肠胃外FSH制剂 的FDA批准的防腐剂，如例如苄醇，苯酚和/或间甲酚；然而防腐剂绝不 限于那些实例。FSH的稳定性例如被苄醇、苯酚和/或间甲酚减少。
因此，本发明要求保护和描述的包含药用阳离子的盐用于稳定单次用 FSH制剂。
此外，本发明要求保护和描述的包含药用阳离子的盐，用于稳定多剂 量的FSH制剂；所述制剂不需要包含防腐剂但是也可以包含防腐剂。
加入本发明要求保护的包含药用阳离子的盐，即Na+和K+盐，稳定液 体FSH制剂。在特别优选的实施方案中，所述盐是药用盐。在单次用或多 剂量制剂中尤其在较长的贮存时间内实现稳定，并且在又一个可能的实施 方案中，作为防腐剂(如苄醇、苯酚和/或间甲酚)的去稳定作用的反措施可 以是有利的。
可以根据本发明使用的盐，在优选的实施方案中，包括NaCl或 Na2SO4。
优选地以20-500mM的量包含盐，甚至更优选地以30-300mM的量 包含盐；在特别优选的实施方案中，以50-200mM的量包含盐。
加入的盐的最大量被限于溶液摩尔渗透压浓度。为了使注射后的疼痛 最小，溶液应该优选是等渗的或至少不是高渗的。由于在溶液中所有赋形 剂都对摩尔渗透压浓度有贡献，所以可以加入溶液的盐的最大量依赖于其 它存在的成分的量。
优选以导致350mosmol/kg的最大摩尔渗透压浓度的量包含盐，甚至 更优选的以导致320mosmol/kg的最大摩尔渗透压浓度的量包含盐；在特 别优选的实施方案中，以导致300mosmol/kg的最大摩尔渗透压浓度的量 包含盐。
摩尔渗透压浓度理论
摩尔渗透压浓度是一种实用手段，其给出对存在于溶液中的各种溶质 对溶液渗透压的贡献的全面测量。摩尔渗透压浓度可以根据Ph.Eur.2.2.35， 第7版，增刊2011(7，2)，Osmolality(摩尔渗透压浓度)，01/2008：20235进行 测量。
在本发明的语境中，“盐”是通过用金属或带正电的原子团完全或部 分取代氢而从酸衍生的化学化合物。
“具有(或包含)药用盐的阳离子的盐”的定义指所有那些与根据FDA 无活性成分列表批准用于肌内或皮下递送的阳离子形成的盐；该组的碱金 属阳离子是钠(Na+)和钾(K+)。
发明人已经令人惊奇地发现两个非常特异性的阳离子特别适合于稳 定FSH制剂。
盐可以因此与下述药用阳离子形成：钾(一元、二元或三元)，或钠(一 元、二元或三元)。优选地，所述盐是钠盐。
特别优选的是NaCl和Na2SO4。
可以根据本发明稳定的促性腺激素是FSH，即促卵泡激素，其任选与 其他活性成分组合。
FSH是来源与尿或血浆的FSH或重组FSH(rFSH)。在优选的实施方 案中，所述FSH是尿FSH或rFSH；特别优选的是rFSH。
如上提及，现在可以重组产生FSH。因此，本文提及的FSH一般总 是包括尿液来源的促性腺激素以及重组促性腺激素。因此，本文提及的 FSH还包括rFSH。
在本发明的优选实施方案中，所述制剂是液体rFSH制剂，最优选是 可注射的，其通过Na2SO4或NaCl稳定。
在本发明的优选实施方案中，所述制剂是液体rFSH制剂，最优选是 可注射的，其通过Na2SO4或NaCl稳定。
在备选实施方案中，所有实施方案的rFSH是长效的FSH。可以如本 领域技术人员公知(例如，通过修饰FSH分子或通过修饰所述制剂)获得长 效FSH制剂。
因此，此处的FSH涵盖所有可能的尿液来源的或重组形式的上述FSH 以及FSH形式所有可能的组合。还包含用于单次用的制剂以及一种或多种 用于多剂量用途的其他制剂(相同或不同促性腺激素的)。
一种可能的产品可以是包含FSH(任选地具有CG、LH、LH活性等) 的制剂，都在不同的瓶中。LH活性(如果存在)可以来自LH或CG。LH可 以被等效剂量的CG代替并且反之亦然；在该语境中，“等效剂量”可以 基于Pharmacopeia Van Hell Bioassay(Van Hell，H等，Acta Endocrin.47， 409-418，1964)中的1IU的CG等价于5-7IU的LH来进行计算。
优选的组合是(r)FSH、(r)LH和(r)hCG的组合，都在不同的瓶中。
在不同瓶中的可能的组合也包括：尿液(u)FSH和uhCG或uFSH和 uLH；其他的(rhCG或rLH或rFSH)和(uhCG或uLH或rhCG或rLH)，及 其所有可能的排列。
另外优选的组合是(r)FSH和(r)hCG的组合，其分别在不同的瓶中。
另外优选的组合是(r)FSH和(r)LH的组合，其分别在不同的瓶中。
本发明的FSH制剂是液体制剂。
优选地，所述制剂是可注射的。制剂可以作为这样的产品供应，所述 产品具有一种、两种或多种包含FSH或FSH/hCG的药物组合物，其用于 单独或在一起施用。如果单独施用，施用可以是顺序进行的。所述产品可 以以任何适合的包装供应。例如，产品可以包含许多预先填充的注射器， 其各自包含FSH(FSH组合物)，或另外还包含hCG(hCG组合物)，例如， 其中所述注射器可以以泡罩包装或其他方式包装以维持无菌。产品可以任 选地包含使用FSH制剂的说明书。根据另一个方面，本发明的FSH制剂 作为多剂量制剂提供。然而，本发明也明确地涉及用于单次使用的制剂。 本发明还涉及作为试剂盒的一部分的制剂的稳定。所述试剂盒将包含至少 一个包含一个或多个日剂量的FSH的容器；或例如两个容器(例如，小瓶)， 其各自包含不同的促性腺激素；以及例如另外的说明书(例如，用于施用的) 和例如用于注射的其他工具。在优选的实施方案中，使用用于多次注射的 注射笔，其中FSH溶液被填充在各个药筒中。
在优选的实施方案中，以35-850IU/ml，优选地50-800IU/ml，甚至 更优选地100-600IU/ml包含FSH。
用于例如600IU/ml rFSH的特别优选的制剂具有下述组成：
600IU/ml rFSH
0.001-0.05，优选为0.005mg/ml聚山梨醇酯20
0.1-10，优选为1.0mg/ml L-甲硫氨酸
0.5-50，优选为5.0mg/ml苯酚
1-100，优选为14mg/ml硫酸二钠(即0.1M)
0.1-10，优选为1mM磷酸钠缓冲液，(pH6-8，优选为pH6.5)。
所述溶液摩尔渗透压浓度优选为300mosmol/kg
(pH指整个溶液的pH。)
可注射贮存(depot)形式可以通过在可生物降解聚合物中形成FSH(和 其它药剂，如果存在的话)的微囊基质来进行制备。基于聚合物的贮存形式 /持续释放系统可以(取决于它们的化学性质)例如是微颗粒或纳米颗粒、水 凝胶、胶束、乳状液或植入物。取决于FSH与聚合物的比率和使用的特定 聚合物的性质，可以控制FSH释放的速率。可生物降解的聚合物的实例包 括聚交酯/聚乙交酯共聚物系统、聚乙烯吡咯烷酮、聚(原酸酯)、聚(酸酐)、 聚(乙二醇)、聚氨基酸、多糖例如透明质酸钠(NaHA)或其其他的盐、明胶、 脱乙酰壳多糖等。可以对所有提及的聚合物进行衍生化或修饰从而使蛋白 药物递送或其稳定性最优化。贮存可注射制剂也可以通过将FSH包埋在液 体系统，或聚合物脂质混合物如胶束、脂质体或微乳(其与体组织可相容) 中来进行制备。
可以例如通过经由细菌过滤器过滤的方式，或通过掺入无菌固体组合 物(其可以在使用前溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射介质中)形式的 杀菌剂对可注射制剂进行灭菌。可注射的制剂可以在如上所述的任何适合 的容器，例如小瓶、预先填充的注射器、注射药筒等中供应。
可以根据本领域的常规实践来调整药物组合物中的各种成分的pH和 精确浓度。见GOODMAN和GILMAN的THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES(治疗剂的药理学基础)，第7版。在优选的 实施方案中，本发明的组合物可以作为肠胃外施用的组合物进行供应。本 领域中已知用于制备肠胃外制剂的一般方法并且在REMINGTON；THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY(雷明顿：药物科学和实践)， 见上文，在780-820页中描述。肠胃外组合物可以在液体制剂中或作为固 体供应，所述固体可以在施用前与无菌可注射的介质混合。在尤其优选的 实施方案中，以易于施用和剂量均一性的剂量单位形式供应肠胃外组合 物。
本发明的FSH可以通过常规方式从尿液中获得或可以重组制备。对 于可能的生产方法，还参考例如WO2009/127826。
hCG可以通过本领域任何已知的方式获得。当用于本文时hCG包括 人来源的hCG和重组hCG。人来源的hCG可以通过本领域任何已知的方 法从任何适合的来源(例如尿液和胎盘)纯化。表达和纯化重组hCG的方法 是本领域公知的。
LH可以通过本领域任何已知的方式获得。当用于本文时，LH包括人 来源的LH和重组LH。人来源的LH可以通过本领域任何已知的方法从任 何适合的来源(例如，尿液)中纯化。表达和纯化重组LH的方法是本领域 已知的。
药物组合物可以用于治疗不育，例如用于例如辅助生殖技术(ARTs)， 诱导排卵(OI)或子宫内授精(IUI)。药物组合物可以例如用于其中使用已知 FSH制剂的医疗适应症。本发明还提供本文描述的稳定的FSH制剂(根据 本发明的方面)用于治疗不育的用途，或在制备用于治疗不育的药物中的用 途。可以将药物组合物配制为已知的组合物，其用于任何途径的药物施用， 例如口腔、直肠、肠胃外、透皮(例如贴片技术)、静脉内、肌肉内、皮下、 脑池内、阴道内、腹膜内、局部(粉末、膏剂或滴剂)或作为颊含或鼻喷雾 剂。典型的组合物包含药用载体，如水溶液、非毒性赋形剂，包括盐和防 腐剂，缓冲剂等，特别如在Remington′s Pharmaceutical Sciences fifteenth edition(雷明顿药物科学第15版)(Matt出版公司，1975)，在1405-1412页 和第1461-87页，和national formulary(国家处方集)XIV，第14版(American Pharmaceutical Association(美国药物协会)，1975)中所述。
合适的水性和非水性药物载体、稀释剂、溶剂或赋形剂的实例包括水、 乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、羧甲基纤维素及其合适的 混合物、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯如油酸乙酯。
所述组合物还可以包含添加剂如但不限于防腐剂、湿润剂、乳化剂、 缓冲剂和分散剂。可以包含抗细菌剂和抗真菌剂以防止微生物生长并且包 括例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。此外，包含张性剂 (tonicity agent)也是理想的。
在一些情形中，为了实现延长作用，需要延缓对来自皮下或肌内注射 的FSH(和其他活性成分，如果存在的话)的吸收。这可以通过使用具有较 差水溶性的晶体或无定形物质的液体混悬液来实现。那么例如FSH的吸收 速率取决于其解离的速率，这又可以取决于晶体大小和晶体形式。备选地， 肠胃外施用的FSH组合形式的延缓吸收通过将FSH组合溶解或悬浮在油 性赋形剂中来实现。
根据本发明，发明人努力研究某些化合物对液体促性腺激素制剂的稳 定性的作用；在此，研究了某些化合物的稳定以及去稳定作用。
术语″稳定性″可以指化学稳定性，包括在氨基酸序列中的共价修饰， 但是在蛋白稳定性的语境下，其还指物理稳定性，包括蛋白折叠状态(即天 然状态)的变化，不包括共价键裂解。
在本发明中，术语“稳定性”指促性腺激素，尤其是本发明的FSH的 制剂的物理稳定性。蛋白制剂的物理不稳定性可能由蛋白分子聚集形成高 级聚集体，通过异二聚体解离成单体，或通过任何其他构象变化(其减少包 含在本发明中的FSH蛋白的至少一种生物学活性)来导致。
“稳定的”溶液或制剂是这样的溶液或制剂，其中蛋白在其中的聚集、 解离、构象改变、生物学活性的损失等的程度可接受地被控制，并且不会 随时间不可接受地增加。稳定性可以通过本领域公知的方法评估，所述方 法包括测量样品的光散射，透明度和/或着色的视觉观察、吸光度或光密度、 分子大小确定(例如，通过大小排阻色谱法或场流分级法)、体外或体内生 物学活性和/或通过差示扫描量热法(DSC)。其他评估稳定性的方法是本领 域公知的，并且也可以根据本发明使用。
已知一些防腐剂对促性腺激素制剂具有显著的去稳定作用并且令人 惊奇地发现，盐，具体地包含在此显示为适于稳定液体FSH制剂的药用碱 金属阳离子(具体地Na+或K+)的盐，如NaCl或Na2SO4还适合用于抵消需 要被包含在用于医疗用途的液体多剂量FSH制剂中的防腐剂如苄醇、苯酚 和间甲酚的去稳定作用。本发明要求保护的盐对液体FSH制剂具有稳定作 用，其以有利的和令人惊奇的方式，比已知稳定剂，如例如蔗糖的稳定作 用甚至更显著。与已知稳定剂如蔗糖相比提高的稳定作用是特别令人惊奇 的。此外，相当出人意料地，本发明的盐可以显示关于FSH制剂的稳定作 用，而对于非常相似的hCG没有显示稳定作用。同样令人惊奇的是，观 察到的稳定作用并没有遵守所谓的Hofmeister系列(也见以下)，而是实 际上与它相反。
还从现有技术中已知在药物FSH制剂中存在FSH的降解并且这通过 第一组本发明的实施例证实。
FSH将作为时间的函数和温度的函数地降解。具体地，在室温以上的 温度，二级结构、三级结构和四级结构被改变。
看上去，在加热后发生的三级FSH结构和二级FSH结构的构象解折 叠是两-状态转变(当蛋白聚集受限时)。这种解折叠可以独立于亚基解离(四 级结构变化)。
此外，关于本发明清楚的是，包含防腐剂如苄醇或苯酚的FSH(其中 所述防腐剂是需要的，例如在液体FSH制剂中作为抗微生物剂)明显地以 不利方式影响FSH多剂量制剂的稳定性。在此，FSH的长效稳定性被降 低，FSH的变性温度降低，并且与不包含防腐剂的FSH制剂相比，已经 变性的形式具有更低水平的二级结构。
本发明还首次证明：包含用于稳定液体FSH制剂的药用碱金属阳离 子(即Na和K)的盐，对于液体FSH制剂的稳定性具有明显的作用。可以 证明的是，在包含这些盐的液体FSH制剂中的FSH的二级结构在加热到 76.5℃后不会显著改变。在存在例如Na2SO4时，变性形式是相对地构成 的，这使变性更加可逆，并且因此显著增加蛋白的动力学稳定性。这由目 前显示的实时稳定数据支持，所述数据显示对FSH的异二聚体结构的显著 的稳定作用。
结果清楚地表明本发明要求保护的盐，例如硫酸钠和氯化钠，可以限 制FSH分子解离的倾向并且因此显著增加贮存稳定性。
本发明还涉及用于稳定液体FSH制剂的方法，其中所述方法包括将 上述盐加入所述制剂中的步骤。
通过另外进行的实时数据来证实所有的研究。
附图简述
图1：显示在不同温度对于rFSH的作为波长(nm)函数的CD(圆二色谱， 见下)信号(mdegree)。观察到在24.0℃→45.9℃光谱之间没有显著的差异， 但是观察到在超过50℃CD-信号的温度-依赖性增加。将rFSH蛋白(0.93 mg/ml)溶解在3.57mM包含0.0036mg/ml聚山梨醇酯20的pH6.3的磷酸 盐缓冲液中。在24.0℃(粗实迹线)，50.3℃(虚迹线)，54.7℃(点迹线)， 59.0℃(虚-点迹线)，63.4℃(星)，67.8℃(菱形)和76.5℃(实迹线)扫描。
图2：显示在不同温度对于包含Na2SO4的rFSH的作为波长(nm)函数 的CD信号(mdegree)。观察到在24.0℃→45.9℃光谱之间没有显著的差 异。将rFSH蛋白溶解在3.57mM包含0.0036mg/ml聚山梨醇酯20和8.6 mg/ml的硫酸钠(Na2SO4)的pH6.3磷酸盐缓冲液中。在24.0℃(粗实迹线)， 50.3℃(虚迹线)，54.7℃(点迹线)，59.0℃(虚-点迹线)和76.5℃(实迹线)扫 描。
图3：显示在不同温度对于包含苄醇的rFSH的作为波长(nm)函数的 CD信号(mdegree)。观察到在24.0℃→45.9℃光谱之间没有显著的差异。 将rFSH蛋白(0.93mg/ml)溶解在3.57mM包含0.0036mg/ml聚山梨醇酯 20和0.17mg/ml苄醇的pH6.3磷酸盐缓冲液中。在24.0℃(粗实迹线)， 45.9℃(圆圈)，50.3℃(虚迹线)，54.7℃(点迹线)，59.0℃(虚-点迹线)，63.4℃ (星)，67.8℃(菱形)和76.5℃(实迹线)扫描。
图4：随后对hCG和rFSH进行DSC扫描。对于在0.005mg/ml聚山 梨醇酯20，0.5mg/ml L-甲硫氨酸，1mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)中的5mg/ml hCG和在0.005mg/ml聚山梨醇酯20，0.5mg/ml L-甲硫氨酸，0.24M NaCl， 1mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)中的2.4mg/ml rFSH的DSC数据。扫描速率 2.0℃/min。第一次rFSH扫描(实迹线)，第二次rFSH扫描(虚-点迹线)， 第一次hCG扫描(虚迹线)和第二次hCG扫描(点迹线)。在第一次扫描之后， 在第二次扫描之前，将样品冷却到20℃。
图5：具有不同的糖或盐的hCG的DSC扫描。在0.005mg/ml聚山梨 醇酯20，0.5mg/ml L-甲硫氨酸和1mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)中的5mg/ml hCG的DSC数据。没有加入糖或盐(粗实迹线)，0.1M Na2SO4(实迹线)， 0.1M NaCl(点迹线)，0.1M NaClO4(虚迹线)和0.1M蔗糖(虚-点迹线)。扫 描速率2.0℃/min。
图6：具有不同的糖和盐的rFSH的DSC扫描。在0.005mg/ml聚山 梨醇酯20，0.5mg/ml L-甲硫氨酸和1mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)中的2.4 mg/ml rFSH的DSC数据。没有加入糖或盐(粗实迹线)，0.1M Na2SO4(实 迹线)，0.1M NaCl(点迹线)，0.1M NaClO4(虚迹线)和0.1M蔗糖(虚-点迹 线)。扫描速率1.0℃/min。
本发明进一步通过下述实施例来解释，然而实施例将不被视为以任何 方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1-同步辐射圆二色光谱学(SRCD)
方法
通过使用在University ofAarhus，Denmark的同步加速器进行圆二色 光谱学。使用0.1mm路径长度石英suprasil池(Hellma GmbH，Germany)， 在180-270nm的波长范围内，在1nm步长中，记录所有的CD光谱，其 中停留时间为3秒/波长。对于rFSH和参比(对照剂)试验的每个实验试验 记录三次相同的CD扫描。通过从平均蛋白扫描中扣除平均的相应对照剂 扫描获得在本报道中呈现的rFSH的CD光谱。对于每一组CD扫描，使 用约120μl溶液(对应于约112μg rFSH)。
在研究温度对rFSH CD光谱的效应过程中，加热室中的温度以5℃ 的时间间隔从25℃到85℃变化，并且平衡时间为5分钟。从校准文件， 确定实际的实验温度(在石英suprasil池中的温度)。
CD测量由于结构不对称性发生的左圆极化光和右圆极化光吸收的差 异。可以通过CD光谱在远UV区域(约180-250nm)中研究蛋白的二级结 构。一般地，更有序的结构伴随更强烈的CD信号(正或负)。然而，不同 的二级结构具有不同的CD光谱，并且因为α-螺旋具有比β-结构更强的 CD信号，所以在待确定的不同蛋白之间不能对有序结构的程度进行直接 比较。
由于针对结构变化的高敏感性，当研究蛋白的物理稳定性时，CD光 谱是强有力的工具。通常，通过检测CD光谱来进行所述研究，所述CD 光谱作为外界因子例如温度、pH、变性剂，表面活性剂或稳定剂的浓度变 化的函数。在本发明的研究中，研究作为温度的函数的rFSH的CD光谱。 另外，还研究苄醇和硫酸钠(Na2SO4)对于rFSH二级结构的影响。
在该实施例和在实施例2和3中使用的促性腺激素是重组促卵泡激素 (rFSH)，其是使用重组DNA技术从人PER.细胞系表达的人激素。rFSH 是由两种糖基化单体：FSH、黄体生成素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG) 和促甲状腺激素(TSH)共有的92个氨基酸的α-亚基，以及对于FSH特异 的111个氨基酸的β-亚基组成的异二聚体蛋白。包含FSH的糖蛋白激素 都在非共价偶联的单体解离后失去它们的生物学活性。以前的结果已经说 明rFSH的不稳定性主要基于二聚体解离(四级结构的分解和伴随的免疫结 合反应的减少)。
取决于意欲的用途，目前市售的rFSH制剂以不同的浓度提供，范围 从37.5IU/ml(对于Gonal-f对应于约2.8μg/ml)到至少833IU/ml(对于 Puregon对应于约83.3μg/ml)。
在研究中使用的rFSH意欲用于液体药物产品制剂，对于皮下注射是 600IU rFSH/ml。由于所述产品的目的在于多剂量注射，所以添加防腐剂 是必须的。
通过混合不同成分的储液产生研究的制剂。蛋白和赋形剂的研究的浓 度间隔由于所用的方法而受到限制，即与赋形剂浓度比较，蛋白浓度需要 被保持得相对较高。由于芳香族化合物在研究的波长区域内的UV吸收， 苄醇浓度需要被保持得低。下面的表概括了三种不同的制剂，所述制剂由 本发明的发明人在第一次实验设计中进行检查。
表1
该表显示了用于温度对rFSH的影响的SRCD研究的三种制剂的含量。
样品1
在24℃到77℃之间的13个不同温度，记录rFSH、样品1(见表1) 的CD光谱。为了清楚，这些光谱中仅有7个显示在图1中。样品1，如 从表1中可推出的，既不包含盐也不包含防腐剂。在图1中显示光谱。结 果清楚地显示CD信号的强度作为温度的函数减少，说明在高温(＞50℃) 的二级结构的分解。在24.0℃→45.9℃光谱之间没有检测到明显的差异， 这显示在测量的时间阶段中(约20分钟)，在加热到约46℃后，蛋白的二 级结构是完整的。加热后FSH的SRCD光谱显示在约193nm的异二向色 点，对于样品2的光谱，这也被发现了，见图2。
样品2
记录包含Na2SO4的rFSH、样品2(见表1)的CD光谱。在24℃-77℃ 的13个不同温度获得的光谱，并显示在图2中。为了清楚，这些光谱中 仅有5个显示在图2中。结果显示作为温度的函数的二级结构的分解。数 据揭示，在加热到约46℃后(在实验的过程中)，样品2中的rFSH的二级 结构是完整的。重要的是，数据还显示在存在Na2SO4时，变性形式相对 地构成。
样品3
记录包含苄醇(BA)的rFSH、样品3(表1)的CD光谱。苄醇是一种抗 微生物防腐剂，其通常被选择用于FSH的液体制剂。由于与例如间甲酚相 比的相对较弱的防腐能力，BA必须以高浓度(约10-15mg/ml)使用。因为 意欲在多至1个月的时期内将rFSH用于多次注射，并且因为rFSH通常在 室温进行贮存，所以防腐剂是必须的。
在24℃-77℃之间的13个不同温度获得在0.17mg/ml BA存在下的 rFSH的光谱，并显示在图3中。为了清楚，这些光谱中仅8个在图3中 显示。由于苄醇的非常高的UV吸收(和伴随的低CD信号)，不能增加研 究的BA浓度，并因此甚至不能接近用于保存rFSH制剂的浓度。然而， 观察到BA的明显的去稳定作用。CD结果显示样品3中的rFSH的二级结 构在加热到42℃后是完整的，与样品1和2中的rFSH的开始变性温度相 比稍低。
另外，重要的是，数据显示与不存在防腐剂的FSH相比，变性形式 显著缺乏有序结构。
赋形剂对于温度诱导的结构变化的作用
在本文中用作本发明要求保护的盐的代表性实例的盐Na2SO4显示对 于温度变性蛋白的结构的明显影响。这明显是一个重要的发现。因为与天 然蛋白相比，变性(解折叠或部分解折叠)的蛋白更易于结合形成聚集体 (Fink，A.L.，1998，Fold Des.3(1)：R9-R23)，结果说明硫酸钠可以限制 rFSH分子变性的倾向并且因此限制聚集的风险并由此显著增加贮存稳定 性。另一方面，苄醇(BA)在高温诱导显著的结构分解。通过SRCD未检测 到有序的二级结构。观察到的BA的作用(解折叠程度更高的结构)可以 部分地解释在加入苄醇后在其它蛋白系统中发现的增加聚集(Maa，Y.和 Hsu，C.C.，1996，Int.J.Pharm.140：155-168；Zhang，Y.等，2004，J.Pharm. Sci.93(12)：3076-3089)。
然而，加入防腐剂对于开发多剂量制剂是关键的，并且从市场上存在 的rFSH产品已知，需要开发具有甚至相对更高含量的苄醇的更稳定的制 剂(含10mg/ml苄醇)。
发现苄醇降低rFSH的稳定性并且促进在加热后失去有序的二级结 构。然而，加入防腐剂是重要的。该研究显示，本发明要求保护的盐在加 热的rFSH制剂中增加有序结构的水平。因此，这些盐非常适合在液体rFSH 制剂中作为稳定剂，例如补偿苄醇或其他酚类防腐剂的效果。
实施例2-差示扫描量热法(DSC)
在该实施例中代表性使用的FSH与在实施例1中使用的相同。一般地， 蛋白的天然(生物活性)结构对于其周围环境，例如制剂的组成、容器系统、 pH和温度是非常敏感的。在本发明的实施例中，已经通过液体差示扫描 量热法(DSC)研究了rFSH变性温度，Tm。rFSH变性温度提供了蛋白在溶 液中稳定性的指示，其中更高的Tm显示更稳定的蛋白。
蛋白的三级结构和四级结构主要通过非共价相互作用稳定。因为在解 折叠过程中，许多的这些分子内相互作用被与水分子的非共价相互作用取 代，所以不同结构形式(即，天然和变性的)之间的热动力学平衡是精细的。 一般地，这意味着，天然蛋白的稳定性是受到限制的。许多蛋白在约70℃ 热解折叠。可以通过热动力学参数描述蛋白折叠或变性，所述热动力学参 数可以使用DSC进行直接研究和量化。因此，DSC是研究赋形剂对蛋白 稳定性作用的重要工具，并且因此是鉴定蛋白治疗剂的最优制剂的重要工 具。
液体差示扫描量热法(DSC)
理论
当在液体DSC中加热蛋白样品(即，增加样品温度)时，仅获得稍稍增 加的基线，但是当加热继续(即，温度持续增加)时，热由蛋白吸收导致其 在研究的蛋白的特征性温度范围内热解折叠。这产生吸热峰。在蛋白的解 折叠过程中，由于暴露了更疏水的链，围绕蛋白的水分子重新组织。当解 折叠完成时，热吸收减少并且形成了新的基线。
样品的热容量Cp的积分给出焓的变化ΔH，其与等式(1)的解折叠过程 相关。观察到的焓的变化来自吸热过程，如氢键的断裂和放热过程如在蛋 白和周围介质之间的氢键的形成。热转化的中点或转化中点，Tm(通常被 称为蛋白变性温度)，是当一半蛋白分子折叠，一半蛋白分子解折叠时的温 度。
ΔH = ∫ T 1 T 2 C p dT - - - ( 1 ) ]]>
来自DSC测量的原始数据，即作为温度的函数的热速率(以W表示) 可以容易地重新计算为偏摩尔热容量(以J/mol K表示)(已知所用的蛋白的 摩尔质量和浓度)。
测试方法
使用液体DSC，来自TA Instruments、装备了300μl双-毛细管池的 Nano DSC来测量蛋白变性温度Tm，并使用下述参数：
扫描速率：0.5-2.0℃/min，如果没有另外指出，使用1.0℃/min的扫 描速率(对于实施例4为2.0℃/min)
起始温度：20℃
最终温度：100℃
平衡：900s(或对于实施例4为900s(第一次扫描)600s(第二次扫描))
恒压：3atm
在测量之前对于所有的样品进行脱气15min。在每个蛋白样品后，用 50％甲酸清洁样品池。另外，在每一次样品运行之后，用1000ml纯水清 洗该池。将所有样品与在参比池中的相应的对照剂一起测量。从评估之前 的数据中扣除来自利用填充在参比和样品池中的对照剂溶液进行的单独 扫描的结果，即扣除空白。
MALDX-TOF MS
在用酶唾液酸酶处理之前和之后，通过基质辅助激光解吸/电离飞行时 间质谱(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time of Flight Mass Spectrometry(MALDI-ToF MS))分析rFSH的样品以评估去唾液酸化反应 的程度。在Autoflex II MALDI ToF质谱仪(Bruker Daltonics)上获得光谱。 将芥子酸用作基质。以正线性离子模式进行分析，其中提取(extraction)延 迟。将4000-20893Da的扫描范围与外标一起使用。
该实施例的目的
该实施例的目的是通过液体差示扫描量热法(DSC)研究rFSH的热稳 定性，并且研究在添加和不添加防腐剂(苯酚或苄醇)的情况下，各种盐对 rFSH的稳定作用。
该研究与以前的圆二色(CD)光谱研究(上述实施例1)和实时稳定性研 究(下述实施例3)一起都目标在于研究盐和防腐剂对于溶液中的rFSH稳定 性的影响。
研究的产品
rFSH批次信息
rFSH，药物物质批号08800020和批号09PD80010由Bio-Technology General(BTG)，Israel生产。
根据Ph.Eur进行rFSH的生物学活性确定。分别对于所用的两个rFSH 批次，分别确定批次08800020浓度为13,223IU/mg(导致9,256IU/ml)， 确定批次09PD80010的浓度为15,109IU/mg(导致10,576IU/ml)。
材料
赋形剂
在表2中列出在该研究中用于rFSH溶液的赋形剂列表。
表2：赋形剂列表
测试的溶液的组成
测试的rFSH和对照剂溶液的组成在表3、表4和表5中列出。基于 满足Ph.Eur.A标准所需要的浓度选择测试的防腐剂的浓度，所述Ph.Eur.A 标准涉及用于肠胃外用途的制剂的防腐效力。
测试的盐浓度基于在测试溶液中获得等渗性所需要的硫酸钠的浓度， 即，0.1M硫酸钠。以与硫酸钠相同的摩尔浓度测试所有其他的盐。另外， 测试更高和更低的氯化钠浓度以评估盐浓度对rFSH变性温度Tm的影响。
在测试溶液中保持低的磷酸钠缓冲液浓度从而象这样使缓冲盐的稳 定/去稳定作用的风险最小。
表3：rFSH溶液的组成
表4：去唾液酸化的rFSH溶液的组成
表5：对照剂溶液的组成
制备方法
在Ferring Pharmaceuticals A/S，Copenhagen，Denmark以实验室规模 制备所有的溶液(表3，表4和表5)。制备方法总结如下：
rFSH储液制备
通过使用rFSH批次08800020或批次09PD80010药物物质溶液作为 原材料，加入浓缩步骤，制备在磷酸盐缓冲液中的rFSH储液。使用来自 Vivascience的具有10kDa分子量膜截断值(MWCO)的Vivaspin20装置进 行向上浓缩(up concentration)。通过对15ml的相应对照剂溶液(其含在1 mM磷酸盐缓冲液pH5.5、6.5或7.5中的0.5mg/ml L-甲硫氨酸，0.005 mg/ml聚山梨醇酯20)进行经过过滤器的离心预先洗涤所述膜。使用甩平 式(swing-out)转子以3000x g进行离心20分钟。
为了进行浓缩步骤，将共80ml的rFSH样品用于填充Vivaspin20装 置(20ml/装置)并且以3000x g离心15分钟。将每个保留物转移到20ml 容量瓶中。用所需对照剂溶液的小等分试样洗涤过滤器。将洗液转移到容 量瓶中，使用相同的对照剂溶液将其最终稀释到体积。这产生2.8mg/ml rFSH储液，其含有分别在1mM磷酸盐缓冲液pH5.5、6.5或7，5中的0.5 mg/ml L-甲硫氨酸，0.005mg/ml聚山梨醇酯20。
制备rFSH和对照剂溶液
在Milli-Q水中制备所有的赋形剂(除防腐剂之外)的储液。
为了制备rFSH和对照剂溶液，将每种赋形剂的储液混合以获得在表 3、表4和表5中给出的需要的浓度。将防腐剂直接加入溶液。
rFSH的去唾液酸化
将rFSH浓度为2.8mg/ml的浓缩的rFSH溶液(其含有在1mM磷酸盐 缓冲液pH6.5中的0.5mg/ml L甲硫氨酸，0.005mg/ml聚山梨醇酯20)用 于从与rFSH结合的糖结构部分去除唾液酸。使用来自Sigma的 α(2→3，6，8，9)神经氨酸酶(唾液酸酶)酶促地进行去除。在37℃过夜摇动期 间，用神经氨酸酶处理rFSH。使用上述用于浓缩rFSH的Vivaspin装置去 除所述试剂。将包含酶的rFSH溶液转移到预先洗涤的Vivaspin装置中。 对装置进行离心，排出滤液并且将保留物重新悬浮在对照剂溶液中，所述 对照剂溶液含有在1mM磷酸盐缓冲液pH6.5中的0.5mg/ml L甲硫氨酸， 0.005mg/ml聚山梨醇酯20。对所述溶液再次进行离心。在最终保留物转 移到容量瓶中并且用对照剂稀释到体积之前，重复该方法三次。这产生了 2.8mg/ml的去唾液酸化的rFSH储液，所述储液包含在1mM磷酸盐缓冲 液pH6.5中的0.5mg/ml L甲硫氨酸，0.005mg/ml聚山梨醇酯20。
结果和讨论
DSC扫描速度对rFSH Tm的影响
为了研究DSC扫描速度对rFSH变性温度的影响，用三种不同的扫描 速度进行Tm测量。如在表6中所观察到的，在测量过程中，rFSH Tm随所 用DSC扫描速率变化。
在比较获自用相同的扫描速率进行的测量的变性温度时，Tm随扫描速 率变化的事实不影响数据的解释，见例如表7。
表6：变性温度Tm与含有在1mM磷酸钠缓冲液pH6.5中的2.4mg/ml rFSH，0.5mg/ml L甲硫氨酸，0.005mg/ml聚山梨醇酯20的rFSH样品的 扫描速率相关
*双重的样品制备和分析
至100℃的重复DSC扫描显示rFSH的变性在实验条件下是部分不可 逆的(见图4)。这意味着，与在两次DSC扫描之间的平衡时间相比，再折 叠较慢，或再折叠与不可逆步骤相关，如在等式2中所显示。
天然<->解折叠->不可逆变性(2)
添加防腐剂对于rFSH Tm的影响
如在表7中所显示，取决于所用的防腐剂，添加防腐剂到rFSH溶液 中降低了变性温度Tm达2-6℃。这充分对应于以前报道的其它重组蛋白和 尿液来源的FSH的数据。
获得的含有苄醇的rFSH溶液的Tm与含有苯酚的rFSH溶液相比的更 大增加(见表7)可以由实验中使用的苄醇浓度(15mg/ml)高于苯酚浓度(5 mg/ml)解释。
表7：rFSH样品在添加和不添加防腐剂的情况下的变性温度Tm(防腐剂)和Tm(无防腐剂)，所述rFSH样品含有2.4mg/ml rFSH，0.5mg/ml L-甲硫氨酸，0.005 mg/ml聚山梨醇酯20，1mM磷酸钠缓冲液pH6.5和在表中列出的赋形剂。 ΔTm(防腐剂)＝Tm(防腐剂)-Tm(无防腐剂)
防腐剂 盐 Tm(无防腐剂) Tm(防腐剂) 5mg/ml苯酚 无盐 72.9℃* 70.2℃*
74.9℃** 72.3℃** 15mg/ml苄醇 无盐 74.9℃** 70.1℃** 5mg/ml苯酚 0.1M Na2SO4 78.0℃ 75.1℃* 15mg/ml苄醇 0.1M Na2SO4 78.9C** 73.3℃
*计算自用1.0℃/min的扫描速率进行的DSC测量。
**计算自用2.0°/min的扫描速率进行的DSC测量。
加入各种盐对rFSH Tm的影响
根据其对蛋白溶解度和稳定性的一般作用对盐进行分级被称为 Hofmeister系列或易溶(lyothropic)系列，下述等式(3)。已知左手侧的盐析 试剂(所谓的kosmotropic离子)对蛋白产生稳定作用。而已知右手侧的离液 (chaotropic)离子或盐溶离子使蛋白去稳定。
SO 4 2 - > HPO 4 2 - > F - > Cl - > Br - > NO 3 - > I - > ClO 4 - > SCN - - - - ( 3 ) ]]>
向不含防腐剂的溶液加入各种盐对rFSH Tm的影响。
当测量各种钠盐对于rFSH Tm的作用时，相当令人惊奇的是，当改变 阳离子时，没有观察到如上所述的根据Hofmeister系列预期的稳定/去稳定 作用，见表8和表9。不管是否使用最多的kosmotropic离子，硫酸盐，或 离液离子，高氯酸盐，变性温度的增加大约相同。事实上，当预期对rFSH 的去稳定作用时，对高氯酸盐离子的盐，获得rFSH Tm的最大增加。对于 多种无机阴离子如硫酸盐，氯化物和高氯酸盐，以及对于有机阴离子如柠 檬酸盐、乙酸盐和酒石酸盐，Tm的增加在相同的范围内。
表8：变性温度Tm与rFSH样品的盐阴离子和阳离子的组合相关，所述rFSH 样品含有2.4mg/ml rFSH，0.5mg/ml L甲硫氨酸，0.005mg/ml聚山梨醇 酯20，1mM磷酸钠缓冲液pH6.5和0.1M盐
没有加入盐：Tm＝72.9℃，根据表头的其它赋形剂
0.1M蔗糖：Tm＝73.3℃，根据表头的其它赋形剂
表9：加入0.1M盐后，与rFSH样品的盐阴离子和阳离子的组合相关的变 性温度的变化ΔTm(盐)，所述rFSH样品包含2.4mg/ml rFSH，0.5mg/ml L- 甲硫氨酸，0.005mg/ml聚山梨醇酯20，1mM磷酸钠缓冲液pH6.5。ΔTm(盐)＝Tm(盐)-Tm(无盐)
0.1M蔗糖：0.4℃，根据表头的其他赋形剂
观察到的趋势，即在加入不同的钠盐后，阴离子在Hofmeister系列中 的位置并不影响rFSH Tm的增加，对于钾也发现了(见表8和表9)。当具有 相同的阳离子时，阴离子通常仅在较小的程度影响rFSH Tm的变化并且并 不按照Hofmeister系列。
另一方面，相当令人惊奇的是，阳离子影响rFSH Tm。更具体地，与 二价离子相比，具有单价阳离子的盐通常显示更高的rFSH Tm(见表8)。尤 其地，单价碱金属离子给出高rFSH Tm。换言之，在加入盐后观察到的稳 定作用(即rFSH Tm的增加)相当独立于测试的阴离子(见表8和9)，而阳离 子对于稳定的程度具有较大的影响。钾盐和钠盐显示特别大的稳定作用。
所有上述测试的溶液具有0.1M的盐浓度。为了研究盐浓度对于rFSH Tm的作用，研究了含三种不同氯化钠浓度的rFSH溶液的DSC测量。在 测试的整个盐浓度范围内观察到在将盐加入rFSH溶液后的稳定作用(见表 10)。
表10：加入不同氯化钠浓度后，rFSH样品的变性温度的变化ΔTm(盐)，所 述rFSH样品含有2.4mg/ml rFSH，0.5mg/ml L-甲硫氨酸，0.005mg/ml聚 山梨醇酯20，1mM磷酸钠缓冲液pH6.5。ΔTm(盐)＝Tm(盐)-Tm(无盐)
NaCl浓度 ΔTm(盐) 0.07M 4.2℃** 0.1M 4.8℃* 0.24M 5.4℃**
*计算自用1.0℃/min的扫描速率进行的DSC测量。
**计算自用2.0℃/min的扫描速率进行的DSC测量。
关于FSH制剂的现有专利使用例如蔗糖作为FSH的稳定剂。将0.1M 蔗糖加入rFSH溶液产生rFSH Tm的微小变化(见表8和表9)，说明在加入 钾盐或钠盐后rFSH的稳定作用显著高于在加入蔗糖后获得的作用。
将各种盐加入具有加入的防腐剂的溶液对rFSH Tm的作用
充分已知的是将防腐剂加入蛋白溶液减少了溶液中的蛋白稳定性。然 而，对于目的在于肠胃外用途的水性多剂量制剂，需要防腐剂。因此，非 常重要的是通过将向rFSH溶液加入稳定剂如盐，补偿加入防腐剂后的蛋 白稳定性的下降。
表11：rFSH样品的变性温度Tm，和变性温度的变化ΔTm(防腐剂)和ΔTm(盐)， 所述rFSH样品包含2.4mg/ml rFSH，5mg/ml苯酚，0.5mg/ml L甲硫氨酸， 0.005mg/ml聚山梨醇酯20，1mM磷酸钠缓冲液pH6.5和0.1M盐，如 表中给出。在此，ΔTm(防腐剂)＝Tm(防腐剂)-Tm(无防腐剂)并且ΔTm(盐)*＝Tm(盐)-Tm(无盐)
Tm ΔTm(防腐剂) ΔTm(盐)＊ 无盐 70.2℃ -2.7℃ - Na2SO4 75.1℃ -2.9℃ 4.9℃ NaCl 74.7℃ -2.9℃ 4.6℃ NaClO4 78.6℃ -2.3℃ 8.4℃
*对于含5mg/ml苯酚的rFSH溶液
如可从表11中观察到的，将防腐剂加入rFSH溶液中导致rFSH变性 温度降低2-3℃。将盐加入防腐的rFSH溶液使rFSH变性温度增加约5℃。 换言之，向rFSH溶液加入防腐剂后观察到的去稳定作用通过加入本发明 定义的盐而得到充分补偿。实际上，向包含苯酚的rFSH溶液加入盐不仅 中和防腐剂对于rFSH Tm的作用，与在水溶液中而不加入防腐剂或盐的 rFSH相比，其实际上还增加了Tm(见表11)。
改变pH对rFSH Tm的作用
为了研究在加入和不加入稳定盐的情况下pH对rFSH Tm的作用，在 5.5、6.5和7.5的pH，在加入和不加入三种不同的钠盐的情况下，确定rFSH 变性温度(见表12)。
表12：rFSH样品在不同pH的变性温度Tm，所述rFSH样品包含2.4mg/ml rFSH，0.5mg/ml L甲硫氨酸，0.005mg/ml聚山梨醇酯20，1mM磷酸钠 缓冲液和0.1M盐。在此，ΔTm(盐)＝Tm(盐)-Tm(无盐)
如可在表12中观察到的，加入不同钠盐后的rFSH Tm的一般趋势在 5.5到7.5的整个pH范围内是相同的，即在所有测试的pH观察到与根据 Hofmeister系列的盐的稳定/去稳定作用的偏离。
在研究的pH范围内，在加入和不加入盐的情况下，观察到的rFSH 变性温度随着溶液中pH的增加而增加(见表12)。在加入盐后rFSH变性温 度的实际增加ΔTm(盐)在更高的pH稍微降低(见表12)。
rFSH唾液酸化对于rFSH Tm的作用
如上述显示，盐加入rFSH溶液的影响根本没有遵循上述的Hofmeister 系列，其中预期高氯酸盐离子的盐对蛋白进行去稳定(产生更低的蛋白 Tm)，并且预期硫酸盐离子稳定蛋白(产生更高的蛋白Tm)。
由于rFSH是糖基化蛋白，具有附着于糖结构部分的许多唾液酸残基， 并且因此具有相当高的净负电荷，所以研究了唾液酸对于盐的未预期的稳 定行为的作用。
为了研究唾液酸对rFSH Tm的作用，在加入不同的盐后，通过酶促去 除唾液酸。接着，在加入和不加入盐的情况下，通过DSC分析去唾液酸 化的rFSH。
为了证实成功去除唾液酸残基，通过MALDI-ToF MS分析在酶促去 除唾液酸之前和之后的rFSH样品。
在MALDI-ToF MS酸样品条件下，α-亚基和β-亚基解离并且因此分 别测量。在用唾液酸酶处理之前的α-亚基的平均分子量是15000Da。在用 唾液酸酶处理之后，平均分子量是14000Da。在用唾液酸酶处理之前的β -亚基的平均分子量是18000Da，并且在用唾液酸酶处理之后的β-亚基的 平均分子量是17000Da。两种亚基质量上的变化是去除唾液酸的结果，这 导致质量的减少。实际上，在去唾液酸化过程中，从rFSH去除了所有的 唾液酸残基。
在加入硫酸钠或高氯酸钠之后，rFSH Tm的增加遵循与未修饰的rFSH 和去唾液酸化的rFSH相同的趋势，即，稳定作用(rFSH Tm增加)未遵循上 述Hofmeister系列。一般地，观察到的去唾液酸化的rFSH的Tm的Tm低 2-6℃(见表13)。与未修饰的rFSH相比，在加入盐后观察到的去唾液酸化 的rFSH的稳定作用也比未修饰的rFSH的稳定作用更低(见表13)。
预期与未修饰的rFSH相比，获得的去唾液酸化的rFSH的Tm更低， 因为据信在rFSH上的糖结构部分上存在的唾液酸增加了rFSH稳定性。
未修饰的rFSH和去唾液酸化的rFSH在加入各种盐后遵循相同的趋势 (偏离根据Hofmeister系列的稳定/去稳定作用)的事实，证实了并不是在 rFSH上存在的唾液酸本身引起了这种作用。
表13：rFSH和去唾液酸化的rFSH样品的变性温度Tm，所述样品包含2.4 mg/ml rFSH或2.4mg/ml去唾液酸化的rFSH，0.5mg/ml L甲硫氨酸，0.005 mg/ml聚山梨醇酯20，1mM磷酸钠缓冲液pH6.5和0.1M盐。在此，ΔTm(盐)＝Tm(盐)-Tm(无盐)。
结论
在加入防腐剂后观察到的rFSH的去稳定作用(rFSH Tm降低)非常好地 对应本领域的现有技术。
然而，在加入具有不同阴离子的盐后，在rFSH变性温度上观察到的 与Hofmeister系列的偏离是意料之外的。根据Hofmeister系列，(所述 Hofmeister系列根据其对蛋白溶解度和稳定性的一般作用对盐进行分级)， kosmotropic阴离子如硫酸盐通常稳定蛋白(产生更高的Tm)，而离液阴离子 如高氯酸盐则对蛋白进行去稳定(产生更低的Tm)。在该研究中，具有相同 阳离子的所有测试的阴离子显示在rFSH变性温度上的相似增加。与自 Hofmeister系列的预期完全相反，高氯酸离子的盐显示在rFSH变性温度 上的最大增加。
换言之，在加入盐之后观察到的稳定作用(即rFSH Tm增加)完全独立 于测试的阴离子。钠盐和钾盐显示特别大的稳定作用。尤其是将高氯酸钠 加入rFSH溶液导致rFSH变性温度的巨大增加。然而，高氯酸盐通常是高 度反应性的，并且是氧化剂，并且因此没有批准将高氯酸盐作为药物制剂 中的非活性成分。
在加入盐后获得的rFSH的预料之外的稳定作用不能通过在rFSH的糖 结构部分上存在唾液酸来解释。对去唾液酸化的rFSH的rFSH变性温度确 定显示与未修饰的rFSH相同的在加入盐后对rFSH稳定作用的趋势。
实施例3-关于rFSH溶液的实时稳定性
研究目的
本研究的目的是确定各种制剂中的rFSH的实时稳定性是否遵循与下 述相同的趋势：如在通过如实施例2中所述的液体DSC测量rFSH变性温 度中所观察到的，以及如在实施例1中所述的如用CD光谱测量的在加热 后rFSH二级结构的变化。在该研究中确定了通过rFSH解离为其单体的倾 向测量的rFSH在贮存过程中的结构稳定性。
在长期5±3℃/环境RH以及加速的30±2℃/65±5％RH条件下达 6-12个月，研究在两个不同的贮存温度贮存后rFSH600IU/ml制剂的稳定 性。将所有小瓶倒置贮存。将含有相应制剂但不没有加入rFSH的对照剂 对照在如对于活性rFSH所述的相同条件下贮存。
待研究的产品
批次信息
rFSH，药物物质批号08800060和批号09800020由Bio-Technology General(BTG)，Israel生产
上述rFSH批次的生物学活性的确定根据Ph.Eur.进行
材料
赋形剂
在表14中描述在该研究中使用的赋形剂列表。
表14：赋形剂列表
名称 供应商 二水合磷酸氢二钠，Ph.Eur. Merck 磷酸85％，Ph.Eur. Merck 蔗糖，Ph.Eur. Merck 聚山梨醇酯(polysorbate)20Ph.Eur. Merck 苯酚，Ph.Eur. Merck L-甲硫氨酸，Ph.Eur. Sigma 氯化钠，Ph.Eur. Merck 硫酸二钠×10H2O，Ph.Eur. Merck Milli-Q水 Millipore
容器和密封系统
所用的主要包装材料在表15中列出。
表15：容器/密封系统
rFSH储液和不同的制剂(rFSH和对照剂)的组成在表16、表17和表 18中列出。除了不含有任何稳定剂/张性剂的制剂之外，调节稳定剂/张性 剂的浓度以提供等渗溶液。
表16：rFSH储液的组成
表17：rFSH制剂的组成
*pH指最终溶液的pH
表18对照剂制剂的组成
*pH指最终溶液的pH
制备方法
在Ferring Pharmaceuticals A/S，Copenhagen，Denmark以实验室规模 制备所有的溶液(表17和表18)。如下总结制备方法。
制备rFSH和对照剂制剂
在Milli-Q水中制备所有赋形剂的储液。
对于制备对照剂制剂，将每种赋形剂的储液混合以获得在表18中给 出的浓度。在稀释到体积之前，如果必要，调节每种制剂的pH。
对于制备rFSH制剂，从每种赋形剂的储液制备稀释溶液。调节稀释 溶液的pH。将稀释溶液与rFSH储液(见表16)混合以产生在表17中列出 的最终浓度。
无菌过滤和无菌填充
使用0.22μm PVDF滤器(Millipore)无菌过滤最终制剂。使用Stericup 滤器将对照剂制剂无菌过滤到高压灭菌的玻璃瓶中。使用Sterivex-GV滤 器和无菌的20ml Luer Lock注射器(Braun)将rFSH制剂无菌过滤到高压灭 菌的玻璃大口杯中。使用高压灭菌的小瓶和橡胶塞在LAF台中进行无菌 过滤、填充和密封小瓶。在填充之前和之后，用通过0.20μm Millex-FG PFTE滤器(Millipore)的氮气冲洗小瓶至少6秒。以1.5ml样品/小瓶填充 小瓶。对所有的小瓶进行无菌填充并且立即用橡胶塞和铝制flip-off盖密 封。
贮存条件
将包含rFSH600IU/ml和对照剂的样品在5±3℃/环境RH贮存6-18 个月。此外，在加速的条件，30±2℃/65±5％RH将样品贮存6-18个月。 在每个贮存温度，将小瓶倒置贮存。避光保存所有的小瓶。
稳定性程序
rFSH600IU/ml和对照剂的稳定性程序描述在下述表19中。
表19：倒置贮存的rFSH液体制剂600IU/ml和对照剂的稳定性程序
-根据稳定性程序计划的，没有测试
*仅对一些制剂测试
分析方法
在该研究中使用的分析方法在下面描述。在每个测试情形，对于每种 制剂分析2瓶rFSH和1瓶相应的对照剂。
低分子量(LMW)形式
通过在大小排阻(SEC)柱上利用等度洗脱的LC-UV确定rFSH的LMW 形式。使用基于硅的柱子用TRIS缓冲液作为移动相和UV检测进行分析。 rFSH的LMW形式是具有比rFSH主峰的分子量更低(在之后)的分子量的 洗脱峰。将LMW形式确定为总峰面积的百分比峰面积。
对于包含防腐剂的样品，在进入大小排阻柱之前，将防腐剂从样品溶 液中去除。
结果和讨论
rFSH在贮存过程中的解离
由于非共价偶联的单体解离后rFSH失去其生物活性，所以追踪由于 单体解离导致的rFSH活性丧失的直接方法是测量溶液中的rFSH LMW形 式的量。该信息可以由SEC色谱法重新获得，其中已知在rFSH主峰之后 的LMW形式的洗脱峰来自解离的rFSH。
表20：在30±2℃/65±5％RH贮存后通过SEC确定的LMW形式的rFSH 相对量(％)。所有制剂的完全描述在表17中列出。
N.P.未进行.
表21：在5±3℃/环境RH贮存后通过SEC确定的LMW形式的rFSH 相对量(％)。所有制剂的完全描述在表17中列出。
N.P.未进行.
如可从表20中所见，含有不同稳定剂、添加和不添加防腐剂的新鲜 制备的rFSH溶液显示类似相对量的解离的rFSH(LMW形式)。由于SEC 方法的定量限制是3％，所以在该限制以下不能进行制剂之间的明确区分， 意味着在起始时间点观察到的LMW形式的差异在方法变化的限制内。
在30±2℃/65±5％RH贮存一个月后，对于含有苯酚以及蔗糖但是无 稳定剂的样品，解离的rFSH的相对量增加，而包含硫酸钠或氯化钠的样 品并未显示在解离的rFSH上的任何显著增加(见表20)。
在30±2℃/65±5％RH贮存六个月后，苯酚而未添加稳定剂的rFSH 样品包含超过20％的解离的rFSH(LMW形式)。包含苯酚、具有蔗糖作为 稳定剂的rFSH样品也显示解离的rFSH的显著增加(超过10％的解离的 rFSH)，而包含苯酚、被用氯化钠或硫酸钠稳定的样品仅显示在解离的rFSH 上的微小增加(见表20)。在贮存过程中，不包含任何防腐剂的样品针对解 离是最稳定的；然而对于目标在肠胃外使用的水性多剂量制剂，需要加入 防腐剂，因此这种制剂仅加入作为比较。
在5±3℃/环境RH贮存六个月后，测试的rFSH制剂没有显示在解 离的rFSH相对量上的增加(见表21)。可是，在5℃至少贮存24个月和伴 随的在室温贮存1个月，优选3-4个月，是rFSH的商业产品成功所需要 的。
rFSH变性温度，二级结构的变化和解离的程度
由于该实施例的目的是确定实时稳定性研究数据、通过DSC的rFSH 变性温度测定和通过CD光谱、部分DSC数据(见实施例2)和部分CD数 据(见实施例1)(如以下列出的)测定的rFSH二级结构数据之间的相关性，。 在实施例2中给出关于显示的DSC结果的所有详情，并且在实施例1中 给出关于CD数据的详情。
表22：在30±2℃/65±5％RH贮存6个月后通过SEC确定的LMW形式 的rFSH相对量(％)和如通过DSC测量的rFSH变性温度Tm。在DSC研究 中，与在表中给出的实时稳定性研究中所用的量比较，所有测试溶液的稳 定剂的浓度保持在0.1M。
如可从表22中看出，在30±2℃/65±5％RH贮存6个月后，通过DSC 获得的rFSH变性温度与实时稳定性数据良好相关，对于重组抗体和重组 糖蛋白之前已经提出了DSC和如通过SEC分析的实时稳定性之间的类似 相关(见例如.Burton等(2007)，Pharm.Dev.Technol.12：265-273和Remmele 等(1998)，Pharm.Res.15：200-208)。未加入防腐剂、用硫酸钠稳定的rFSH 溶液在6个月贮存后仅显示低程度的解离的rFSH，与包含防腐剂的溶液 相比其还显示显著更高的变性温度。还进一步观察到，与包含蔗糖或不包 含稳定剂的溶液相比，在6个月的贮存后，对于包含防腐剂(苯酚)的溶液， 加入盐，氯化钠或硫酸钠，产生明显更低程度的解离的rFSH。与包含盐 的溶液的rFSH Tm相比，未加入稳定剂的rFSH的变性温度也明显更低。 尚未确定包含蔗糖、添加有苯酚的溶液的rFSH变性温度，然而，如可从 表23中观察到的，在30±2℃/65±5％RH贮存6个月后，对未添加防腐 剂的溶液的rFSH Tm进行测量，显示与实时稳定性数据相同的趋势(见表 22)。结论是，针对结构降解，NaCl和Na2SO4是比蔗糖明显更好的稳定剂。 这通过Tm测量(见表23)和实时稳定性数据(见表22)显示。
表23：通过DSC测定未加入防腐剂的溶液的rFSH变性温度Tm；关于详 情见实施例2。
稳定剂 DSC，Tm 0.1MNa2SO4 78.0℃ 0.1MNaCl 77.7℃ 0.1M蔗糖 73.3℃
表24：当加入在表中列出的防腐剂或盐时，rFSH样品的变性温度的变化 ΔTm，所述rFSH样品包含2.4mg/ml rFSH，0.5mg/ml L-甲硫氨酸，0.005 mg/ml聚山梨醇酯20，1mM磷酸钠缓冲液pH6.5。扫描速率：2℃/min。 ΔTm＝Tm(防腐剂/盐)-Tm(无添加)
防腐剂 盐 ΔTm 15mg/ml苄醇 无盐 -4.7℃ 15mg/ml苄醇 0.1M Na2SO4 -1.6℃ 无防腐剂 0.1M Na2SO4 +4.1℃ 无防腐剂 无盐 0℃
尚未测定包含苄醇作为防腐剂的溶液的实时稳定性数据，然而，当比 较如通过DSC确定的rFSH变性温度与如利用CD光谱测定的加热后的 rFSH二级结构的变化时，观察到相同的趋势(见表24)。已经确定不同蛋 白样品的rFSH的二级结构；可以将在24℃测定的二级结构视为天然结构， 并且在此，对于加入苄醇(以0.17mg/ml)或硫酸钠后的rFSH溶液，观察不 到在rFSH二级结构上的差异。尽管，当将溶液加热到76.5℃时，观察到 的rFSH二级结构的损失随加入的赋形剂而变化。与不包含任何防腐剂的 rFSH溶液相比，加入防腐剂(苄醇)导致rFSH二级结构的更大损失，同时 与不加入盐的rFSH溶液相比，加入盐(硫酸钠)产生更少的rFSH二级结构 的损失。可以将有序的rFSH二级结构的损失解释为蛋白的部分或完全变 性。
实施例4-hCG的差示扫描量热法(DSC)数据
人绒毛膜促性腺激素(hCG)是由以下两种糖基化单体组成的异二聚体 蛋白：hCG、促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)和促甲状腺激素(TSH)共 有的92个氨基酸的α-亚基，和hCG特异的145个氨基酸的β-亚基。包括 FSH和hCG在内的糖蛋白激素，在非共价偶联的单体解离后都失去了它 们的生物学活性。来自稳定性分析的结果显示重组FSH(rFSH)的不稳定性 主要基于二聚体解离(四级结构的分解，和伴随的免疫结合反应的减少)。
该实施例的目的是确定：对于非常相似的蛋白hCG是否也观察到以 前观察到的如利用DSC测定以及在上述实施例1-3中所述的各种糖和盐与 rFSH变性温度的相关性。另外，将在该研究中确定的hCG的DSC变性温 度与以前公开的实时稳定性数据(Samaritani，F.1995，hCG liquid formulations(hCG液体制剂).EP0814，841)进行比较。
在含0.5mg/ml L-甲硫氨酸和0.005mg/ml聚山梨醇酯20的1mM磷 酸盐缓冲液中，在存在和不存在0.1M的各种钠盐或蔗糖的情况下，研究 hCG的变性温度。研究了四种不同的糖和盐：蔗糖、硫酸钠、氯化钠和高 氯酸钠。
尿液来源的人绒毛膜促性腺激素(hCG)
使用从来自Massone S.A.，Argentina的人尿液中纯化的hCG，药物物 质，批号2823287510(7059IU/mg)。将材料冷冻贮存在2-8℃。
根据Ph.Eur.进行上述hCG批次的生物学活性的测定。
如在实施例2-3中所述，使用rFSH和其他材料。
表25：赋形剂列表
名称 供应商 二水合磷酸氢二钠，Ph.Eur. Merck 磷酸85％，Ph.Eur. Merck L-甲硫氨酸，Ph.Eur. Sigma
聚山梨醇酯(吐温)20Ph.Eur. Merck 蔗糖，Ph.Eur. Merck 硫酸钠×10H2O，Ph.Eur. Merck 氯化钠，Ph.Eur. Merck 高氯酸钠×H2O，p.a. Merck Milli-Q水 Millipore
不同的hCG制剂的组成在表26中列出。
表26：hCG制剂的组成
*关于该批次，对应于35300IU/ml.
制备方法
在Ferring Pharmaceuticals A/S，Copenhagen，Denmark以实验室规模 制备所有的溶液(表26)。
制备hCG制剂
在Milli-Q水中制备所有赋形剂的储液。从储液制备具有不同赋形剂 的对照剂溶液。将hCG药物物质溶解在对照剂溶液中以获得在表26中给 出的浓度。由于未获得这些制剂的稳定性数据，所以总是在自样品制备后 的1小时内，对新鲜制备的样品进行DSC分析。
如可从图4和表27观察的，hCG的变性温度Tm低于rFSH的Tm。 另外，hCG的变性过程的焓(即变性峰的大小)显著小于rFSH。与rFSH(其 中在将rFSH样品加热到100℃后，变性过程几乎完全是不可逆的)不同， 在将hCG加热到100℃后变性过程在更大程度上，是可逆的(2)。
对hCG变性过程在DSC测量的时间框架内在很大程度上是可逆的， 而rFSH却不是如此的事实的解释可能是：与rFSH相比，hCG中的两个 亚基解离的倾向更少。如果在加热hCG样品时所述亚基不解离，则在冷 却到室温后天然结构可能更易于再次形成。与hCG相比，rFSH在加热到 100℃后转变的ΔH的量级显然要更大，而在伴随的扫描(即将样品加热到 100℃，冷却到25℃并进行第二次扫描到100℃)中，对于rFSH和hCG，转 变的ΔH的量级在相同的大小范围内。
加入糖或盐对hCG和rFSH TM的影响
预期将盐加入蛋白质水溶液中影响蛋白质在溶液中的稳定性并且因 此影响蛋白变性温度。
当测量各种钠盐对hCG和rFSH Tm的影响时，相当令人惊奇的是， 当改变阴离子时，未观察到根据Hofmeister系列预期的稳定/去稳定作用， 见图5、图6和表27。关于hCG，硫酸钠和氯化钠实际上都使蛋白去稳定， 而对于rFSH，这些盐稳定蛋白。对于hCG和rFSH，预期对蛋白具有去稳 定作用的高氯酸钠实际上增加了所有测试的糖和盐中的大部分的Tm。
表27：在加入0.1M糖或盐后hCG样品(包含5mg/ml hCG，0.5mg/ml L- 甲硫氨酸，0.005mg/ml聚山梨醇酯20，1M磷酸钠缓冲液pH6.5)和在加 入0.1M糖或盐后rFSH样品(包含2.4mg/ml rFSH，0.5mg/ml L-甲硫氨酸， 0.005mg/ml聚山梨醇酯20，1mM磷酸钠缓冲液pH6.5)的变性温度Tm 和变性温度的变化ΔTm(糖/盐)。ΔTm(糖/盐)＝Tm(糖/盐)-Tm(无糖/盐)。
加入糖或盐对HCG和RFSH纯度的影响。
贮存过程中rFSH亚基的解离，rFSH纯度
由于在非共价偶联的单体解离后rFSH失去其生物活性，所以追踪由 于单体解离导致的rFSH活性丧失的直接方法是测量溶液中rFSH LMW形 式的量。该信息可以从SEC色谱法重新获得，其中已知在rFSH主峰之后 洗脱的LMW形式来自解离的rFSH。
在研究的制剂中，没有观察到其他蛋白相关化合物，如rFSH聚集体。 因此，可以将rFSH蛋白纯度计算为
纯度(％)＝100％-LMW形式(％)(4)
表28：在30±2℃/65±5％RH贮存后通过SEC确定的rFSH纯度(％)
如可从表28中观察到的，含有不同的糖或盐、加入和未加入防腐剂 的新鲜制备的rFSH溶液显示类似的纯度，即，类似的解离的rFSH(LMW 形式)的相对量。
在30℃贮存一个月后，含有苯酚以及蔗糖或无糖或盐的样品的rFSH 纯度下降，而包含苯酚和硫酸钠或氯化钠的样品以及未加入苯酚的样品未 显示rFSH纯度的任何显著下降(见表28)。在30℃贮存6个月后，包含苯 酚、未加入糖或盐的rFSH样品产生少于80％的rFSH纯度。包含苯酚、 具有蔗糖作为稳定剂的rFSH样品也显示rFSH纯度的显著下降，而包含苯 酚、用氯化钠或硫酸钠稳定的样品仅显示rFSH纯度的微小下降(见表28)。 不包含任何防腐剂的样品针对贮存过程中的解离是最稳定的，即，它们显 示最高的纯度，然而，对于用于肠胃外用途的多剂量水性制剂，需要加入 防腐剂。
hCG在贮存过程中的纯度
将以前公开的关于贮存后hCG纯度的变化的数据用于与上述显示的 rFSH稳定性数据进行比较(Samaritani，同上)。在50℃贮存一个月后，hCG 纯度显著下降。与含有蔗糖的样品相比，含有氯化钠的样品的下降显著更 高(见表29)。在50℃贮存6周后，与含有蔗糖的样品相比，含有氯化钠 的样品的hCG纯度低超过10％。
表29：在50℃贮存后通过SEC测定的hCG纯度(％)。在专利EP0814841 的第11页上列出制剂的全面描述。
hCG和rFSH TM和纯度的比较
如可从表30中观察到的，通过DSC获得的rFSH和hCG变性温度与 如从实时稳定性数据获得的rFSH和hCG纯度充分相关。对于重组抗体和 重组糖蛋白，以前已经提出了DSC和如通过SEC分析的实时稳定性之间 的类似相关。
在30℃测定rFSH的实时稳定性数据。因为rFSH产品目的是用于冷 冻长期贮存，所以对于加速的稳定性研究，25-30℃是合适的范围。仅获 得针对以下的hCG的实时稳定性数据：在50℃贮存达12周，在25℃和 40℃贮存11周以及在50℃贮存6周。对于40℃以下的温度，在贮存过 程中，对于具有蔗糖和氯化钠的制剂两者，hCG纯度的下降少于6％，并 且因此在贮存11-12周后难以在各种糖和盐的作用之间进行区分。仅在 50℃，可以清楚地区分各种制剂，虽然在更低的温度观察到的趋势与在 50℃相同。
表30：hCG和rFSH的通过SEC测定的纯度和用DSC测定的变性温度。 在50℃贮存6周后测定hCG的纯度，并且在30℃贮存6个月后确定rFSH 的纯度。
*样品，含有10000IU/ml hCG，154mM NaCl或300mM蔗糖，10mM磷 酸盐缓冲液pH7。
**样品，含有5mg/ml(35300IU/ml)hCG，0.1M糖或盐，0.5mg/ml L-甲 硫氨酸，0.005mg/ml聚山梨醇酯20，1mM磷酸钠缓冲液pH6.5。
#样品，含有600IU/ml rFSH，43mM Na2SO4或120mM NaCl或219mM 蔗糖，1.0mg/ml L甲硫氨酸，0.005mg/ml聚山梨醇酯20，5mg/ml苯酚， 1mM磷酸钠缓冲液pH6.5。
##样品，含有2.4mg/ml(36300IU/ml)rFSH，0.1M糖或盐，0.5mg/ml L- 甲硫氨酸，0.005mg/ml聚山梨醇酯20，1mM磷酸钠缓冲液pH6.5。
结论
在升高的温度贮存后通过hCG和rFSH变性温度以及hCG和rFSH纯 度产生了关于不同的糖和盐对溶液中hCG和rFSH稳定性的影响的明确证 据。所用的两种技术，液体DSC和SEC色谱法，都显示了一致的结果。 这些结果已经通过本发明的实时稳定性数据明确证实。
通过rFSH二级结构的变化(CD光谱-实施例1)，rFSH变性温度(通过 DSC的三级结构和四级结构的变化-实施例2)或在30±2℃/65±5％RH贮 存后形成的解离的rFSH的相对量(通过SEC的四级结构的变化-实施例3) 在各种溶液中研究rFSH稳定性产生了关于防腐剂和稳定剂对溶液中rFSH 稳定性影响的明确证据。所用的三种技术，CD、DSC和SEC色谱法都显 示了一致的结果。
对来自所有的实施例1-3的结果下结论，清楚地看出加入防腐剂(苯酚 或苄醇)减少了溶液中的rFSH稳定性。预期其他的酚类防腐剂，如间甲酚 和氯化甲酚产生类似的去稳定作用。在加入防腐剂后观察到的对rFSH的 去稳定作用充分对应于本领域的现有技术常识。
加入药用碱金属Na+或K+盐到rFSH溶液中中和了防腐剂对rFSH的 去稳定作用并且-最有利地-与不含有防腐剂也不含有盐的rFSH溶液相比， 增加了rFSH在溶液中的稳定性。所有测试的钠盐和钾盐导致与所用的阴 离子无关的增加的rFSH稳定性；所述阴离子例如无机阴离子如硫酸盐、 氯化物和高氯酸盐并且还使用有机阴离子如柠檬酸盐、乙酸盐和酒石酸 盐。改变盐的阳离子产生了对rFSH稳定程度的较大影响；单价阳离子， 具体地具有阳离子钠或钾的盐导致对rFSH的显著的稳定作用。将高氯酸 钠加入rFSH溶液中导致最稳定的rFSH溶液，然而，高氯酸盐通常具有高 度反应性并且是氧化剂，因此不批准高氯酸盐作为药物制剂中的非活性成 分。因此，硫酸和氯的钠盐或钾盐是最有利的稳定剂。
对于hCG和rFSH，向hCG或rFSH溶液加入蔗糖导致蛋白稳定性的 稍微增加，而加入氯化钠具有对hCG的去稳定作用和对rFSH的稳定作用 (见实施例4)。向hCG和rFSH溶液加入高氯酸钠对hCG和rFSH具有稳 定作用(实施例4)。这些盐对rFSH溶液的稳定作用令人惊奇地明显好于观 察到的蔗糖的稳定作用。
这些结果的结论如下：
1)在研究的条件下，盐对hCG和rFSH稳定性的作用并不遵循 Hofmeister系列。
2)尽管hCG和FSH在结构上非常相似(即，它们属于相同类别的蛋 白，它们都是糖基化的并且它们都由两个亚基组成，其中α-亚基在两种蛋 白中是相同的)，各种糖和盐如蔗糖和氯化钠对蛋白稳定性的作用对于hCG 和rFSH是不同的。非常令人惊奇的是，对于非常相似的蛋白如hCG和 rFSH，盐并不显示相同的稳定作用。
3)Na+盐和K+盐对FSH溶液显示它们的稳定作用，与所用的阴离子无 关。
4)Na+盐和K+盐对FSH溶液的稳定作用可以抵消防腐剂的去稳定作 用。
缩写和定义：
下述缩写和定义贯穿全文和实施例使用：
ΔTm 加入防腐剂或盐后变性温度的变化，还见Tm
ARTs 辅助生殖技术
BA 苄醇
BTG Bio-Technology General
CD 圆二色谱
CHO 中国仓鼠卵巢
CoA 分析证书
DNA 脱氧核糖核酸
DSC 差示扫描量热法
FSD 女性性功能障碍
FSH 促卵泡激素
hCG 人绒毛膜促性腺激素
IU 国际单位
对rFSH生物活性的测量，如根据Ph.Eur.和USP通过
Steelman-Pohley生物测定法确定的
IUI 子宫内授精
LC-UV 具有紫外线检测的液相色谱
LH 黄体生成素
LMW 低分子量形式，主要或仅由解离的单体蛋白组成
OI 排卵诱导
p.a. 分析前
Ph.Eur.欧洲药典
RH 相对湿度
rFSH 重组人促卵泡激素
SEC 大小排阻色谱法
SRCD 同步辐射圆二色谱
Tm 热转变中点或转变中点或变性温度
当一半蛋白分子折叠而一半蛋白分子解折叠时的温度。
TRIS 2-氨基-2-羟甲基-丙-1，3-二醇
TSH 促甲状腺激素
USP 美国药典
UV 紫外线