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1、(10)申请公布号 CN 102961370 A (43)申请公布日 2013.03.13 CN 102961370 A *CN102961370A* (21)申请号 201210497129.9 (22)申请日 2012.11.29 A61K 31/192(2006.01) A61P 15/00(2006.01) (71)申请人 山东省医学科学院基础医学研究所 地址 250062 山东省济南市历下区经十路 18877 号 (72)发明人 李霞 王彬 姚成芳 王丽 周宪宾 郭钰琪 赵向忠 张巧凤 姜国胜 (74)专利代理机构 济南泉城专利商标事务所 37218 代理人 李桂存 (54) 发明名。
2、称 阿魏酸在制备减轻流产后子宫出血药物中的 应用 (57) 摘要 本发明涉及一种阿魏酸的新用途， 具体涉及 一种阿魏酸在制备减轻流产后子宫出血药物中的 新用途， 阿魏酸能优势诱导米非司酮药流小鼠母 胎界面 Th1、 Th17 亚群特异性核转录因子蛋白表 达啊， 降低 Th2、 Treg 亚群特异性核转录因子蛋白 表达， 进而诱导T细胞向Th1、 Th17亚群偏移， 促进 母胎免疫排斥， 从而减轻药流小鼠子宫出血量。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 1/1 页 2 1. 阿。
3、魏酸在制备减轻流产后子宫出血药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102961370 A 2 1/5 页 3 阿魏酸在制备减轻流产后子宫出血药物中的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种阿魏酸的新用途， 具体涉及一种阿魏酸在制备减轻流产后子宫出 血药物中的新用途。 背景技术 0002 药流后异常子宫出血严重损害患者身心健康， 一定程度上影响了药流的接受性， 影响了计划生育国策的顺利实施。 现有的药流后异常子宫出血治疗方法主要包括清宫术和 米非司酮剂量优化， 但清宫术具有宫腔操作导致感染、 穿孔、 疼痛等多种并发症的风险， 而 现有的米非司酮剂量优化方案存在疗效不稳定等缺点。因此， 寻找有。
4、疗效确切且副作用小 的减轻药流后子宫出血方法和药物将具有重要的临床价值及社会意义。 0003 随着生殖免疫学不断发展， 免疫因素在妊娠及妊娠相关疾病中的作用日益受到关 注。 从免疫学角度， 正常妊娠类似于成功的半同种异体移植 ； 母体对携带父方组织相容性抗 原的胚胎不仅不排斥， 而且通过精细的母-胎对话建立独特的母-胎免疫耐受微环境， 允许 胎儿在子宫内生长发育直至分娩。免疫细胞在母 - 胎免疫耐受的诱导与维持中扮演了重要 角色， T 淋巴细胞在其中发挥着重要作用。初始 T 细胞遇抗原刺激后在特异性核转录因子 作用下， 分化 Th1/Th2/Th17/Treg 亚群， 产生不同的细胞因子， 在。
5、抗感染、 维持机体内环境 稳定及诱导母 - 胎免疫耐受中发挥着不同作用。Th1 亚群产生 IFN 等细胞因子介导细胞 免疫， 在机体抗感染中发挥着重要作用， 但其过度表达能够诱导母胎免疫排斥， 导致流产 ； Th2 亚群产生 IL-4 等细胞因子， 能降低巨噬细胞、 自然杀伤细胞活性和淋巴毒素作用， 使胚 胎逃逸母体免疫排斥， 有利于妊娠。正常妊娠存在 Th2 型免疫偏移， 而 Th1 类细胞因子的优 势表达可导致流产的发生。Th17 细胞能分泌大量的 IL-17A、 IL-17F 等细胞因子， 在清除胞 外病原体、 抗真菌中发挥重要作用， 同时在组织炎症和自身免疫性疾病发生的过程中起着 重要。
6、作用， 研究发现复发性流产模型动物及患者Th17亚群比例较正常妊娠升高。 Treg通过 产生 TGF- 等细胞因子参与维持外周 T 细胞内环境稳定及在移植耐受的形成， 在母 - 胎免 疫耐受中亦发挥关键作用， 其功能障碍参与了流产的发生。 Th17细胞与Treg细胞起源于共 同的前体细胞， 在不同的免疫微环境中向着不同方向分化。正常妊娠时 Th17/Treg 向 Treg 偏移， 复发性流产患者则存在 Th17 偏移现象。Th1/Th2/Th17/Treg 亚群共同形成复杂精细 的免疫调控网络， 维持母-胎免疫耐受微环境的稳定， 其亚群失衡则打破维持母-胎免疫耐 受状态而导致流产发生。研究证实。
7、， 米非司酮药流妇女血清及蜕膜组织中 Th1 类细胞因子 表达升高、 Th2 类细胞因子表达降低 ； 动物实验发现米非司酮诱导妊娠小鼠 Th17 特征性细 胞因子 IL-17 表达， 抑制 Treg 特征性细胞因子 IL-10、 TGF- 表达， 提示 T 细胞亚群偏移在 米非司酮药流中扮演了重要角色。 0004 阿魏酸的化学名称为 4- 羟 -3- 甲氧基肉桂酸或 3-(4- 羟基 -3- 甲氧苯基 )-2- 丙 烯酸， 是植物界普遍存在的一种酚酸， 在植物中主要与细胞壁多糖和木质素交联构成细胞 壁的一部分， 是当归、 川芎、 阿魏等中药的有效成分之一。阿魏酸具有许多功能， 如抗氧化、 抗血。
8、栓、 降血脂、 防治冠心病、 抗菌消炎、 抗突变、 防癌等， 广泛应用于食品、 药品、 化妆品等 说 明 书 CN 102961370 A 3 2/5 页 4 领域， 但目前还未见阿魏酸有减轻流产后子宫出血的作用。 发明内容 0005 为了解决上述技术问题， 本发明公开了一种阿魏酸在制备减轻流产后子宫出血药 物中的新用途。阿魏酸通过诱导药物流产小鼠母胎界面 T 细胞亚群 （Th1/Th2/Th17/Treg） 向 Th1、 Th17 亚群偏移， 促进母胎免疫排斥， 进而减少流产小鼠子宫出血量。 0006 为了进一步的说明本发明的实质， 下面用阿魏酸的药理实验来说明阿魏酸在制备 减轻流产后子宫出。
9、血药物中的新用途。 0007 药理实验 药物 米非司酮 ： 由浙江仙琚制药股份有限公司生产 （国药准字 ： H20000648， 批号 ： 091102） 。 0008 本发明有效单体成分 ： 阿魏酸 （C10H10NO4） ， 购自中国药品生物制品检定所。 0009 小鼠分组与处理 清洁级 Balb/C 小鼠， 由山东大学实验动物中心提供， 鼠龄 10 周， 体重 (222) g， 雌性 小鼠未交配过， 雄性小鼠证明有生育能力。置于室温 24 ， 相对湿度 60% 65% 的超净动 物饲养柜内， 给予 12 h 光照， 12 h 暗室， 自由饮水摄食。雌雄小鼠按 2 ： 1 比例于每日下午 。
10、5 ： 00 合笼， 次日清晨观察小鼠阴栓， 发现阴栓日为妊娠第 1 天。将孕鼠随机分为米非司酮 对照组、 米非司酮 + 阿魏酸组 （大、 中、 小剂量） ， 各 10 只。 0010 米非司酮对照组自小鼠妊娠第6天起， 灌胃米非司酮 （1.5 mg kg-1 d-1） +双蒸水， 连续灌胃 3 天 ； 米非司酮 + 阿魏酸组大、 中、 小剂量组分别灌胃米非司酮 （1.5 mg kg-1 d-1） + 大、 中、 小剂量阿魏酸 （20mg/kg、 10mg/kg、 5mg/kg） 连续灌胃 3 天。 0011 标本收集与检测 （1） 自药物处理第 1 天起， 小鼠阴道内置入 20 g 定量棉球。
11、， 每日更换， 置于密闭 EP 管 内， 4保存， 改良碱性正铁血红素法检测小鼠子宫出血量。 0012 （2） 流式细胞术包内外双染色法检测母胎界面 Th1/Th2/Th17/Treg 亚群比例 ： 分 离子宫组织， 剪至 1mm1mm 大小， 200 目铜网研磨过滤， 1PBS 冲洗， Ficoll 密度梯度离 心法分离子宫组织单个核细胞， 调整子宫组织单个核细胞浓度为 1106个 /mL， 加入佛波 酯 30 ng/mL、 离子霉素 1 g/mL、 莫能霉素 1.7 ng/mL， 37 ， 5% C02孵育 4 h。收集细 胞， 1PBS 洗 2 遍， 去上清， 加入大鼠血清， 室温避光孵。
12、育 30 min。将外标抗体 （FITC-CD4、 PC5-CD25） 按说明书分别加入到细胞悬液中， 4 避光孵育 30 min ； 1PBS 洗 2 次， 去上 清 ； BD 固定穿膜试剂盒固定穿膜 （按说明书操作） ， 加入内标抗体 （PE-IFN-， PE-IL-4， PE-IL17A， PE-Foxp3） ， 4 避光孵育30 min ； 穿膜缓冲液洗2次， 去上清， 1PBS重悬细胞， 转管， 上机检测。 Winmidi 2.9 分析Th1亚群 （CD4+ IFN-+） 、 Th2亚群 （CD4+IL-4+） 、 Th17亚 群 （CD4+IL-17A+） 及 Treg（CD4+C。
13、D25+Foxp3+） 比例， 计算 Th1/Th2 比值及 Th17/Treg 比值。 0013 (3) Western blot 法检测子宫组织 T 细胞亚群分化特异性核转录因子蛋白表达 ： 分离子宫组织， 剪至 1mm1mm 大小， 200 目铜网研磨过滤， 1PBS 冲洗， Ficoll 密度梯度离 心法分离子宫组织单个核细胞， 调整子宫组织单个核细胞浓度为1106个/mL， 加入蛋白裂 解液100微升， 冰浴混匀， 冰浴静置30分钟， 412000rpmmin， 离心30min， 取上清， 10 SDS-PAGE 电泳并转膜， 封闭、 加入兔抗小鼠 T-bet、 GATA3、 ROR。
14、t、 Foxp3 抗体 ( 按说明书操 说 明 书 CN 102961370 A 4 3/5 页 5 作 )， 4孵育过夜 ； 洗涤后加入山羊抗兔辣根过氧化酶标记二抗， 37孵育 1.5h ； 充分洗涤 后与增强化学发光试剂反应， 增强化学发光法曝光显色 （LAS-4000mini 化学发光图像分析 仪） ， 以 GAPDH 为内参照， 计算目的蛋白与同步 GAPDH 灰度值比值作为相对表达量。 0014 统计学分析 采用方差分析， 计量资料以s 表示， 采用 One Way-ANOVA 方差分析， 组间比较采用 Student-Newman-Keuls 法检验，P 0.05 为差异有统计学意。
15、义。 0015 结果 （1） 阿魏酸有效减少药流小鼠子宫出血量 表 1 各组药流后小鼠子宫出血量对照表 组别子宫出血量 （毫升） 米非司酮组30.56.2 米非司酮 + 阿魏酸小剂量组27.44.7* 米非司酮 + 阿魏酸中剂量组25.24.9* 米非司酮 + 阿魏酸大剂量组21.34.4* 注 ： 与米非司酮组比较， *P 0.05 ； 与米非司酮 +阿魏酸小剂量组比较，P 0.05 ； 与 米非司酮 + 阿魏酸中剂量组比较， P 0.05。 0016 与单纯应用米非司酮组比较， 米非司酮 + 阿魏酸组小鼠子宫出血量均明显减少 （P 0.05） ， 且阿魏酸减轻流产小鼠子宫出血量的作用呈药物。
16、剂量依赖性 （P 0.05） ， 提示本发 明中药单体阿魏酸能有效减少药物流产子宫出血量。 0017 （2） 阿魏酸诱导药流小鼠母胎界面 Th1/Th2 平衡向 Th1 亚群偏移 表 2 小鼠母胎界面 Th1、 Th2 亚群比例及 Th1/Th2 比值 注 ： 与米非司酮组比较， *P 0.05 ； 与米非司酮 +阿魏酸小剂量组比较，P 0.05 ； 与 米非司酮 + 阿魏酸中剂量组比较， P 0.05。 0018 流式细胞术检测显示， 与米非司酮单独作用比较， 米非司酮联合阿魏酸作用后， 小 鼠母胎界面 Th1、 Th2 亚群比例均升高， 其中 Th1 亚群比例升高更明显， Th1/Th2 。
17、比值显著 升高 （P 0.05） ， 提示阿魏酸能优势诱导药流小鼠母胎界面 Th1/Th2 平衡向 Th1 漂移， 进而 减轻药流小鼠子宫出血量， 其作用呈剂量依赖性。 0019 （3） 阿魏酸诱导药流小鼠母胎界面 Th17/Treg 平衡向 Th17 亚群偏移。 0020 表 3 小鼠母胎界面 Th17、 Treg 亚群比例及 Th17/Treg 比值 说 明 书 CN 102961370 A 5 4/5 页 6 注 ： 与米非司酮组比较， *P 0.05 ； 与米非司酮 +阿魏酸小剂量组比较，P 0.05 ； 与 米非司酮 + 阿魏酸中剂量组比较， P 0.05。 0021 流式细胞术检测。
18、显示， 与米非司酮单独作用比较， 米非司酮联合阿魏酸作用后， 小 鼠母胎界面 Th17、 Treg 亚群比例均升高， 其中 Th17 亚群比例升高更明显， Th17/Treg 比值 显著升高 （P 0.05） ， 提示阿魏酸能优势诱导药流小鼠母胎界面 Th17/Treg 平衡向 Th17 漂 移， 进而减轻药流小鼠子宫出血量， 其作用呈剂量依赖性。 0022 表 4 小鼠母胎界面 T 细胞亚群分化特异性核转录因子蛋白表达 注 ： 与米非司酮组比较， *P 0.05 ； 与米非司酮 +阿魏酸小剂量组比较，P 0.05 ； 与 米非司酮 + 阿魏酸中剂量组比较， P 0.05。 0023 West。
19、ern blot 检测显示与米非司酮单独作用比较， 米非司酮联合阿魏酸作用后， 小鼠母胎界面， Th1亚群特异性核转录因子T-bet、 Th17亚群特异性核转录因子RORt蛋白 表达明显升高 （P 0.05） ， Th2 亚群特异性核转录因子 GATA-3、 Treg 亚群特异性核转录因子 Foxp3蛋白表达明显升高 （P 0.05） ， 提示阿魏酸能优势诱导米非司酮药流小鼠母胎界面且 其调节作用呈剂量依赖性。 0024 综上所述， 阿魏酸能优势诱导米非司酮药流小鼠母胎界面 Th1、 Th17 亚群特异性 核转录因子蛋白表达啊， 降低 Th2、 Treg 亚群特异性核转录因子蛋白表达， 进而诱导 T 细胞 向 Th1、 Th17 亚群偏移， 促进母胎免疫排斥， 从而减轻药流小鼠子宫出血量。 具体实施方式 0025 下面对本发明作进一步的说明。 0026 取市售阿魏酸纯品130 g， 加入淀粉115g， 5g滑石粉， 压片， 使成1000片， 其中素片 均重 0.25g/ 片。 0027 本发明还可以加入药学上适宜的辅料， 制备成口服液， 注射液， 胶囊剂、 颗粒剂、 滴 说 明 书 CN 102961370 A 6 5/5 页 7 丸， 缓控释制剂等其他药物剂型。 说 明 书 CN 102961370 A 7 。